本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種兜蘭農(nóng)桿菌子房注射法轉(zhuǎn)基因方法。

背景技術(shù)：
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兜蘭(Paphiopedilum)由于其獨(dú)特的花朵造型、絢麗的花朵色彩、持久的觀賞花期而具有極高的觀賞價(jià)值，是國(guó)際花卉市場(chǎng)上十分流行的高檔花卉。但由于人們對(duì)兜蘭的過(guò)度采挖和生境的破壞，兜蘭已成為世界上最瀕危的植物物種之一，所有野生種類均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄I而被禁止貿(mào)易。通過(guò)各種育種方法能選育出在國(guó)際市場(chǎng)上自由交易、觀賞價(jià)值高的蘭花新品種來(lái)滿足市場(chǎng)需要。蘭科植物的轉(zhuǎn)基因的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法等，主要種類包括石斛蘭、蝴蝶蘭、文心蘭和蘭屬植物等，但農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法等均需建立在有效的再生體系的基礎(chǔ)上。然而，兜蘭屬植物的再生體系難以建立，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有兜蘭農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法轉(zhuǎn)基因方法的報(bào)道，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和花粉管通道法相結(jié)合的農(nóng)桿菌子房注射法能有效地解決這個(gè)問(wèn)題。

蘭科植物種子數(shù)量巨大，一般一個(gè)果莢中種子量在數(shù)萬(wàn)至數(shù)十萬(wàn)個(gè)以上，應(yīng)用農(nóng)桿菌子房注射法進(jìn)行活體遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，即使轉(zhuǎn)化效率較低，也能獲得較多的轉(zhuǎn)化植株。但蘭科植物從授粉到受精過(guò)程一般需要幾十天，而在受精前的短暫時(shí)期，由于生殖細(xì)胞或者受精卵沒(méi)有細(xì)胞壁或者細(xì)胞壁比較薄弱，處于較為敏感的感受態(tài)，較容易被轉(zhuǎn)化，因此選擇合適的注射時(shí)間是農(nóng)桿菌子房注射法轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種兜蘭農(nóng)桿菌子房注射法轉(zhuǎn)基因方法。

本發(fā)明的兜蘭農(nóng)桿菌子房注射法轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)農(nóng)桿菌注射液制備：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的含有攜帶目的基因的植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種到含有150～250mg/L乙酰丁香酮的AAM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到農(nóng)桿菌注射液；所述的植物表達(dá)載體攜帶有抗性基因；

2)農(nóng)桿菌子房注射：對(duì)兜蘭進(jìn)行人工授粉，選擇授粉后30～53天的子房進(jìn)行表面消毒，然后沿子房縱向垂直將農(nóng)桿菌注射液注射到子房?jī)?nèi)部，注射量為15～25μL，注射后對(duì)注射部位進(jìn)行密封；

3)抗性植株篩選和檢測(cè)：摘取授粉后150～180天的注射有農(nóng)桿菌注射液的蒴果進(jìn)行無(wú)菌播種，將蒴果進(jìn)行消毒處理，無(wú)菌條件下剖開蒴果，取出種子并進(jìn)行消毒，然后將種子懸浮于無(wú)菌水中制成種子懸浮液播種到改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度26～30℃，光照時(shí)間14～18h/d，光照強(qiáng)度1600～2000lx，種子萌發(fā)形成原球莖，將原球莖轉(zhuǎn)接至含有與植物表達(dá)載體攜帶的抗性基因相對(duì)應(yīng)的抗生素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)篩選，培養(yǎng)溫度26～30℃，光照時(shí)間14～18h/d，光照強(qiáng)度1600～2000lx，獲得抗性原球莖，將抗性原球莖轉(zhuǎn)接到改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度26～30℃，光照時(shí)間14～18h/d，光照強(qiáng)度1600～2000lx，培養(yǎng)至形成小苗，經(jīng)分子檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因兜蘭植株；

所述的改良H26號(hào)培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有花寶1號(hào)1～2g、蔗糖10～20g、蛋白胨1～3g、瓊脂5～6g、活性炭1～2g、維生素B₁ 10mg、維生素B₆ 1mg、煙酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、萘乙酸0.5～1mg和椰子汁50～100mL，余量為水。

所述的抗性基因優(yōu)選為潮霉素抗性基因。

所述的植物表達(dá)載體優(yōu)選為質(zhì)粒pCAMBIA1301。

所述的兜蘭優(yōu)選為摩帝兜蘭。

所述的目的基因優(yōu)選為建蘭CeFT基因。

所述的將蒴果進(jìn)行消毒處理具體為將蒴果用體積分?jǐn)?shù)75％的酒精浸泡1～2分鐘，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％～0.2％的升汞溶液浸泡消毒10～20min，無(wú)菌水沖洗3～5次。

所述的農(nóng)桿菌優(yōu)選為根癌農(nóng)桿菌EHA105。

所述的將原球莖轉(zhuǎn)接至含有與植物表達(dá)載體攜帶的抗性基因相對(duì)應(yīng)的抗生素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)篩選，培養(yǎng)溫度26～30℃，光照時(shí)間14～18h/d，光照強(qiáng)度1600～2000lx，獲得抗性原球莖具體為：將原球莖轉(zhuǎn)接至含25～40mg/L潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度26～30℃，光照時(shí)間14～18h/d，光照強(qiáng)度1600～2000lx，培養(yǎng)45～60d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度26～30℃，光照時(shí)間14～18h/d，光照強(qiáng)度1600～2000lx，培養(yǎng)45～60d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度28℃，光照時(shí)間14～18h/d，光照強(qiáng)度1600～2000lx，培養(yǎng)45～60d后將存活的原球莖轉(zhuǎn)接至含25～40mg/L潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度26～30℃，光照時(shí)間14～18h/d，光照強(qiáng)度1600～2000lx，培養(yǎng)45～60d天后獲得抗性原球莖。

本發(fā)明采用的摩帝兜蘭(Paphiopedilum Maudiae)是流行的觀賞品種，但從種植到開花的時(shí)間長(zhǎng)，希望通過(guò)轉(zhuǎn)入建蘭開花整合基因(CeFT)提早開花。

本發(fā)明的兜蘭農(nóng)桿菌子房注射法轉(zhuǎn)基因方法具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果率和轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)，有利于兜蘭的分子育種及加速兜蘭的育種進(jìn)程。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

1.農(nóng)桿菌注射液制備

表達(dá)載體：將建蘭開花整合基因(CeFT)(GenBank登錄號(hào)：HM803115)插入到質(zhì)粒pCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)制備得到重組質(zhì)粒pcubi1301，質(zhì)粒pCAMBIA1301上攜帶有β-葡萄糖酸甘酶基因(Gus A)、潮霉素抗性基因(Hpt)和卡那霉素抗性基因(kan)，然后將重組質(zhì)粒pcubi1301轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，得到含有重組質(zhì)粒pcubi1301的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。

菌種活化：將置于-80℃冰箱的含有重組質(zhì)粒pcubi1301的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌種取出，用接種環(huán)從菌種保存液中挑取一環(huán)，在LB固體培養(yǎng)基上(含卡那霉素50mg/L)平板上劃線，用封口膜封口后將平皿放在培養(yǎng)箱中，28℃，倒置，黑暗條件下培養(yǎng)2d即可看到分離的單菌落。

農(nóng)桿菌注射液制備：經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后，從平板上保存的含有重組質(zhì)粒pcubi1301的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中挑取單菌落，接種到含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上，28℃，120rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至OD₆₀₀值為0.6，取1mL菌液于4℃，4000rpm離心10min，棄上清，收集菌體。將菌體重懸于10mL含有150mg/L乙酰丁香酮(AS)的AAM培養(yǎng)基中，28℃，120rpm振蕩培養(yǎng)1.5小時(shí)，即得農(nóng)桿菌注射液。

LB和AAM培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，其配方參考J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

2.農(nóng)桿菌子房注射

在溫室中對(duì)摩帝兜蘭進(jìn)行人工授粉，在完成授粉后的30天進(jìn)行子房注射，每個(gè)子房的注射量為15μL。注射時(shí)，先用酒精棉(70％酒精)擦拭子房表面以去除附著在子房表面的雜物，再用已滅菌的微量注射器緩慢吸取農(nóng)桿菌注射液沿子房縱向垂直注射入發(fā)育良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的子房?jī)?nèi)部后，抽出針管用酒精棉擦拭注射處并用已消毒的紙膠布封住注射處，結(jié)果率75％。在授粉后180天摘取果實(shí)進(jìn)行無(wú)菌播種。

3.抗性植株篩選

摘取授粉后180天的注射有農(nóng)桿菌注射液的蒴果進(jìn)行無(wú)菌播種。播種時(shí)，先將蒴果放在自來(lái)水下沖洗以去除粘附在蒴果表皮上的雜物，然后用體積分?jǐn)?shù)75％酒精浸泡蒴果1分鐘，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的升汞溶液浸泡消毒10min后取出蒴果，無(wú)菌水沖洗3次后，吸干蒴果表面水分，在無(wú)菌操作臺(tái)上用消毒后的手術(shù)刀沿著蒴果中縫線縱向剖開，取出種子并將其放入滅菌的三角瓶中，加入現(xiàn)配的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％的次氯酸鈉(NaClO)溶液浸泡消毒40min，無(wú)菌水沖洗過(guò)濾3次后，將種子置于無(wú)菌水中制成懸浮液播種到改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度26℃，光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度1600lx，種子萌發(fā)形成原球莖，將原球莖轉(zhuǎn)接至含25mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每瓶接種50個(gè)，培養(yǎng)溫度26℃，光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度1600lx，培養(yǎng)45d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接到含30mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度26℃，光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度1600lx，培養(yǎng)45d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接到含30mg/L潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度26℃，光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度1600lx，培養(yǎng)45d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接到含25mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度26℃，光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度1600lx，培養(yǎng)45d篩選獲得潮霉素抗性原球莖，經(jīng)過(guò)4輪篩選出的潮霉素抗性原球莖再轉(zhuǎn)入無(wú)潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度26℃，光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度1600lx，培養(yǎng)90d天后形成小苗。按如下公式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率＝(小苗個(gè)數(shù)/用于篩選的原球莖個(gè)數(shù))×100％。轉(zhuǎn)化率為0.45％。

改良H26號(hào)培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有花寶1號(hào)(Hyponex I)1.0g、蔗糖(sugar)10g、蛋白胨(peptone)1.0g、瓊脂(agar)5.0g、活性炭(AC)1.0g、維生素B₁ 10mg、維生素B₆1mg、煙酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、萘乙酸(NAA)0.5mg和椰子汁50mL，余量為水。

改良H26號(hào)培養(yǎng)基的配制方法是將1.0g花寶1號(hào)、10g蔗糖、1.0g蛋白胨、5.0g瓊脂、1.0g活性炭、10mg維生素B₁、1mg維生素B₆、1mg煙酸、2mg甘氨酸、0.1mg肌醇、0.5mg萘乙酸和50mL椰子汁，加到少量水中，然后用水補(bǔ)齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

4.抗性植株檢測(cè)

對(duì)獲得的小苗進(jìn)行GUS染色、PCR檢測(cè)和Southern blot檢測(cè)。GUS染色均呈藍(lán)色，PCR檢測(cè)和Southern blot檢測(cè)同時(shí)存在Gus A基因和CeFT基因，確定獲得的小苗即為轉(zhuǎn)基因兜蘭植株。

實(shí)施例2：

1.農(nóng)桿菌注射液制備

表達(dá)載體：將建蘭開花整合基因(CeFT)(GenBank登錄號(hào)：HM803115)插入到質(zhì)粒pCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)制備得到重組質(zhì)粒pcubi1301，質(zhì)粒pCAMBIA1301上攜帶有β-葡萄糖酸甘酶基因(Gus A)、潮霉素抗性基因(Hpt)和卡那霉素抗性基因(kan)，然后將重組質(zhì)粒pcubi1301轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，得到含有重組質(zhì)粒pcubi1301的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。

菌種活化：將置于-80℃冰箱的含有重組質(zhì)粒pcubi1301的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌種取出，用接種環(huán)從菌種保存液中挑取一環(huán)，在LB固體培養(yǎng)基上(含卡那霉素50mg/L)平板上劃線，用封口膜封口后將平皿放在培養(yǎng)箱中，28℃，倒置，黑暗條件下培養(yǎng)2d即可看到分離的單菌落。

農(nóng)桿菌注射液制備：經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后，從平板上保存的含有重組質(zhì)粒pcubi1301的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中挑取單菌落，接種到含有50mg/L卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上，28℃，120rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至OD₆₀₀值為0.6，取1mL菌液于4℃，4000rpm離心10min，棄上清，收集菌體。將菌體重懸于10mL含有200mg/L乙酰丁香酮(AS)的AAM培養(yǎng)基中，28℃，120rpm振蕩培養(yǎng)1.5小時(shí)，即得農(nóng)桿菌注射液。

LB和AAM培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，其配方參考J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

2.農(nóng)桿菌子房注射

在溫室中對(duì)摩帝兜蘭進(jìn)行人工授粉，在完成授粉后的43天進(jìn)行子房注射，每個(gè)子房的注射量為20μL。注射時(shí)，先用酒精棉(75％酒精)擦拭子房表面以去除附著在子房表面的雜物，再用已滅菌的微量注射器緩慢吸取農(nóng)桿菌注射液沿子房縱向垂直注射入發(fā)育良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的子房?jī)?nèi)部后，抽出針管用酒精棉擦拭注射處并用已消毒的紙膠布封住注射處，結(jié)果率80％。在授粉后170天摘取果實(shí)進(jìn)行無(wú)菌播種。

3.抗性植株篩選

摘取授粉后170天的注射有農(nóng)桿菌注射液的蒴果進(jìn)行無(wú)菌播種。播種時(shí)，先將蒴果放在自來(lái)水下沖洗以去除粘附在蒴果表皮上的雜物，然后用體積分?jǐn)?shù)75％酒精浸泡蒴果1.5分鐘，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15％的升汞溶液浸泡消毒15min后取出蒴果，無(wú)菌水沖洗4次后，吸干蒴果表面水分，在無(wú)菌操作臺(tái)上用消毒后的手術(shù)刀沿著蒴果中縫線縱向剖開，取出種子并將其放入滅菌的三角瓶中，加入現(xiàn)配的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0％的次氯酸鈉(NaClO)溶液浸泡消毒30min，無(wú)菌水沖洗過(guò)濾4次后，將種子置于無(wú)菌水中制成懸浮液播種到改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度28℃，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度1800lx，種子萌發(fā)形成原球莖，將原球莖轉(zhuǎn)接至含30mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每瓶接種50個(gè)，培養(yǎng)溫度28℃，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度1800lx，培養(yǎng)50d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接到含40mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度28℃，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度1800lx，培養(yǎng)50d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接到含40mg/L潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度1800lx，培養(yǎng)50d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接到含30mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度1800lx，培養(yǎng)50d篩選獲得潮霉素抗性原球莖，經(jīng)過(guò)4輪篩選出的潮霉素抗性原球莖再轉(zhuǎn)入無(wú)潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度28℃，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度1800lx，培養(yǎng)75d天后形成小苗。按如下公式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率＝(小苗個(gè)數(shù)/用于篩選的原球莖個(gè)數(shù))×100％。轉(zhuǎn)化率為2.16％。

改良H26號(hào)培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有花寶1號(hào)(Hyponex I)1.5g、蔗糖(sugar)15g、蛋白胨(peptone)2g、瓊脂(agar)5.5g、活性炭(AC)1.5g、維生素B₁ 10mg、維生素B₆1mg、煙酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、萘乙酸(NAA)0.75mg和椰子汁75mL，余量為水。

改良H26號(hào)培養(yǎng)基的配制方法是將1.5g花寶1號(hào)、15g蔗糖、2g蛋白胨、5.5g瓊脂、1.5g活性炭、10mg維生素B₁、1mg維生素B₆、1mg煙酸、2mg甘氨酸、0.1mg肌醇、0.75mg萘乙酸和75mL椰子汁，加到少量水中，然后用水補(bǔ)齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

4.抗性植株檢測(cè)

對(duì)獲得的小苗進(jìn)行GUS染色、PCR檢測(cè)和Southern blot檢測(cè)。GUS染色均呈藍(lán)色，PCR檢測(cè)和Southern blot檢測(cè)同時(shí)存在Gus A基因和CeFT基因，確定獲得的小苗即為轉(zhuǎn)基因兜蘭植株。

實(shí)施例3：

1.農(nóng)桿菌注射液制備

表達(dá)載體：將建蘭開花整合基因(CeFT)(GenBank登錄號(hào)：HM803115)插入到質(zhì)粒pCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)制備得到重組質(zhì)粒pcubi1301，質(zhì)粒pCAMBIA1301上攜帶有β-葡萄糖酸甘酶基因(Gus A基因)、潮霉素抗性基因(Hpt基因)和卡那霉素抗性基因(kan)，然后將重組質(zhì)粒pcubi1301轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，得到含有重組質(zhì)粒pcubi1301的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。

菌種活化：將置于-80℃冰箱的含有重組質(zhì)粒pcubi1301的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌種取出，用接種環(huán)從菌種保存液中挑取一環(huán)，在LB固體培養(yǎng)基上(含卡那霉素50mg/L)平板上劃線，用封口膜封口后將平皿放在培養(yǎng)箱中，30℃，倒置，黑暗條件下培養(yǎng)2d即可看到分離的單菌落。

農(nóng)桿菌注射液制備：經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后，從平板上保存的含有重組質(zhì)粒pcubi1301的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中挑取單菌落，接種到含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上，30℃，120rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至OD₆₀₀值為0.8，取1mL菌液于4℃，4000rpm離心10min，棄上清，收集菌體。將菌體重懸于10mL含有250mg/L乙酰丁香酮(AS)的AAM培養(yǎng)基中，28℃，120rpm振蕩培養(yǎng)2.0小時(shí)，即得農(nóng)桿菌注射液。

LB和AAM培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，其配方參考J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

2.農(nóng)桿菌子房注射

在溫室中對(duì)摩帝兜蘭進(jìn)行人工授粉，在完成授粉后的53天進(jìn)行子房注射，每個(gè)子房的注射量為25μL。注射時(shí)，先用酒精棉(80％酒精)擦拭子房表面以去除附著在子房表面的雜物，再用已滅菌的微量注射器緩慢吸取農(nóng)桿菌注射液沿子房縱向垂直注射入發(fā)育良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的子房?jī)?nèi)部后，抽出針管用酒精棉擦拭注射處并用已消毒的紙膠布封住注射處，結(jié)果率85％。在授粉后150天摘取果實(shí)進(jìn)行無(wú)菌播種。

3.抗性植株篩選

摘取授粉后150天的注射有農(nóng)桿菌注射液的蒴果進(jìn)行無(wú)菌播種。播種時(shí)，先將蒴果放在自來(lái)水下沖洗以去除粘附在蒴果表皮上的雜物，然后用體積分?jǐn)?shù)75％酒精浸泡蒴果2分鐘，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2％的升汞溶液浸泡消毒20min后取出蒴果，無(wú)菌水沖洗5次后，吸干蒴果表面水分，在無(wú)菌操作臺(tái)上用消毒后的手術(shù)刀沿著蒴果中縫線縱向剖開，取出種子并將其放入滅菌的三角瓶中，加入現(xiàn)配的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0％的次氯酸鈉(NaClO)溶液浸泡消毒20min，無(wú)菌水沖洗過(guò)濾5次后，將種子置于無(wú)菌水中制成懸浮液播種到改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度30℃，光照時(shí)間18h/d，光照強(qiáng)度2000lx，種子萌發(fā)形成原球莖，將原球莖轉(zhuǎn)接至含40mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每瓶接種50個(gè)，培養(yǎng)溫度30℃，光照時(shí)間18h/d，光照強(qiáng)度2000lx，培養(yǎng)60d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接到含50mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度30℃，光照時(shí)間18h/d，光照強(qiáng)度2000lx，培養(yǎng)60d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接到含50mg/L潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，光照時(shí)間18h/d，光照強(qiáng)度2000lx，培養(yǎng)60d時(shí)將存活的原球莖轉(zhuǎn)接到含40mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，光照時(shí)間18h/d，光照強(qiáng)度2000lx，培養(yǎng)60d篩選獲得潮霉素抗性原球莖，經(jīng)過(guò)4輪篩選出的潮霉素抗性原球莖再轉(zhuǎn)入無(wú)潮霉素的改良H26號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度30℃，光照時(shí)間18h/d，光照強(qiáng)度2000lx，培養(yǎng)60d天后形成小苗。按如下公式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率＝(小苗個(gè)數(shù)/用于篩選的原球莖個(gè)數(shù))×100％。轉(zhuǎn)化率為2.48％。

改良H26號(hào)培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有花寶1號(hào)(Hyponex I)2g、蔗糖(sugar)20g、蛋白胨(peptone)3g、瓊脂(agar)6g、活性炭(AC)2g、維生素B₁ 10mg、維生素B₆ 1mg、煙酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、萘乙酸(NAA)1mg和椰子汁100mL，余量為水。

改良H26號(hào)培養(yǎng)基的配制方法是將1g花寶2號(hào)、20g蔗糖、3g蛋白胨、6g瓊脂、2g活性炭、10mg維生素B₁、1mg維生素B₆、1mg煙酸、2mg甘氨酸、0.1mg肌醇、1mg萘乙酸和100mL椰子汁，加到少量水中，然后用水補(bǔ)齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

4.抗性植株檢測(cè)

對(duì)獲得的小苗進(jìn)行GUS染色、PCR檢測(cè)和Southern blot檢測(cè)。GUS染色均呈藍(lán)色，PCR檢測(cè)和Southern blot檢測(cè)同時(shí)存在Gus A基因和CeFT基因，確定獲得的小苗即為轉(zhuǎn)基因兜蘭植株。