本發(fā)明涉及一種藥物組生物及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及一種以氨基酸作為連接臂的聚乙二醇齊墩果酸衍生物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近來有文獻(xiàn)報道聚乙二醇（PEG）修飾的方法可以用于中藥難溶性有效成分前藥的合成。PEG作為一種無毒、生物相容性好、無感染和非抗原性的藥物載體，常結(jié)合水不溶或水溶性低的分子發(fā)揮其增溶的作用。氨基酸具有良好的生物相容性和親和性，且廉價易得，在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用，部分抗腫瘤藥物經(jīng)氨基酸修飾后增加了對腫瘤細(xì)胞的靶向性，抗腫瘤活性有明顯提高，對機(jī)體正常細(xì)胞的毒性作用也有所降低。

齊墩果酸（Oleanolic Acid，OA，F(xiàn)ig1）作為五環(huán)三萜類化合物的典型代表，具有顯著的抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等藥理活性。但齊墩果酸的水溶性非常差，限制了其臨床應(yīng)用。為增加其溶解性及生物利用度，將PEG修飾的方法引進(jìn)齊墩果酸前藥的合成中，使用了一系列不同相對分子質(zhì)量的PEG通過不同氨基酸作為連接臂合成了齊墩果酸衍生物。通過對齊墩果酸的結(jié)構(gòu)改造，提高水溶性和延長體內(nèi)半衰期，提高其生物活性，有望開發(fā)具有良好應(yīng)用前景的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種，。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種以氨基酸作為連接臂的聚乙二醇齊墩果酸衍生物，其結(jié)構(gòu)通式為：

其中，X=Y=-CH₂或X=H，Y=0，R表示-H，-CH₃，-CH(CH₃)₂，-CH₂CH(CH₃)₂，-CHCH₃(CH₂CH₃)，-CH₂C₆H₅，-(CH₂)₂-S-CH₃；mPEG選用mPEG₁₀₀₀，mPEG₂₀₀₀，mPEG₅₀₀₀，mPEG₆₀₀₀，mPEG₈₀₀₀，mPEG₁₀₀₀₀，mPEG₂₀₀₀₀。

一種以氨基酸作為連接臂的聚乙二醇齊墩果酸衍生物制備方法，所述衍生物由以下步驟制備：

（1）將mPEG溶于無水丙酮中，室溫攪拌下滴加三乙胺，將溶于無水丙酮中的對甲苯磺酰氯，滴加至上述溶液中，0-40℃下攪拌反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，抽濾除去三乙胺鹽酸鹽沉淀；濾液濃縮后逐滴加入至冷卻無水乙醚中，析出固體，無水乙醇重結(jié)晶，得白色固體mPEG-OTs；

（2）將mPEG-OTs溶解于DMF中，加入氨基酸的鈉鹽或鉀鹽，于40-90℃下攪拌反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去不溶物，攪拌下將濾液逐滴加入至冷卻無水乙醚中，過濾收集沉淀，乙醚清洗，真空干燥。將固體溶于蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH 至3，CH₂Cl₂萃取3次，合并萃取液，水洗，無水Na₂SO₄干燥過夜，過濾后溶液減壓蒸至原體積的十分之一，滴加到冷卻無水乙醚中，得白色沉淀，真空干燥，得白色固體mPEG-氨基酸衍生物；

（3）將mPEG-氨基酸和齊墩果酸溶于干燥的二氯甲烷中，冰水浴中攪拌，加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）和N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），室溫反應(yīng)；反應(yīng)完畢后過濾，水洗有機(jī)相，無水Na₂SO₄干燥，過濾，濃縮并用無水乙醚沉淀，抽濾，真空干燥，得到目標(biāo)化合物。

以氨基酸作為連接臂的聚乙二醇齊墩果酸衍生物的應(yīng)用，所述齊墩果酸衍生物的藥物組合物具有抗腫瘤活性，用于治療腫瘤疾病。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果是：

本發(fā)明提供的mPEG-AA-OA復(fù)合物的水溶性與原藥齊墩果酸對比，至少提高了1000倍，可見PEG化具有明顯的增溶效果。

本發(fā)明提供的mPEG-AA-OA復(fù)合物通過體外抑制超氧陰離子和1,1-二苯基-2-間三硝基苯肼（DPPH）的活性測試。結(jié)果表明，此類化合物具有良好的抗氧化活性。

本發(fā)明提供的mPEG-AA-OA復(fù)合物采用MTT法進(jìn)行初步的體外抗腫瘤活性測試。研究結(jié)果表明，所合成的部分化合物對多種腫瘤細(xì)胞株具有明顯的抑制作用，結(jié)果優(yōu)于齊墩果酸。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：mPEG₅₀₀₀-OTs的制備

將5. 0 g mPEG₅₀₀₀溶于50mL無水丙酮中，室溫攪拌下滴加三乙胺2mL( 14. 4mmol) ，將溶于5 mL無水丙酮中的對甲苯磺酰氯2g ( 6. 4mmol)滴加至上述溶液中，室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后過濾除去三乙胺鹽酸鹽沉淀。將濾液濃縮至原溶液的十分之一后逐滴加入至冷卻無水乙醚200 mL中，析出固體，過濾收集沉淀，真空干燥，無水乙醇重結(jié)晶，得白色固體mPEG₅₀₀₀-OTs ( 4. 24 g，85%) 。

同法可制得其他分子量mPEG₅₀₀₀-OTs化合物。

實(shí)施例2：mPEG₅₀₀₀-Pro的制備

取mPEG₅₀₀₀-OTs 2. 0 g 溶解于DMF 20 mL 中，加入脯氨酸的鉀鹽0. 38 g（2mmol），回流反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后過濾除去不溶物，攪拌下將濾液逐滴加入至冷卻無水乙醚200 mL 中，過濾收集沉淀，乙醚清洗3 次，真空干燥，再溶于蒸餾水50 mL 中，5mol /L鹽酸調(diào)pH 至3，CH₂Cl₂萃?。?0mL×3），合并萃取液，水洗，再用無水Na₂SO₄干燥過夜，過濾后溶液減壓蒸至原溶液的十分之一后，滴加到冷卻無水乙醚100 mL 中，得白色沉淀，真空干燥，得白色固體（1. 15 g，58. 0%）；mp:56. 5～60. 5℃；IR（KBr，ν）: 3450，2890，1734，1465，1285，1118，850cm^-1。

同法可制得不同的mPEG-氨基酸復(fù)合物。

實(shí)施例3：mPEG₅₀₀₀-Pro-OA的制備

將mPEG₅₀₀₀-Pro 0. 4 g和齊墩果酸0. 053 g（0. 117 mmol）溶于干燥的二氯甲烷20 mL中，冰水浴中攪拌，加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）20 mg 和N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）30 mg，室溫反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢后過濾，水洗有機(jī)相兩次，無水Na₂SO₄干燥，過濾，濃縮并用無水乙醚沉淀，收集后真空干燥，得到白色固體物mPEG-Pro-OA（0. 38 g，75%）。mp：56. 5～59. 6℃；IR（KBr，ν）:3384，1732，1640，1400，1106 cm^-1。¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 5.39 (1H,t, J = 3.4 Hz, H-12), 4.48 (1H,dd, J = 10.0, 5.9 Hz, H-3), 2.56 (1H,dd, J = 12.8, 3.3 Hz, H-18), 2.05 (3H,s,3-COCH₃), 1.16(3H,s,-CH₃), 0.93(3H,s,-CH₃), 0.91(6H,s,2CH₃), 0.87(3H,s,-CH₃), 0.85(3H,s,-CH₃), 0.78(3H,s,-CH₃), 3. 64(446H,m,-OCH₂CH₂-,mPEG-backbone), 6.95( 1H,d,NH).

同法可制得不同分子量聚乙二醇及多種氨基酸作為連接臂的mPEG-AA-OA化合物。

實(shí)施例4：對本發(fā)明制備的mPEG-AA-OA化合物進(jìn)行溶解度測試。

分別將過量的齊墩果酸，mPEG-AA-OA化合物加入到10mL的水中，將這些混懸液置于25^oC恒溫振蕩器內(nèi)振搖24h，停止振搖后放置2h，達(dá)到平衡后，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液，適當(dāng)稀釋后用高效液相色譜法測定濃度并計算它們在水中的溶解度。齊墩果酸和部分mPEG-AA-OA結(jié)合物的溶解度列于表1中。如表1所示mPEG-AA-OA結(jié)合物可以顯著提高齊墩果酸在水中的溶解度，溶解度隨著mPEG分子量的增大而減少，但均高于齊墩果酸。

實(shí)施例5：對本發(fā)明制備的mPEG-AA-OA化合物分別進(jìn)行了抗腫瘤活性測試。

采用MTT法對齊墩果酸及所合成衍生物進(jìn)行初步的體外抗腫瘤活性測試。部分mPEG-AA-OA衍生物對HepG2細(xì)胞體外細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。研究結(jié)果表明，所合成的部分化合物對HepG2腫瘤細(xì)胞株具有明顯的抑制作用，結(jié)果優(yōu)于齊墩果酸。

表1 mPEG-AA-OA化合物溶解性及HepG2細(xì)胞毒活性

^a化合物濃度在10^-5mol/L時測得的抑制率。