專利名稱：：用于治療乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌的7-乙基-10-羥基喜樹堿的多臂聚...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及7-乙基-10-羥基J4對堿的多臂聚合前藥。特別的，本發(fā)明涉及7-乙基-10-羥基44對堿的四臂聚乙二醇軛^^勿(conjugates)及其用途。
背景技術(shù)：
：近幾年來已經(jīng)提出了一些將生物學(xué)有效原料向哺乳動物給藥的方法。而問題在于所需治療劑不能溶于水性液體中。通常生物堿尤其難以溶解。喜樹石成是產(chǎn)自生長于中國的旱蓮木屬樹(CamptoAecaaccwm/"ato)和印度生長的臭味假^i對(Nothapodytesfoetida)的不溶于水的細月錄素生物堿。喜樹i獻其相關(guān)的類似物是已知的潛在抗癌劑并已被證實具有體內(nèi)和體外治療活性。44啦iA其類似物是已知的DNA拓樸異構(gòu)酶I抑制劑。例如，喜樹堿的一種類似物伊立替康(CPT-11，Camptosar⑧)^是DNA拓4卜異構(gòu)酶I抑制劑并顯示出抗癌活性。7-乙基-10-幾基-!4對堿是CPT-11的活性代謝產(chǎn)物。發(fā)明概述為克月l上述問題并改進通過聚乙二醇(PEG)化的藥物遞送技術(shù)，本發(fā)明提供了直接應(yīng)用多臂PEGs通過合適的連接基于藥物M扼合的新方法。通過該方式，不需再引入繁多的分支部分到PEG上。此外，藥物^H^皮jtl^目對遠離。因此結(jié)合到PEG上的效率大大增加。通過末端分支的方法^IU是高了PEG輒合物的;;容解度。一方面,本發(fā)明提供式(1)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中R,、R2、R3和R4獨立為OH或(L)m-D;L是雙官能連接基；D是喜樹堿或喜樹堿類似物殘基，例如m是0或正整lt,和n是正整數(shù)，^f牛是R,、R2、R3和R4不全為OH。在本發(fā)明的一方面中，喜樹4444#堿類似物與聚^#^這樣其20-OH與四臂聚^^形成扼^4勿。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面中L是M酸歹tt。在本發(fā)明的某些優(yōu)選方面中，n是大約28到大約341，并優(yōu)選大約227。以下描述和附圖顯示出本發(fā)明的優(yōu)點。本發(fā)明中，術(shù)語"歹MJJ，應(yīng)理解為^^物(即指44對堿類似物、7-乙基-10-羥基4M堿、MS交等)在經(jīng)過被另一^/^t勿取^M后剩余的部分。本發(fā)明中，術(shù)語"含聚^4勿的歹1^"或"PEG歹^4"應(yīng)各自理解為聚^4勿或PEG在與含_|^^44喜樹堿類似物的^^^^后剩余的部分。本發(fā)明中，術(shù)語"^&"應(yīng)理解為包括直鏈、支鏈、取代的(例如鹵素-、烷氧基-、賄基-)Cw2但伊述C^汰C"環(huán)^J^取代環(huán)絲等。本發(fā)明中，術(shù)語"取代"應(yīng)理解為包括加入一個或多個原子或?qū)⒃诎诠倌軋F或fl^物中的一個或多個原子中替換為一個或多個不同的原子。本發(fā)明中，取代的;^錄包括^iitt、AJ^錄、二^&絲、羥^&^J^口巰_1^錄；取代的烯基包括#基、llW基、二烯基tt、羥基烯_14^1基；耳又^C的丈;tt包4舌一^S^tt、#J^g、二;fetl^J^羥基丈;fei^^i^^;取代的環(huán)^&包括基團例如4-氯環(huán)己基；芳基包括基團例如萘基；取代的芳基包括基團例如3-溴苯基；芳^^包括基團例如甲苯基；雜烷基包括基團例如乙基漆吩；取代的雜;fe&包括基團例如3-曱氧基p塞吩；烷tt包括基團例如曱M;和苯tt包括基團例如3-硝^氧基。卣素應(yīng)理解為包括氟、氯、碘和溴。本發(fā)明的術(shù)語"有效量"和"充足量"指iii)J本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的所需效果或治療效果的量。圖1圖示說明了制備四臂聚乙二醇酸的0流程。圖2圖示^兌明了制備實施例3-7所述的4臂-PEG-甘氨S菱-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)的a縱。圖3圖示說明了制備實施例8-12所述的4臂-PEG-丙氨S交-(7-乙基-10-羥基44對堿)的^JS淑呈。圖4圖示說明了制備實施例13-16所述的4臂-PEG-蛋氨酸-(7-乙基-10-羥基喜扭城)的^Z淑呈。圖5圖示說明了制備實施例17-21所述的4臂-PEG-月iLtJ臾-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)的雄驗。圖6顯示了實施例26所述的大MX-1乳^^中瘤異種移植小鼠中的單劑量和多劑量效果。圖7顯示了實施例27所述的HT-29結(jié)腸直腸腫瘤異種移植小鼠中的單劑量效果。圖8顯示了實施例28所述的HT-29結(jié)腸直腸腫瘤異種移植小鼠中的多劑量效果。圖9顯示了實施例29所述的MaPaCa-2胰腺胂瘤異種移植小鼠中的單劑量效果。圖10顯示了實施例30所述的MaPaCa-2月勤泉腫瘤異種移植小鼠中的多劑量效果。圖11顯示了實施例31所述的4臂-PEG-甘氨S交-(7-乙基-10-羥基>|4對堿)的體外代謝。圖12顯示了實施例33所述的4臂-￡0-甘氨酉交-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)的穩(wěn)定性。圖13顯示了實施例33所述的pH對4臂-PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)穩(wěn)定性的影響。圖14顯示了實施例34所述的4^#-PEG-"thiJK7-乙基-10-羥基J4對堿)藥代動力學(xué)曲線。發(fā)明詳述在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供式(i)的4給物m是O或正整數(shù)，優(yōu)選大約I到大約IO,更優(yōu)選l;和n是正整數(shù)，優(yōu)選大約28到大約341，更優(yōu)選大約227;^f牛是R,，R2,R3和R4不全為0H。a.喜樹石i^。相關(guān)的喜樹堿類似物喜樹石i^產(chǎn)自生長于中國的旱蓮木屬樹(CampoAecaaccwm/"ato)和印度生長的臭味假^#(7\^/70!/704^^/0"/^)的不溶于水的細月錄素生物堿。4^對石獻相關(guān)化合物和類似物是已知的潛在抗癌劑或抗腫瘤劑且已在實驗室動物的體內(nèi)和其中R,、R2、R3和R4獨立為OH或(L)m-D;L是雙官能連接基；D是喜樹堿或喜樹堿類似物殘基，例如體外顯示出這些活性。喜沖對石斜口一些相關(guān)類似物具有以下結(jié)構(gòu):從該母核結(jié)構(gòu)已經(jīng)制備了若干已知類似物。例如，A環(huán)的10-和11-位的任一個或一^^皮OH取代。A環(huán)還可以被直M支鏈Cwo^&或Cw7烷氧^f又代，任選地通過雜原子(即-O或-S)連接到環(huán)上。B環(huán)可以在7-位上被直《6戈支鏈C，烷J^(優(yōu)選C2烷基)，&8環(huán)烷基、Cwo烷氧基、苯^gi^等、-克基氨基曱酸酯、烷基卡巴肼、苯U并衍生物等取代。C、D和E環(huán)上也可發(fā)生其它耳又^C。如參見美國專利5,004,758;4,943,579;RE32,518，以上內(nèi)容引入作為參考。技術(shù)人員能夠理解的是，10-羥基喜樹堿、11-羥基4M堿和10,ll-二羥基喜樹堿類似物作為孜然齊(C.^cwm/"ato)和其親緣植物的微量成分天然存在。這些化合物的其它取代，即7-烷基喜樹堿、7-取代烷基喜樹堿、7-氨基喜樹堿、7-氨基烷基喜樹堿、7-芳烷基喜樹堿、9-烷基喜樹堿、9-芳烷基喜樹堿等衍生物可以使用已知合成技術(shù)來制備，而不用過多的實驗。一些喜樹堿生物堿具有下示結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(n)在上示結(jié)構(gòu)中，R7是N02，NH2，N3,氫，鹵素(F、Cl、Br、1)，COOH，OH，0-C,—8烷基，SH,S-Cw烷基，CN，CH2NH2，NH-d.3烷基，CHrNH-Cw烷基，N(d.3烷基)2,CH2N(Cw烷基)，0-CH2CH2N(CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2N(CH2CH2OH)2和S-CH2CH2N(CH2CH2OH)2,0-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2和S-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2,0-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2和S-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2，0-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH2)2、NH-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH2)2和S-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH2)2，O-CH^H^NCCw烷基)2、NH-CH2CH2N(Cw烷基)2和S-CH2CH2N(C,.3烷基)2,0-CH2CH2CH2N(d.3烷基)2、NH-CH^EbCHsNCd—3烷基)2和S-CH2CH2CH2N(Cw烷基)2，CHO或Cw烷基之一。結(jié)構(gòu)式(II)中的Rg可以是H或d-8烷基(優(yōu)選C2烷基)或CH2NR9R10,其中(a)R9和R,o各自獨立是氫、Q-6烷基、Cw環(huán)烷基、C3-7環(huán)烷基-Cw坑基、C2-6雄基、經(jīng)基-c"6坑基、c"6坑氧基-c"6坑基;或(b)R9可以是氫、C,—6烷基、Cw環(huán)烷基、C3.7環(huán)烷基-C,-6烷基、C2-6烯基、羥基-C,-6烷基、CL6烷氧基-CL6烷基，和R,o可以是-COR"其中Rn是氫、C,—6烷基、全卣代-CL6烷基、Cw環(huán)烷基、C3.7環(huán)烷基-CL6烷基、C2-6烯基、羥基-Cw烷基、C"6烷氧基、C,.6烷氧基-CL6烷基；或(c)R9和R1Q與氮原子一起形成飽和3-7元包含O、S或NR12的雜環(huán)，其中R,2是氫、C,-6烷基、全鹵代-d-6烷基、芳基、由選自以下一個或多個基團取代的芳基(:,.6烷基、卣素、硝基、氨基、Cw烷基氨基、全卣代-C"烷基、羥基-Cw烷基、Cw烷氧基、C,-6烷氧基-C—6烷基和-COR,3其中R13是氫、C,—6烷基、全卣代-C,-6烷基、d—6烷氧基、芳基、由選自以下一個或多個基團取代的芳基C,-6烷基、全卣代-Cw烷基、羥基-d—6烷基或C,—6烷氧基-C"6坑基;Rno-R川各自獨立選自氫；卣素；?；?；烷基(例如C,.6烷基)；取代烷基；烷氧基(例如C^烷氧基)；取代烷氧基；烯基；炔基；環(huán)烷基；羥基；氰基；硝基；疊氮基；酰胺基；肼基；氨基；取代氨基(例如單烷基氨基和二烷基氨基)；羥基羰基；烷氧基羰基；烷基羰基氧基；烷基羰基氨基；氨基甲?；趸?；芳基磺酰氧基；烷基磺酰氧基；-C(R117)=N-(0)」-R118其中Rn7是H、烷基、烯基、環(huán)烷基或芳基，j是0或l，和Rn8是H、烷基、烯基、環(huán)烷基或雜環(huán)基；和Rn9C(0)0-其中Rn9是卣素、氨基、取代氨基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基；或R，-0-(CH2)k-其中k是1-10的整數(shù)和Rw是烷基、苯基、取代苯基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、雜環(huán)基或取代雜環(huán)基；或R與Rno或Ruo與R川一起形成飽和或非飽和亞甲基二氧基、亞乙基二氧基或亞乙基氧基；和Rn2是H或OR'，其中R'是烷基、烯基、環(huán)烷基、卣代烷基或羥基烷基。優(yōu)選的芳基是苯基和萘基。當119和R,o與氮原子一起形成合適的雜環(huán)時，該雜環(huán)包括氮丙啶、氮雜環(huán)丁烷、吡咯烷、哌啶、六亞曱基亞胺(hexamethyenimine)、咪唑烷、吡。坐烷、異哺峻烷、哌。秦、N-曱基哌嗪、四氫氮雜萆、N-曱基四氬氮雜萆、逸唑烷等。在軛合之后，剩下的喜樹堿類似物指未軛合化合物的殘基。為便于說明而非限制，本文中7-乙基-10-羥基喜樹堿作為喜樹堿類似物的優(yōu)選和示例性的化合物?？梢岳斫獾氖潜景l(fā)明包括所有這些衍生物和類似物，只要具有OH例如20-OH連接到聚合物的類似物。喜樹堿或喜樹堿類似物可以是外消旋混合物或光學(xué)純的異構(gòu)體。優(yōu)選的，基本上純的和活性形式的例如20(S)喜樹堿或喜樹堿類似物應(yīng)用于多臂聚合物前藥。B.雙官能連接基在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，L是氨基酸殘基。所述氨基酸可以選自任柯已知天然存在的L-氨基酸，例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、曱硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸和/或其結(jié)合，僅指出小部分。另一方面，L可以是肽殘基。肽的大小可以變化，例如從大約2到大約IO個氨基酸殘基。天然存在的氨基酸的衍生物和類似物，以及多種本領(lǐng)域已知的非天然存在的氨基酸(D或L)、疏水的或非疏水的，也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。簡單舉例，氨基酸類似物和衍生物包括2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、(3-丙氨酸、(3-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-氨基丁酸、鎖鏈素(desmosine)、2，2-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、3-羥基脯氨酸、4-^:基月乾氛酉臾、異4貞鏈素(isodesmosine)、另'j異亮氛酉臾(allo-isoleucine)、N-甲基甘氨酸或肌氨酸、N-甲基-異亮氨酸、6-N-曱基-賴氨酸、N-曱基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸以及其它不勝枚舉，羅列在63Fed.Reg.,29620,29622，引入作為參考。一些優(yōu)選的L基團包括甘氨酸、丙氨酸、曱硫氨酸或肌氨酸殘基。更優(yōu)選的，本發(fā)明的化合物包含甘氨酸殘基作為連接基(L)。在本發(fā)明的另一方面，連接在喜樹堿類似物和聚合物之間后的L選自-[C(0)]vNR21(CR22R230)t-，-[C(0)]vNR21(CR22R230)t(CR24R25)yO-，-[C(0)]vNR21(CR22R230)t(CR24R25)y-，-[C(。)]vNR21(CR22R23)tO-，-[C(0)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR250)yNR26-,-[C(0)]vO(CR22R23)tNR26-,-[C(0)]vO(CR22R23)tO-,-[C(0)]vNR21(CR22R23)tNR26-,-[C(0)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR250)y-,-[C(0)]vNR21(CR22R230)t(CR24CR25)yNR26-，W-(CR24R25)tNR26-R27、-[C(0)]vO(CR22R23)y-[C(0)]vO(CR22R23)-[C(0)]vNR21(CR22R23)_[C(0)]vNR21(CR22R23)(CR24R25)tO-(CR24R25)tNR26-和(CR24R25)tO-其中R2廣R26獨立選自氫、CL6烷基、<:2.6烯基、C2—6炔基、Cw9支鏈烷基、C3—8環(huán)烷基、Cw取代烷基、C2—6取代烯基、C2—6取代炔基、Cw取代環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、Cw雜烷基、取代的C"雜烷基、C"烷氧基、苯氧基和Cw雜烷氧基；R27選自氫、C,—6烷基、(:2.6烯基、C2—6炔基、C3—19支鏈烷基、C3—8環(huán)烷基、C,—6取代烷基、Cw取代烯基、<:2.6取代炔基、C3-8取代環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、C^雜烷基、取代的d—6雜烷基、Cw烷氧基、苯氧基和d—6雜烷氧基、N02、卣代烷基和鹵素；t和y獨立地選自大約l到大約4的正整數(shù)；和v是0或1。在本發(fā)明的一些優(yōu)選方面，化合物包括一個雙官能連接基單元且因此m是l。其它的連才妻基參見Greenwald等人(說'ow"g"m.cAfoiz'cz'"a/C7^附/Wry,1998,6:551-562)的表1,其內(nèi)容在此引入作為參考。C.多臂聚合物在NOFCorp.DrugDeliverySystemcatalog,Ver.8，April2006中描述了多臂PEG，s,其公開內(nèi)容在此引入作為參考。一個特別優(yōu)選的多臂PEG結(jié)構(gòu)如下其中n是正整數(shù)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，聚合物的聚合度(n)為大約28到大約341以使得聚合物具有大約5，000Da到大約60,000Da的分子量，且優(yōu)選大約114到大約227使得聚合物具有大約20,000Da到大約40,000Da的分子量。聚合度表示聚合物鏈重復(fù)單元的數(shù)目，且其取決于聚合物的分子量。在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案中n是大約227。D.前藥的合成通常，本發(fā)明的前藥通過一或多個當量的活化多臂聚合物與例如一或多個當量的喜樹石成-氨基酸軛合物的每個活性部位反應(yīng)制備，反應(yīng)條件足以有效？I起氨基與聚合物的羧酸反應(yīng)并形成連接。更特別的，本方法可以包括1)提供一當量包含可用的20-羥基的喜樹堿或喜樹堿類似物和一當量或更多的包含可用的羧酸基的雙官能連接基；2)在惰性溶劑例如DCM(或DMF、氯仿、曱苯或其混合物)中在偶聯(lián)劑例如1,(3-二曱基氨基丙基)3-乙基碳二亞胺(EDC),(或1,3-二異丙基碳二亞胺)(DIPC),任何適宜的二烷基碳二亞胺，Mukaiyama試劑(例如2-鹵-1-烷基吡啶^敏卣化物)或丙烷磷酸環(huán)酐(PPACA等)和適宜的堿例如DMAP存在下使兩種反應(yīng)物反應(yīng)形成喜樹堿-雙官能連接基中間體；和3)使一當量或更多所得具有氨基中間體的每個活性位點(例如2當量)與一當量活化的聚合物(如PEG酸)反應(yīng)，所述反應(yīng)在惰性溶劑例如DCM(或DMF、氯仿、曱苯或其混合物)中在偶聯(lián)劑例如1，(3-二曱基氨基丙基)3-乙基碳二亞胺(EDC),PPAC(或1,3-二異丙基碳二亞胺)(DIPC),任何適宜的二烷基碳二亞胺，Mukaiyama試劑(例如2-卣-l-烷基吡啶萄t囟化物)或丙烷磷酸環(huán)酐(PPACA)等和適宜的堿例如DMAP存在下進行，所述試劑可以從SigmaChemical購得或使用已知技術(shù)在0。C到22。C的溫度間合成。在一個優(yōu)選方面，7-乙基-10-羥基喜樹堿的10-羥基在步驟l)之前被保護。用于喜樹堿或喜樹堿類似物的OH基例如7-乙基-10-羥基喜樹堿的10-羥基的芳香保護基是優(yōu)選的，因為其7-乙基-10-羥基喜樹堿中間體具有更好的溶解度并可以有效力和有效地純化為高純度形式。例如，包含硅烷基的保護基例如叔丁基二苯基氯硅烷基(TBDPSC1)、叔丁基二曱基氯硅烷基(TBDMSC1)和三甲基氯硅烷基(TMSC1)可用于保護喜樹堿和喜樹堿類似物的10-羥基?；钚跃酆衔铮窗琹-4末端羧酸基的聚合物可通過例如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)將NOFSunbright類型或其它具有末端OH基的支鏈聚合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸衍生物而制備。參見實施例1-2以及共同轉(zhuǎn)讓的(commonlyassigned)美國專利5，605，976,在此引入作為參考。第一和第二偶聯(lián)劑可以是相同或不同的。優(yōu)選的雙官能連接基的例子包括甘氨酸、丙氨酸、曱硫氨酸、肌氨酸等，其合成見實施例。替換物和具體合成見實施例。例如，本發(fā)明的化合物包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中聚合物的所有四臂都通過甘氨酸與7-乙基-10-羥基喜樹堿通過甘氨酸軛合。根據(jù)本發(fā)明該方面制備的化合物的HPLC分析顯示平均四個7-乙基-10-羥基喜樹堿分子與一個PEG分子軛合(4%以重量計)。E.組合物/制劑包含本發(fā)明聚合物軛合物的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域已知方法制備，例如使用多種已知的混合、溶解、制粒、研磨、乳化、膠嚢化、加入或凍干方法。組合物可與一種或多種包含賦形劑和輔料的生理可接受載體一起制劑，所述載體有助于將活性化合物加工成可用于醫(yī)藥的制劑。適宜的制劑取決于所選的給藥途徑。本發(fā)明的許多方面中優(yōu)選胃腸外途徑。對于注射，非限制性地包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下注射，本發(fā)明化合物可以在水溶液中配制，優(yōu)選在生理相容的緩沖液例如生理鹽水緩沖液或極性溶劑，包括但不限于吡咯烷酮或二曱亞^5風(fēng)中。化合物還可配制為用于胃腸外給藥，例如通過大量推注或連續(xù)輸液。用于注射的制劑可以單位劑型存在，例如在安瓿或多劑量容器中。有用的組合22一個特別優(yōu)選的化合物是物包括但不限于在油性或水性媒介中的懸浮劑、溶液或乳劑，還可包括填充劑例如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于胃腸外給藥的的藥物組合物包括水溶形式的水溶液，例如但非限制的為活性化合物的鹽(優(yōu)選)。另外，活性化合物的懸浮液可以在親脂性媒介中制備。適宜的親脂性媒介包括脂肪油例如芝麻油、合成脂肪酸酯例如油酸乙酯和三酸甘油酯，或材料例如脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧曱基纖維素鈉鹽、山梨糖醇或者右旋糖酐。任選的，懸浮液還可包含適宜的穩(wěn)定劑和/或增加化合物溶解度的試劑以制備高濃度溶液?；蛘撸钚猿煞挚梢允欠勰┬问揭栽谑褂们芭c適宜的媒介，例如無菌、無熱原的水配制。對于口服給藥，化合物可通過將活性物質(zhì)與本領(lǐng)域已知的藥學(xué)可接受的載體組合配制。這些載體能使本發(fā)明化合物配制為片劑、丸劑、錠劑、糖衣丸、膠嚢、液體、凝膠劑、糖漿、糊劑、漿液、溶液、懸浮劑、濃溶液和用于稀釋在患者飲用水中的懸浮劑、用于稀釋在患者食物中的預(yù)混合劑等，用于患者口服攝取。用于口服的藥物制劑可以使用固體賦形劑、可選地研磨所得混合物，和將混合物制粒，隨后如果需要加入其它適宜輔料得到片劑或糖衣芯而制備。特別的，有用的賦形劑是，填充劑如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纖維素制劑例如玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉和馬鈴薯淀粉及其他原料例如明膠、西黃蓍膠、曱基纖維素、羥丙基-曱基纖維素、羧基-曱基纖維素鈉、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，還可加入崩解劑，例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或者海藻酸。還可使用鹽，例如海藻酸鈉鹽。對于吸入給藥，本發(fā)明化合物可以使用加壓包裝或噴霧器和適宜的推進劑，以氣霧劑噴霧形式方便地遞送?；衔镞€可以使用例如常規(guī)栓劑基質(zhì)例如可可脂或其它甘油酯，配制為直腸組合物例如栓劑或灌腸劑。除了前述制劑，化合物還可制劑為長效制品。這樣的長效制劑可以通過植入(例如皮下或肌內(nèi))或肌肉注射給藥。對于這一給藥途徑，本發(fā)明的化合物可以與適宜的聚合的或疏水材料(例如在乳劑中與藥理學(xué)上可接受的油)、與離子交換樹脂配制或作為微溶衍生物如非限制性的微溶鹽。還可使用其它的遞送體系例如脂質(zhì)體和乳劑。另外，化合物可使用持續(xù)釋放(sustained-release)系統(tǒng)，例如包含治療劑的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)。已經(jīng)制備出多種持續(xù)釋放材料，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。持續(xù)釋放的膠嚢可以根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，持續(xù)數(shù)周至超過100天釋放化合物。根據(jù)特定化合物的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性，還可采用其它的穩(wěn)定策略。F.劑量治療有效量指有效預(yù)防、減輕或改善易被喜樹堿或相關(guān)類似物(即7-乙基-10-羥基喜樹堿)影響的病癥的化合物的量。治療有效量的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員所具有的能力，尤其是在本文所公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上。對于本發(fā)明的方法使用的任何化合物，治療有效量可以由體外試驗開始推定。隨后可以配制供動物模型使用的劑量以實現(xiàn)包括有效劑量的循環(huán)濃度范圍。這樣的信息隨后可用于更加精確地確定用于患者的劑量。本文描述的化合物的毒性和治療效力可以使用本領(lǐng)域熟知的方法通過在細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏械臉藴仕帉W(xué)方法來測定。當然劑量也可以根據(jù)劑型和給藥途徑而變化。醫(yī)師根據(jù)患者的情況可選擇具體的制劑、給藥途徑和劑量。然而通常，用于全身遞送的本發(fā)明化合物的優(yōu)選劑量范圍是大約1到大約100mg/kg/周且優(yōu)選大約2到大約60mg/kg/周。組合物可以每天給藥一次或分成多劑量作為多周療程的一部分給藥。精確的劑量將取決于病癥的階段和嚴重性，腫瘤對聚合物-前藥組合物的敏感性，以及被治療的患者的個體特征，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所能夠理解的。G.治療方法基于以上所述，還提供治療哺乳動物的方法，包括向需要的患者給藥有效量的本發(fā)明的式(I)化合物，其中D是生物活性基團，即喜樹堿類似物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，D是7-乙基-10-羥基喜樹堿殘基。本發(fā)明的另一方面提供治療哺乳動物多種醫(yī)學(xué)病癥的方法。組合物用于治療哺乳動物的新生瘤疾病，減少腫瘤負擔，預(yù)防瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤/新生瘤生長的復(fù)發(fā)等。在另一個方面，治療的癌可以是以下一種或多種實體瘤、淋巴瘤、小細胞肺癌、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、卯巢癌、胃癌等。組合物的給藥量，例如作為前藥使用，取決于其中包含的母體分子。通常，用于治療方法的前藥的量是有效實現(xiàn)哺乳動物所需治療作用的量。自然的，多種前藥化合物的量會根據(jù)母體化合物、體內(nèi)水解速率、聚合物分子量等而多少有所變化。通常，給藥喜樹堿的聚合物酯衍生物和相關(guān)組合物的量為大約1到大約100mg/kg/周，且優(yōu)選大約2到大約60mg/kg/周。且上述范圍是說明性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于臨床經(jīng)驗和治療指示能夠確定所選前藥的最佳劑量。在本發(fā)明另一個方面，治療方法包括向有需要的哺乳動物或患者給藥有效量的本發(fā)明所述化合物，所述哺乳動物或患者所患癥狀可以通過拓樸異構(gòu)酶干擾而治療。實施例下面的實施例對本發(fā)明提供進一步的理解而不是以任何方式限制本發(fā)明的有效范圍。實施例中出現(xiàn)下劃線和黑體的數(shù)字對應(yīng)于圖1-5所示。一般方法.所有反應(yīng)在干燥氮氣或氬氣氛中進行。市售試劑直接使用而不進一步純化。所有PEG化合物在使用前真空干燥或從甲苯中共沸蒸餾。除非另有說明，使用VarianMercury300NMR波譜儀和氘化氯仿和曱醇作為溶劑在75.46MHz得到"CNMR光譜。以四曱基硅烷(TMS)為標準在低磁場以百萬分之一(ppm)為單位報道化學(xué)位移(S)。HPLC方法.反應(yīng)混合物和中間體和最終產(chǎn)物的純度通過BeckmanCoulterSystemGold⑧HPLC儀器監(jiān)測。其使用ZOBAX300SBC8反相柱(150x4.6mm)或PhenomenexJupiter300AC18反相柱(150x4.6mm)和多波長UV檢波器，使用含0.05。/。三氟乙酸(TFA)的10-90%梯度乙腈，且流速為lmL/分鐘。實施例140k四臂-PEG-叔丁酯(化合物2):將40k四臂-PEG-OH(12.5g，1當量)與220mL曱苯共沸除去35mL的曱苯/水。溶液冷卻到30。C并加入1.0M溶于叔丁醇(3.75mL，3當量x4-12當量)的叔丁氧化鉀?；旌衔镌?0。C攪拌30分鐘然后加入溴乙酸叔丁酯(0.975g，4當量><4=l'6當量)。在30。C反應(yīng)1小時然后冷卻到25°C。緩慢加入150mL乙醚使產(chǎn)物沉淀。所得懸浮液冷卻到17。C并靜置半小時。過濾粗產(chǎn)物并以乙醚沖洗濕餅兩次(2xl25mL)。分離的濕餅溶于50ml的DCM中，且以350ml乙醚沉淀產(chǎn)物并過濾。以乙醚沖洗濕餅兩次(2xl25mL)。產(chǎn)物在40。C真空干燥(收率98%,12.25g)。13CNMR(75.4MHz,CDC13):527.71，68,48-70.71(PEG),80.94,168.97.實施例240k四臂-PEG酸(化合物3):將四臂-PEG叔丁酉旨(化合物2,12g)溶于120mL的DCM中然后加入60mL的TFA。混合物在室溫下攪拌3小時然后在35。C真空除去溶劑。所得油狀殘留物溶于37.5mL的DCM中。以375mL乙醚沉淀4l產(chǎn)物。濕餅溶于30mL的0.5%NaHC03中。產(chǎn)物以DCM萃取兩次(2xl50mL)。合并的有機層經(jīng)2.5g的MgS04干燥。溶劑在室溫下真空除去。所得殘留物溶于37.5mL的DCM中以300mL乙醚沉淀產(chǎn)物并過濾。以乙醚沖洗濕餅兩次(2xl25mL)。產(chǎn)物在40。C真空干燥(收率90%，10.75g)。13CNMR(75.4MHz，CDC13):567.93-71.6(PEG),170.83.實施例3TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物5):向7-乙基-10-幾基喜樹堿(化合物4，2.0g,5.10mmol,1當量)的lOOmL無水DCM的懸浮液中加入Et3N(4.3mL，30.58mmol,6當量)和叔丁基二笨基氯硅烷(TBDPSC1)(7.8mL，30.58mmol,6當量)。反應(yīng)混合物加熱回流過夜，然后以0.2N的HC1溶液(2x50mL)、飽和NaHC03溶液(100mL)和鹽水(100mL)洗滌。有機層經(jīng)MgS04干燥，過濾并真空蒸發(fā)。殘余物溶于無水DCM中并加入己烷沉淀。以DCM/己烷重復(fù)沉淀以去除過量TBDPSC1。過濾固體并真空干燥得到2.09g產(chǎn)物(收率65%)。'HNMR(300MHz,CDC13):50.90(3H，t，J=7.6Hz)，1.01(3H,t,J=7.3Hz)，1.17(9H,s)，1.83-1.92(2H,m):2.64(2H,q,6.9Hz),3.89(1H,s,OH)，5.11(2H,s),5.27(1H,d,J=16.1Hz),5.72(1H,d,J=16.4Hz),7.07(2H,d,J=2.63Hz),7.36-7.49(7H,m),7.58(1H，s),7.75-7.79(4H,m)，8.05(1H,d，J=9.4Hz).13CNMR(75.4MHz,CDC13):57.82,13.28,19.52，22.86,26.48,31.52,49.23,66.25,72.69,97.25，110.09，117.57,125.67,126.57，127.65,127.81，130.02，131.69，131.97,135.26，143.51，145.05,147.12，149.55，149.92,154.73，157.43，173.72.實施例4TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Gly-Boc(化合物6)向(TC的TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物5，3.78g,.5.99mmol，1當量)和Boc-Gly-OH(1.57g，8.99mmol,1.5當量)的lOOmL無水DCM溶液中加入二氯乙烷(EDC)(1.72g,8.99mmol,1.5當量)和4-二曱基氨基吡啶(DMAP)(329mg,2.69mmol,0.45當量)。反應(yīng)混合物在0。C攪拌直到HPLC顯示起始原料完全消失(大約1小時45分鐘)。以0.5。/。NaHC03溶液(2x50mL)、水(lx50mL)、0.1N的HC1溶液(2x50mL)和鹽水(lx50mL)洗滌有機層，經(jīng)MgS04干燥。過濾并真空濃縮得到4.94g粗產(chǎn)物(定量收率)。粗產(chǎn)物固體不進行進一步純化而直接用于下步反應(yīng)。'HNMR(300MHz，CDC13):50.89(3H,t,J=7.6Hz),0.96(3H,t，J=7.5Hz),1.18(9H，s),1.40(9H,s),2.07-2.29(3H，m)，2.64(2H,q,7.5Hz),4.01-4.22(2H,m),5.00(1H,brs),5.01(2H,s),5.37(1H,d，J=17.0Hz),5.66(1H，d,J=17.0Hz),7.08(1H,d，J=2.34Hz)，7.16(IH，s),7.37-7.50(7H,m)，7.77(4H，d，J=7.6Hz),8.05(1H,d，J=9.4Hz).13C雨R(75.4MHz,CDC13):57.52,13.30,19.50,22.86,26.45，28.21，31.64,42.28,49.14,67.00，76.65，79.96，95.31,110.13，118.98,125.75，126.45,127.68,127.81，130.03,131.54，131.92,135.25,143.65,144.91,145.19,147,08,149.27，154.75,155.14,157.10,166.98，169.17.實施例5TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-GlyHCl(化合物7)向TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Gly-Boc(化合物6,lg，1.27mmol)在5mL無水二喝烷的溶液中加入5mL4M的HC1的二嗜烷溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌直到HPLC顯示起始原料完全消失(l小時)。向混合物中加入50mL乙醚并過濾所得固體。將固體溶于50mL的DCM中并以鹽水洗滌(通過加入飽和NaHC03溶液調(diào)節(jié)pH到2.5)。有機層經(jīng)MgS04干燥，過濾并真空蒸發(fā)。殘余物溶于5mL的DCM中并加入50mL乙醚使其沉淀。過濾得到770mg(收率84%)終產(chǎn)物。&NMR(300MHz,CDC13):S0.84(3H,t,J=7.6Hz)，1.05(3H，t,J=7.3Hz),1.16(9H，s),2.15-2.30(3H,m)，2.59(2H,q:7.6Hz),4.16(1H,d,J=17.9Hz),4.26(1H,d,J=17,9Hz),5.13(2H，s),5.46(1H,d，J=17.0Hz),5.60(1H,d,J=17.0Hz),7.11(1H，d，J=2.34Hz),7.30(1H，s),7.40-7.51(6H，m)，7.56(1H,dd，J=2.34，9.4Hz),7.77(4H，dd,J=7.6，1.6Hz),7.98(1H,d，J=9.1Hz).'3C畫R(75.4MHz,CDC13):58.09,13.72，20.26，23.61,26.94,31.83,41.01，50.71,67.62,79.51,97.03，111.65,119.69，127.13，128.97,128.99,129.11，131.43,131.96,133.00,133.03,136.51,145.62,145.81,147.24,148.29，150.58，156.27,158.68，167.81，168.34.實施例64°k四臂-PEG-Gly-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(10)-TBDPS(化合物8)向艦4臂-PEGCOOH(化合物3,L4g，0.036mmol,l當量)在14mL的無水DCM溶液中加入TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-GlyHCl(化合物7,207mg，0.29mmol，每個活性位點2.0當量)，DMAP(175mg，1.44mmo1，10當量)和PPAC(0.85mL的50%EtOAc溶液，1.44mmol,IO當量)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜，然后真空蒸發(fā)。所得殘余物溶于DCM，且以乙醚沉淀產(chǎn)物并過濾。所得物以DMF/IPA重結(jié)晶得到產(chǎn)物(1.25g)。13CNMR(75.4MHz,CDC13):57.45，13.20,19.39，22.73,26.42，31.67,40.21，49.01，66.83，95.16,110.02,118.83,125.58，126.40,127.53,127.73,129.96,131.49,131.76，131.82,135.12，143.51，144.78,145.13，146.95,149.21，154.61,156.92，166.70,168.46，170.30.實施例7衡四臂-PEG-Gly-(20)-(7-乙基-10-輕基喜樹堿)(化合物9)向化合物40k四臂-PEG-Gly-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(10)-TBDPS(化合物8,1.25g)中加入四丁基氟化銨(TBAF)(122mg,0.46mmo1，4當量)溶于1:1的THF和0.05M的HC1溶液(12.5mL)的混合物的溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4小時然后以DCM萃取兩次。合并的有機相經(jīng)MgS04干燥，過濾和真空蒸發(fā)。殘余物溶于7mL的DMF(二曱基曱酰胺)并以37mL的IPA(異丙醇)沉淀。過濾固體并以IPA洗滌。以DFM/IPA重復(fù)沉淀。最后所得物溶于2.5mL的DCM并加入25mL乙醚沉淀。過濾固體并在40。C真空干燥過夜(860mg)。13CNMR(75.4MHz,CDC13):57.48,13.52,22.91，31.67，40.22,49.12，66,95,94.82，105.03,118.68,122.54，126.37,128.20，131.36，142.92，144.20,144.98，147.25,148.29，156,44，156.98,166.82，168.49,170.39.NMR數(shù)據(jù)顯示沒有PEG-COOH信號，這表明所有的COOH都反應(yīng)了。熒光檢測負載為3.9，聚合物的四個分支全部為7-乙基-10-羥基喜樹堿。以大得多的規(guī)模重復(fù)該實驗得到相同結(jié)果。實施例8叔丁氧羰基(Boc)-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物10)室溫下在氮氣氛中向7-乙基-10-羥基喜樹堿(化合物4，2.45g,1當量)在250mL的無水DCM中的溶液中加入焦碳酸二^又丁酯(di-tert-butyldicarbonate)(1.764g，1.3當量)和無水吡啶(15.2mL，30當量)。懸浮液在室溫下攪拌過夜。渾濁溶液以硅藻土(10g)過濾并以0.5N的HC1洗滌濾液三次(3xl50mL)以及NaHCO3飽和溶液洗滌(lxl50mL)。溶液經(jīng)MgS04(1.25g)干燥。30。C真空除去溶劑。產(chǎn)物在4(TC真空干燥(收率82%，2.525g)。13CNMR(75.4MHz,CDC13)5173.53,157.38，151.60,151.28，150.02，149.70,147.00,146,50，145.15,131.83，127,19,127.13,124.98,118.53,113.88,98.06，84.26,72.80，66.18,49.33,31.62，27.73，23.17,13.98，7.90.實施例9Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Ala-Bsmoc(化合物11)在(TC向Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物10，0.85g,1.71mmo1)和Bsmoc-Ala(0.68g,2.30mmo1)在無水CH2Cl2(20mL)的溶液中加入EDC(0.51g，2.67mmol)和DMAP(0.065g，0.53mmo1)?；旌衔镌诘獨夥罩?°C攪拌45分鐘然后加熱到室溫。通過HPLC確定反應(yīng)完全，反應(yīng)混合物以1%NaHC03(2x50ml),H20(50mL)和0.1N的HC1(2x50mL)洗滌。有機層經(jīng)無水MgS04干燥并過濾。減壓除去溶劑。所得固體低于4(TC真空千燥過夜得到1.28g產(chǎn)物，收率95%。13CNMR(75.4MHz,CDC13)S:171.16,166.83，157.16，154.78，151.59，151.33，149.82,147.17,146.68,145.35，145.15,139.08，136.88,133.60，131.83,130.45,130.40,130.33，127.40，127.08，125.32,125.14,121.38,120.01，114.17，95.90,84.38，77.19,76.64,67.10,56.66，53.45，49.96,49.34,31.7，27.76，17.94，14.02,7.53.ESI-MS,786.20[M+H]+.實施例10Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Ala(化合物12)將Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Ala-Bsmoc(化合物11,4.2g，5.35mmol)和4-哌啶并哌啶(1.17g,6.96mmol)在無水CH2Cl2(200ml)t的溶液在室溫下攪拌5小時?；旌衔镫S后以0.1N的HC1(2x40mL)洗滌，有機層經(jīng)無水MgS04干燥。過濾溶液，真空蒸餾除去溶劑得到2.8g產(chǎn)物，以HPLC4金測純度為93%。該產(chǎn)物以乙醚(3x20mL)研磨，然后以乙酸乙酯(4x20mL)研磨以進一步純化，得到1.52g(2.70mmol)純度97。/。的產(chǎn)物。13C麗R(75.4MHz,CDC13)S168.39，166.63,156.98，151.20，151.15，149.69,146.67，146.56,145.37,144.53,131.66,127.13,124.99，119.80,113.82,96.15，84.21,77.67,67.16，49.48,49.06,31.56,27.74,23.14，15.98,13.98,7.57.實施例1140k四臂-PEG-Ala-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿H10)-Boc(化合物13)室溫下向無水CH2Cl2(100ml)中加入Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Ala(化合物12,L50g，2.5mmol)和4臂PEG-COOH(化合物3，10.01g,l.Ommol)。溶液冷卻到0°C，隨后加入EDC(0.29g，1.5mmol)和DMAP(0.30g，2.5mmo1)。混合物在氮氣氛中在0。C攪拌1小時。室溫靜置過夜。減壓蒸餾去除溶劑。殘余物溶于40mL的DCM,用乙醚(300mL)沉淀粗產(chǎn)物。將過濾所得濕固體于65。C溶于DMF/IPA(60/240mL)的混合物中。溶液在2-3小時內(nèi)冷卻到室溫，沉淀產(chǎn)物。過濾固體，并用乙醚洗滌固體(2x200mL)。濕餅在低于40。C下真空干燥過夜得到產(chǎn)物8.5g。實施例1240k四臂-PEG-Ala-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物14)室溫下向30。/。TFA的無水CH2Cl2溶液中加入艦四臂-PEG-Ala-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(10)-Boc(化合物13,7.98g)?；旌衔飻嚢?小時，或直到HPLC確定起始原料消失。在35。C真空下盡量去除溶劑。所得物溶于50mL的DCM中，用乙醚(350mL)沉淀粗產(chǎn)物并過濾。濕固體65。C下溶于DMF/IPA(50/200mL)混合液中。溶液在2-3小時內(nèi)冷卻到室溫，沉淀產(chǎn)物。然后過濾，并用乙醚洗滌固體(2x200mL)。濕餅在低于4(TC真空干燥過夜得到產(chǎn)物6.7g。13CNMR(75.4MHz,CDC13)5:170,75,169,30,166.65,157.00,156.31,148.36,147.19,145.03,144.29,143.00，131.49,128.26,126.42,122.47,118.79，105.10,94.57,78.08,77.81,77.20,7U5，70.88，70.71，70.33，70.28,70.06,69.93，69.57,66.90,49.14,47.14,31.53，22.95,17.78,13.52,7.46.實施例13Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Met-Bsmoc(化合物15)(TC下向Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物10，2.73g，5,53mmo1)和Bsmoc-Met(3.19g,8.59mmol)在無水CH2Cl2(50mL)中的溶液中加入EDC(1.64g,8.59mmol)和DMAP(0.21g,1.72mmo1)。混合物在0。C下氮氣氛中攪拌45分鐘，然后溫熱到室溫。HPLC確定反應(yīng)完全，以l。/。NaHC03溶液(2xl00mL)、水(100mL)、0.1N的HC1溶液(2xl00mL)洗滌反應(yīng)混合物。有機相以無水MgS04干燥并過濾。減壓除去溶劑。在低于40。C下真空干燥所得固體過夜得到4.2g產(chǎn)物,收率88%。l3CNMR(75.4MHz,CDC13)5:170.3,166.8,157.1,155.2，151.4，151.2,149.7,147.0,146,6,145.3,145.1,138.9，136.6,133.5,131.7,130.5,130.3,130.2,127.3,127.0，125.3,125.1，121.2,119.8,114.1，96.1,84.3，76.7,67.0,56.7,53.5，53.4,49.3，31.6，31.0,29.7,27.7,23.1，15.4,13.9,7.4;ESI掘，846.24[M+H]+.實施例14Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Met-NH2.HCl(化合物16)Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Met-Bsmoc(化合物15,4.1g，4.85mmol)和4-哌啶并哌啶(1.06g,6.31mmol)在無水CH2Cl2(200ml)t的溶液在室溫下攪拌5小時?；旌衔镫S后以0.1N的HC1(2x40mL)洗滌，然后有機層經(jīng)無水MgS04干燥。過濾溶液，真空蒸餾除去溶劑得到2.8g產(chǎn)物，以HPLC才全測純度為97%。該產(chǎn)物以乙醚(3x20mL)研磨，然后以乙酸乙酯(4x20mL)研磨以進一步純化，得到1.54g純度97%的產(chǎn)物。13CNMR(75.4MHz,CDC13)S:167.2,166.5，156.9,151.12,150.9，149.8,146.3，145.9,145.8，144,9,131.3，127.2,127.0,125.1,119.6,113.8,96.7，84.3,78,2，67.0,60.4，52.2,49.4,31.4,29.6,29.1，27.7，23.2，15.1,13.9，7.7.實施例1540k四臂-PEG-Met-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(10)-Boc(化合物13)室溫下向無水CH2Cl2(80ml)中加入Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Met(化合物16,1.48g，2.25mmol)和4臂PEG-COOH(化合物3，9.0g,0.9mmol)。溶液冷卻到0°C，隨后加入EDC(0.26g,1.35mmol)和DMAP(0.27g,2.25mmol)?；旌衔镌诘獨夥罩?。C攪拌1小時。然后室溫靜置過夜。減壓蒸餾去除溶劑。反應(yīng)混合物以70mL的CH2Cl2稀釋，用30mL0.1N的HC1/1M';的NaCl水溶液萃取。有機層經(jīng)MgS04干燥后，減壓下蒸發(fā)溶劑。殘余物溶于40mL的CH2C12，并用乙醚(300mL)沉淀粗產(chǎn)物。將過濾所得濕固體于65°C溶于270mL的DMF/IPA中。溶液在2-3小時內(nèi)冷卻到室溫，沉淀產(chǎn)物。然后過濾固體，并用乙醚洗滌固體(2x400mL)。重復(fù)上述在DMF/IPA中的結(jié)晶方法。濕餅在低于40。C真空干燥過夜得到產(chǎn)物7.0g。13CNMR(75.4MHz，CDC13)5:169.8,169.6,166.5，156.9,151.2,151.1,149.9,147.0,146.6,145.0,131.7,127,1,126.8,124.9，119.7，113.8,95.5，84.1,70.1,69.9，66.9，50.7,49.2,31.5,31.2,29.6,27.6,23.1,15.3,13.9，7.5.實施例164Ck四臂^￡0-]^6^(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物18)室溫下向30%TFA的無水CH2C12溶液(1OOmL)中加入二曱亞砜(2.5mL)和四臂—PEG-Met-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(10)-Boc(化合物17，6.0g)?；旌衔飻嚢?小時，或直到HPLC確定反應(yīng)原料消失。在35。C真空下盡量去除溶劑。所得物溶于50mL的CH2C12中，且用乙醚(350mL)沉淀粗產(chǎn)物并過濾。濕固體于65。C下溶于DMF/IPA(60/300mL)混合液中。溶液在2-3小時內(nèi)冷卻到室溫，沉淀產(chǎn)物。然后過濾固體，并用乙醚(2x200mL)洗滌固體。濕餅在低于40。C真空干燥過夜得到產(chǎn)物5.1g。13CNMR(75.4MHz,CDC13)5:169.7,166.6，157.0,156.3,148.4，147.3，145.0,144.4,142.9,131.5,128.3,126.4,122.5,118.7,105.2,94.7，78.1,67.0,50.7,49.2,31.6,31.3，29.7，23.0,15.3,13.5,7.5;7-乙基-10-羥基喜樹堿與PEG的比為:2.1%(wt).實施例17Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Sar-Boc(化合物19)向Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物10，750mg,1.52mmol)在75mL的DCM中的溶液中加入Boc-Sar-OH(432mg,2.287mmol)并冷卻到0°C。向反應(yīng)混合物中加入DMAP(432mg,2.287mmol)和EDC(837mg，0.686mmol)并從0。C到室溫攪拌1.5小時。以0.5%NaHC03溶液(75mLx2)、水(75mLx2)、O.IN的HCl溶液(75mLxl)洗滌反應(yīng)混合物。以無水MgS04千燥二氯曱烷層并真空蒸餾除去溶劑并干燥。收率0.900mg(89%)。結(jié)構(gòu)通過NMR確定。實施例187-乙基-10-羥基喜樹堿-(20)-Sar.TFA(化合物20)將Boc-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-Sar-Boc(化合物19,900mg,DCM溶液中，室溫下攪拌1小時。反應(yīng)混合物在30。C以曱苯蒸發(fā)。殘余物溶于10mL的CHC13中并以乙醚沉淀。過濾并干燥產(chǎn)物。收率700mg(1.055mmo1,78%)。13CNMR(67.8MHz,CDC13)S168.26，167.07,158.84，158.71,148.82,147.94,147.22,146.34，144.04,131.18,130.08,128.97,124.46,119.78，106.02,97.23,79.84,79.34,66.87,50.84，49.86,31.81,23.94，15.47，13.84，8.08.實施例19TBDMS-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(20)-SaHHCl(化合物21)以200mL無水DCM稀釋7-乙基-10-羥基喜樹堿-(20)-Sar'TFA(化合物20，2.17g，3.75mmol'1當量)的無水DMF(30mL)溶液。加入Et3N(2.4mL，17.40mmol,4.5當量)，然后加入TBDMSC1(2.04g,13.53mmol,3.5當量)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌直到HPLC顯示起始原料消失(大約1小時)。有機層以0.5%NaHC03洗滌兩次，水洗一次和鹽水々包和的0.1N的HC1溶液洗滌兩次，然后經(jīng)MgS04干燥。過濾和真空濃縮溶劑之后所得物溶于DCM。加入乙醚，以細或中等布氏漏斗過濾得到固體沉淀(2.00g，87%收率)。HPLC顯示固體純度為96%。'HNMR和13CNMR確證結(jié)構(gòu)。NMR(300MHz,CD3OD):50.23(6H,s),0.96(9H,s),0.98(3H,t,J=7.3Hz),1.30(3H，t,J=7.6Hz),2.13-2.18(2H,m)，2.67(3H,s),3.11(2H，q，J=7.6Hz),4.10(1H,d,J=17.6Hz),4.22(1H,d,J=17.6Hz),5.23(2H,s),5.40(1H,d，J=16.7Hz)，5.55(1H,d,J=16.7Hz),7.32(1H,s),7.38-7.43(2H,m)，8.00(1H,d,J=9.1Hz).13CNMR(75.4MHz,CD3OD):5-4.14,8.01，14.10，19.30,23.98,26.16,31.78，33.52，49.46,50.95，67.66，79.80，97.41,111.96,119.99,127.75,129.28，129.67,131.57,145.24,146.86,147.16,148.02，150.34,156.69,158.72，167.02,168.27.實施例204°k四臂-PEG-Sar-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(10)-TBDMS(化合物22)向40k4臂-PEG-COOH(化合物3,10g，0.25mmol，l當量)在150mL的無水DCM溶液中加入TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-Sar'HCl(化合物21，1.53mg，2.5mmol，2.5當量)溶于20mL無水DMF的溶液并冷卻混合物到0'C。向溶液中加入EDC(767mg，4mmo1,4當量)和DMAP(367mg，3mmo1,3當量)并使反應(yīng)混合物緩慢溫熱到室溫并于室溫下攪拌過夜。反應(yīng)混合物隨后真空濃縮，殘余物溶于最少量的DCM。加入乙醚后生成固體，并真空過濾。殘余物溶于30mL無水CH3CN并加入600mL的IPA使沉淀。過濾并以IPA和乙醚洗滌固體得到產(chǎn)物(9.5g)。結(jié)構(gòu)以NMR確定。實施例214°k四臂^￡0-831*-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物23)方法A艦四臂-PEG-Sar-(20)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(10)-TBDMS(化合物22)溶于50%的TFA在水中(200mL)的混合物中。室溫下攪拌混合物10小時然后以100mL水稀釋并以DCM(2x300mL)萃取。合并的有機相以水洗滌(2xl00mL)，經(jīng)MgS04干燥，過濾，并真空蒸發(fā)。殘余物溶于100mL無水DMF中并以熱風(fēng)器略微加熱，緩慢加入400mL的DMF使共沉淀。將固體過濾，以20%DMF在IPA中的溶液和乙醚洗滌固體。所得固體溶于DCM中并以乙醚沉淀(6.8g)。結(jié)構(gòu)以NMR確定。方法B40k四臂-PEG-Sar-(20H7-乙基-10-羥基喜樹堿)-(10)-TBDMS(1g)溶于10mL1N的HC1溶液中。反應(yīng)混合物室溫下攪拌1小時(以HPLC檢測)然后以DCM(2x40mL)萃取。有機層經(jīng)MgS04干燥，過濾，真空濃縮。所得明黃色殘留物溶于10mL的DMF(以熱風(fēng)器略微加熱)隨后加入40mL的IPA。過濾所得固體，在40。C真空箱中干燥過夜。結(jié)構(gòu)以NMR確定。生物學(xué)數(shù)據(jù)實施例22毒性數(shù)據(jù)使用棵小鼠研究四臂PEG軛合(conjugated)的7-乙基-10-羥基喜樹堿的最大耐受量(MTD)。當棵鼠體重的減少為預(yù)處理時體重的20%時監(jiān)測其死亡率以及疾病和死亡的信號持續(xù)14天。表1顯示了各個化合物單一劑量和多劑量給藥的最大耐受量。多劑量給藥的各劑量為隔一天給藥，持續(xù)10天，再觀測小鼠4天，因此總共14天。表l.棵小鼠的MTD數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>對于四臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(化合物9)的MTD，單劑量時為30mg/kg，多劑量時為10mg/kg(q2dx5)。實施例23.體外數(shù)據(jù)表2中，細胞毒性(產(chǎn)生IQ()各化合物的|iM)顯示了各化合物的體外抗腫瘤能力。該研究用于確定四臂PEG化7-乙基-10-羥基喜樹堿軛合物的PEG化效果。使用MTS試驗測定PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)、7-乙基-10-羥基喜樹堿和CPT-ll的體外細胞毒性。細胞在37。C與藥物孵育72小時。孵育后，加入MTS染料，在490nm處測量著色產(chǎn)物(甲臘)的形成。四臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)和CPT-11的105()值顯示四臂-￡0-甘氨酸-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)對所有檢測的腫瘤細胞具有較CTP-11高得多的體外抑制。此外，四臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)對于除了HT29腫瘤細胞外的待測腫瘤細胞具有較天然7-乙基-10-羥基喜樹堿明顯更高的體外抑制。PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物比Camptosar⑧的效應(yīng)高大約10到600倍。PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物對COLO205、HT-29和OVCAR-3細胞抹的敏感性比Pegamotecan(喜樹堿的PEG化前藥)高8到16倍。表2.IC5Q(pM)數(shù)據(jù)癌類型細胞抹7-乙基-10-羥基喜樹堿化合物9CPT-ll結(jié)腸直腸Colo2050.2±0.21.0±0.611±1.4HT290.1±0.040.5±0.327±8.6肺A549l.O士O.l2.7±0.467±17胰腺PANC-10.56±0.380.67±0.1434±16MIAPaCa-20.180.0967±46ASPC-10.64±0.131.6±1.133±1.0BxPC-30.54±0.580.24±0.0444±44卵巢OVCAR-30.1±0.020.3±0.220±7.1OV900.1±0.020.6±0.718±4.8OVCAR-80.03±0.010.5±0.19.0±1.3A27800.02±0.010.2±0.28.0±3.5SK-0V-30.2±0.10.9±0.0152±8.5四臂-PEG-Gly-C7-乙基-lO-羥基喜樹堿)(化合物9)的IC5o以；乙基-lO-羥基喜樹堿的當量表示所示值是平均值士SD(n二3);當沒有顯示SD時，所示值是兩次重復(fù)的平均值如表3所概括，包含多種氨基酸的PEG-(7-乙基-10-羥基喜樹4成)軛合物對一系列癌細胞林具有潛在體外細胞毒性。所有的PEG-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物顯示出有力的體外抗腫瘤活性，其超過了小分子前藥CPT-ll和Pegamotecan。表3.多種PEG-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物的ICsoOiM)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實施例24.體內(nèi)數(shù)據(jù)-對乳腺胂瘤異種移植的小鼠的單劑量效應(yīng)四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物(化合物9)抗棵小鼠皮下人乳腺癌細胞(MX-1)的效應(yīng)通過如下方式測定。在適應(yīng)環(huán)境至少一周后，通過將來自供體小鼠的小肺瘤碎片移植到棵小鼠左肋腹區(qū)域的單個皮下位點而形成腫瘤。腫瘤移植位點每周觀察兩次并觸摸測量一次。通過測徑器測量兩個尺寸以確定各鼠的腫瘤體積并使用公式計算腫瘤體積=(長度x寬度2)。當肺瘤達到大約100mm3的平均體積時，將小鼠分到各試驗組，其包括未處理對照組、如本文實施例7制備的四臂PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)組、如Conover等人(^""-Ca"cerZ>wgDew'g",1999,14:499-506)所述制備的PEG-Ala-CPT(其內(nèi)容在此引入作為參考)組，和CPT-ll組。藥物通過尾靜脈以20mg/kg小鼠體重的單劑量靜脈給藥。軛合物的劑量指相當于7-乙基-10-羥基喜樹堿的數(shù)量。在研究開始時和單劑量給藥第31天測量小鼠體重和腫瘤尺寸。表4顯示了測量單劑量靜脈注射20mg/kg體重后第31天小鼠異種移植瘤MX-1乳腺腫瘤細胞的肺瘤縮小。胂瘤的全部生長以腫瘤體積(TV)計算。還計算了治療組相對于對照組的百分比(T/C)。腫瘤退化的百分比表示各化合物的體內(nèi)活性。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-幾基喜樹堿)軛合物顯示出顯著的抗肺瘤活性，小鼠存活率100%,治愈率100%。CPT-ll和鹽水對照組顯示出無保護性，存活率0%。所有數(shù)據(jù)如表4所示。表4.在MX-1乳腺腫瘤異種移植小鼠模型中的單劑量效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>結(jié)果顯示四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)在乳腺癌治療中較之PEG-Ala-CPT或CPT-ll具有明顯更好的效果。在乳腺MX-1腫瘤模型中，以四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)治療使得幾乎100%的腫瘤生長受到抑制和所有動物完全治愈。在相當?shù)膭┝克?，CPT-ll的治療產(chǎn)生26%的肺瘤生長抑制。實施例25.體內(nèi)數(shù)據(jù)-在乳腺腫瘤異種移植小鼠中的多劑量效應(yīng)測定了一系列四臂PEG-氨基酸(衍生物)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物抗棵小鼠中人乳腺癌細胞(MX-1)生長的效應(yīng)。小鼠分組接受四臂PEG-Ala-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)、四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)、四臂PEG-Met-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)、四臂PEG-Sar-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(各化合物通過本發(fā)明方法制備)、CPT-ll或鹽水對照。給藥劑量為連續(xù)六天5mg/kg/天(每兩天[qx2d]x6))。監(jiān)測小鼠體重和腫瘤尺寸直至首劑量給藥和隨后給藥的第31天。表5顯示了在以5mg/kg/天靜脈注射6天(q2dx6)后的第31天測量到異種移植MX-1乳腺胂瘤細胞的小鼠中腫瘤的縮小。所有的四臂PEG-氨基酸(衍生物)-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物顯示出顯著的抗腫瘤活性，小鼠存活率100%,治愈率100%。CPT-ll和鹽水對照顯示出無保護性，存活率0%。所有數(shù)據(jù)如表5所示。表5.在MX-1胸腺肺瘤移植瘤鼠模型中的多劑量效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>化<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>數(shù)據(jù)顯示(7-乙基-10-羥基喜樹堿)的四臂PEG-氨基酸衍生物在乳腺癌治療中較之CPT-ll具有明顯更好的效果。實施例26.在小和大乳腺腫瘤異種移植的小鼠中的體內(nèi)效應(yīng)在具有小(大約100mm"或大(大約450mm"人乳腺MX-l腫瘤的小鼠中評價四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)的抗腫瘤效應(yīng)。單劑量和多劑量方案的抗腫瘤治療活性都進行測定。在移植小乳腺腫瘤的小鼠中，單劑量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(20mg/kg)導(dǎo)致100%TGI。多劑量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(20mg/kgq2dx5)也導(dǎo)致100%TGI。單劑量(20mg/kg)給藥CPT-ll沒有抑制腫瘤生長，多劑量(20mg/kgq2dx5)CPT-11在第31天導(dǎo)致44。/oTGI。在有大乳腺腫瘤的小鼠中，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)(30mg/kg)的單獨MTD治療導(dǎo)致96%TGI。六只小鼠中的四只在第54天治愈。CPT-ll的單獨MTD治療(80mg/kg)在第13天導(dǎo)致70。/。TGI。所有動物在第20天因腫瘤負荷過量而死亡。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)以其MTD的多劑量治療(10mg/kgq2dx5)也導(dǎo)致96%TGI,六只小鼠中的五只在第54天治愈。CPT-ll的多劑量MTD治療(40mg/kgq2dx5)導(dǎo)致在第13天95o/。TGI。然而，六只小鼠中的四只在-5周后肺瘤復(fù)發(fā)。當以與四臂PEG-Gly-C7-乙基-10-羥基喜樹堿)的等劑量水平(10mg/kgq^xS)給予CPT-ll時，其具有有效的TGI直到治療中止，然后腫瘤再生長。結(jié)果見圖6A和6C。抗癌效應(yīng)并不是因為一般的毒性效應(yīng)，因為四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)或CPT-ll當以MTD給藥治療時，在治療期間都沒有顯著減少動物體重，如圖6B和6D所示。在單劑量或多劑量注射的MX-1乳腺腫瘤模型中，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)有效抑制小(100mm"或大(450mm"塊腫瘤的生長。在MX-1乳腺肺瘤異種移植的小鼠中腫瘤尺寸在大約75mm3到大約450mm3的都被成功治療。實施例27.體內(nèi)數(shù)據(jù)-對結(jié)腸直腸腫瘤異種移植小鼠的單劑量效應(yīng)在本實施例中，在異種移植HT-29結(jié)腸直腸腫瘤細胞的小鼠中，在單劑量靜脈注射30mg/kg四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)或CPT-ll后的第4、8、11、15、18和22天測量到胂瘤縮小。CPT-ll劑量仍是80mg/kg。結(jié)果如圖7所示。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物顯示了顯著的抗腫瘤活性。鹽水對照顯示沒有保護性，存活率0%。結(jié)果顯示四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-幾基喜樹堿)在結(jié)腸直腸癌治療中較之CPT-ll具有明顯的效果。實施例28.體內(nèi)數(shù)據(jù)-對結(jié)腸直腸腫瘤異種移植小鼠的多劑量效應(yīng)在異種移植瘤HT-29結(jié)腸直腸腫瘤細胞的小鼠中，在靜脈注射10mg/kg/劑量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-鞋基喜樹堿)或CPT-ll持續(xù)5天后，在第4、8、11、15、18和22天測量到肺瘤縮小。CPT-ll劑量仍是40mg/kg/劑量，持續(xù)5天。結(jié)果如圖8所示。多劑量給藥得到相似結(jié)果。此外，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-輕基喜樹堿)的多劑量給藥顯示出較之CPT-11更為顯著的治療效應(yīng)。結(jié)果顯示四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)的多劑量給藥在結(jié)腸直腸癌治療中較之CPT-ll具有明顯更好的效果。當觀察MX-1肺瘤異種移植的小鼠時，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)或CPT-ll的治療在治療期間沒有顯著降低小鼠體重。實施例29.體內(nèi)數(shù)據(jù)-對胰腺腫瘤異種移植小鼠的單劑量效應(yīng)在本實施例中，在異種移植MiaPaCa-2胰腺腫瘤細胞的小鼠中，在單劑量靜脈注射30mg/kg四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)或CPT-11后的第4、8、11、15、18和22天測量到腫瘤縮小。CPT-ll劑量仍是80mg/kg。結(jié)果如圖9所示。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。鹽水對照和CPT-ll沒有保護作用。結(jié)果顯示四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)在胰腺癌治療中較之CPT-ll具有明顯的效果。單劑量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)治療導(dǎo)致71%TGI，而CPT-ll單劑量注射治療導(dǎo)致0。/。TGI。實施例30.體內(nèi)數(shù)據(jù)-對胰腺腫瘤異種移植小鼠的多劑量效應(yīng)在異種移植MiaPaCa-2胰腺腫瘤細胞的小鼠中，在靜脈注射10mg/kg/劑量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)或CPT-ll持續(xù)5天后，在第4、8、11、15、18和22天測量到胂瘤縮小。CPT-ll劑量仍是40mg/kg/劑量，持續(xù)5天。結(jié)果如圖10所示。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)的多劑量給藥顯示出較之CPT-11顯著的治療效應(yīng)。結(jié)果顯示四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)的多劑量給藥在胰腺癌治療中較之CPT-ll具有更好的效果。多劑量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)治療導(dǎo)致95%TGI,而CPT-11治療導(dǎo)致34。/。丁GI。實施例31.體外代謝在大鼠肝細胞中觀測PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物的體外代謝。PEG-Gly-(7-乙基-10-幾基喜樹堿)與大鼠肝細胞在37°C,pH7.5孵育2小時。如圖11所示，確定7-乙基-10-羥基喜樹堿和7-乙基-10-羥基喜樹堿-葡糖苷酸(7-乙基-10-羥基喜樹堿-G)是主要的代謝產(chǎn)物，這與7-乙基-10-羥基喜樹堿的已知體內(nèi)代謝途徑一致。實施例32.PEG輒合物的性質(zhì)圖6顯示了四種不同PEG-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物在鹽水溶液中的溶解度。所有四種PEG-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物顯示了良好的溶解度，達到相當于7-乙基-10-羥基喜樹堿的4mg/mL。在人血漿中，7-乙基-10-羥基喜樹堿從PEG軛合物中以22到52分鐘的倍增時間穩(wěn)定釋放，且該釋放明顯是pH和濃度依賴性的，如隨后的實施例33所述。表6.PEG-7-乙基-10-羥基喜樹堿軛合物的性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>a7-乙基-1O-羥基喜樹堿在鹽水中不溶.bPEG輒合物半衰期c7-乙基-10-羥基喜樹堿從軛合物的形成率PEG-7-乙基-10-羥基喜樹堿軛合物在室溫下和長達24小時中在鹽水和其它水性介質(zhì)中顯示了良好的穩(wěn)定性。實施例33.濃度和pH對穩(wěn)定性的作用基于我們以前的工作，20-OH位的?；Ｗo內(nèi)酯環(huán)為非活化形式。使用基于UV的HPCL方法觀測在大鼠和人血漿中的水穩(wěn)定性和水解性質(zhì)。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物與每個樣品在室溫下孵育5分鐘。PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物在緩沖液中的穩(wěn)定性取決于pH值。圖12顯示了四臂PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)在多種樣品中的穩(wěn)定性。圖13顯示7-乙基-10-羥基喜樹堿從PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)中的釋放率隨pH增加而增加。實施例34.藥代動力學(xué)無腫瘤Balb/C小鼠注射單劑量20mg/kg四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物。在不同時間點處死小鼠并以HPLC分析完整軛合物和釋放的7-乙基-10-羥基喜樹堿。使用非房室分析(WinNonlin)完成藥代動力學(xué)分析。具體見表7。表7.藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>如圖14所示，7-乙基-10-羥基喜樹堿的PEG化產(chǎn)生長周期的半衰期和對于天然7-乙基-10-羥基喜樹堿的高暴露。觀測到了四臂PEG-GIy-(7-乙基-lO-羥基喜樹堿)軛合物的肝腸循環(huán)。PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)在小鼠中的藥代動力學(xué)曲線為兩相，在開始的2小時為快速血漿分布相，隨后是對于軛合物的18-22小時最終消除半衰期和對于7-乙基-10-羥基喜樹堿的18-26小時的最終消除半衰期。此外，觀測了四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物在大鼠中的藥代動力學(xué)曲線。在大鼠中，使用的劑量水平為3,10和30mg/kg(相當于7-乙基-10-羥基喜樹堿)。藥代動力學(xué)曲線與小鼠中一致。在大鼠中，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)顯示以12-18小時消除半衰期的從大鼠循環(huán)中的兩相清除。7-乙基-10-羥基喜樹堿從四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥、基喜樹堿)軛合物釋放具有21-22小時的表觀消除半衰期。最大血漿濃度(Cp^)和曲線下的面積(AUC)以大鼠中劑量依賴方式增加。從小鼠或大鼠中四臂PEG-Gly軛合物釋放的7-乙基-10-羥基喜樹堿的表觀半衰期明顯長于從CPT-ll釋放的7-乙基-10-羥基喜樹堿的表觀半衰期，且從四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)軛合物釋放的7-乙基-10-羥基喜樹堿顯著的暴露明顯高于從報道的CPT-ll釋放的7-乙基-10-羥基喜樹石成的暴露。大鼠中母體化合物的清除率為0.35mL/hr/kg。評估的母體化合物在穩(wěn)態(tài)下的分布體積(Vss)為5.49mL/kg。大鼠中釋放的7-乙基-10-羥基喜樹石咸的清除率為131mL/hr/kg。大鼠中釋放的7-乙基-10-羥基喜樹堿的評定的Vss為2384mL/hr/kg。大鼠和小鼠中都觀察到了釋放的7-乙基-10-羥基喜樹堿的肝腸循環(huán)。權(quán)利要求1、式(I)的化合物其中R1、R2、R3和R4獨立為OH或(L)m-D；L是雙官能連接基；D是喜樹堿殘基或喜樹堿類似物的殘基；m是0或正整數(shù)，和n是正整數(shù)，條件是R1、R2、R3和R4不全為OH。2、根據(jù)權(quán)利要求i的4給物，其中D是式(n)的^^4勿歹tt<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>R是選自N02,NH2,N3,氫，鹵素，F(xiàn),CI,Br,I,COOH，OH，O-d.s烷基，SH，S-d.3烷基，CN,CH2NH2，NH-C^烷基，CI^-NH-Cw烷基，N(d.3烷基)2，CH2N(C"3烷基)，0-CH2CH2N(CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2N(CH2CH2OH)2和S-CH2CH2N(CH2CH2OH)2,0-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2和S-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2,0-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2和S-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2,0-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH2)2、NH-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH2)2和S-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH2)2,O-CHzCHzNCCw烷基)2、NH-CH2CH2N(C—3烷基)2和S-CH2CH2N(d—3烷基)2，O-CHsCHzCHzN^w烷基)2、NH-CH2CH2CH2N(d—3烷基)2和S-CH2CH2CH2N(C,.3烷基)2,CHO和C,.3烷基；和Rs選自H、CL8烷基和CH2NR9Ro0其中Rg選自氬、Cw烷基、C3—7環(huán)烷基、Cw環(huán)烷基-C"6烷基、C2-6烯基、羥基-CL6烷基和CL6烷氧基-CL6烷基；R,0選自氫、C卜6烷基、Cw環(huán)烷基、Cw環(huán)烷基畫d-6烷基、(32-6烯基、羥基-C卜6烷基、CL6烷氧基-CL6烷基和-CORn其中Rn選自氫、C卜6烷基、全鹵代-C,-6烷基、Cw環(huán)烷基、Cw環(huán)烷基-Q-6烷基、C2-6烯基、羥基-C，-6烷基、C,—6烷氧基和Cw烷氧基-CL6烷基；或Rg和R,。與B環(huán)的氮原子一起形成飽和3-7元包含0、S或NR,2的雜環(huán)，其中R,2選自氫、Cw烷基、全卣代-Cw烷基、芳基、由選自以下一個或多個基團取代的芳基Cw烷基、鹵素、硝基、氨基、Cw烷基氨基、全囟代-d-6烷基、羥基-Cw烷基、Cw烷氧基、C,-6烷氧基-Q-6烷基和-COR,3,其中R,3選自氪、C，—6烷基、全卣代-d-6烷基、CL6烷氧基、芳基和由選自以下一個或多個基團取代的芳基C,—6烷基、全卣代-CL6烷基、羥基-C,-6烷基或C,—6烷氧基-Cw坑基；R則-R川各自獨立選自氫；卣素；酰基；烷基；取代烷基；烷氧基；取代烷氧基；烯基；炔基；環(huán)烷基；羥基；氰基；硝基；疊氮基；酰胺基；肼基；氨基；取代氨基；羥基羰基；烷氧基羰基；烷基羰基氧基；烷基羰基氨基；氨基曱?；趸环蓟酋Ｑ趸?；烷基磺酰氧基；-C(RII7)=N-(0)i-Rll8，其中Rm是H、烷基、烯基、環(huán)烷基或芳基，j是0或1,和Rn8是H、烷基、烯基、環(huán)烷基或雜環(huán)基；R119C(0)0-,其中11119是卣素、氨基、取代氨基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基；和R^-0-(CH2)k-其中k是1-10的整數(shù)和R，是烷基、苯基、取代苯基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、雜環(huán)基或取代雜環(huán)基；或R與Ruo或Rno與R川一起形成飽和或不飽和亞曱基二氧基、亞乙基二氧基或亞乙基氧基；和Rn2是H或OR',其中R'是烷基、烯基、環(huán)烷基、卣代烷基或羥基烷基。3、根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中所述喜樹堿類似物的殘基是4、根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中L是氨基酸殘基或氨基酸衍生物殘基，其中所述氨基酸衍生物選自2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、(3-丙氨酸、p-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-氨基丁酸、鎖鏈素、2,2-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-曱基甘氨酸、肌氨酸、N-曱基-異亮氨酸、6-N-曱基-賴氨酸、N-曱基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。5、根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中L是甘氨酸殘基、丙氨酸殘基、蛋氨酸殘基或肌氨酸殘基。6、根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中L是甘氨酸殘基。7、根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中L選自-[C(0)〗vNR21(CR22R230)「，-[C(0)]vNR21(CR22R230)t(CR24R25)yO-，-[C(0)]vNR21(CR22R230)t(CR24R25)y-,-[C(0)]vNR21(CR22R23)tO-,-[C(0)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR250)yNR26-,-[C(0)]vO(CR22R23)tNR26-，-[C(0)]vO(CR22R23)tO-，-[C(0)〗vNR21(CR22R23)tNR26-,-[C(0)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR250)y-，-[C(0)]vNR21(CR22R230)t(CR24CR25)yNR26-，-[C(0)]vO(CR22R23).-[C(0)]vO(CR22R23),(CR24R25)tNR26-,(CR24R25)tO--[C(0)]vNR21(CR22R23).(CR24R25)tNR26--[C(0)]vNR21(CR22R23).(CR24R25)tO-其中:R2廣R26獨立選自氫、C,-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3—19支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C,-6取代烷基、C2-6取代烯基、Cw取代炔基、(33.8取代環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、Cw雜烷基、取代的C^雜烷基、C,-6烷氧基、苯氧基和CN6雜烷氧基；R"選自氫、C'-6烷基、C^烯基、C2-6炔基、C3—19支鏈烷基、C3—8環(huán)烷基、C，—6取代烷基、C2—6取代烯基、(:2.6取代炔基、C3-8取代環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、Q—6雜烷基、取代的C,-6雜烷基、Cw烷氧基、苯氧基和Q—6雜烷氧基、N02、卣代烷基和鹵素；t和y各自選自大約l到大約4的正整數(shù)；和v是0或1。8、根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中m為大約1到大約10。9、根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中m是大約l。10、根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中n是大約28到大約341。11、根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，其中n是大約114到大約227。12、根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中n是大約227。13、根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，具有至少大約3.9負載的(L)m-D。14、根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>15、根據(jù)權(quán)利要求l的化合物，具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>16、治療哺乳動物的方法，包括向需要的患者給藥有效量的權(quán)利要求1的化合物。17、根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中D是7-乙基-10-羥基喜樹堿殘基。18、治療選自以下轉(zhuǎn)移性疾病的方法實體瘤、淋巴瘤、肺癌、小細胞肺癌、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、卵巢癌和胃癌，該方法包括向需要的患者給藥有效量的權(quán)利要求1的化合物。19、根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述轉(zhuǎn)移性疾病是乳腺癌且所述權(quán)利要求1的化合物是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>20、根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述化合物的給藥量為大約5到大約20mg/kg/劑量。21、根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述轉(zhuǎn)移性疾病是結(jié)腸直腸癌且所述權(quán)利要求1的化合物是22、根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物的給藥量為大約10到大約30mg/kg/劑量。23、根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述轉(zhuǎn)移性疾病是胰腺癌且所述權(quán)利要求1的化合物是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>24、根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述化合物的給藥量為大約10到大約30mg/kg/劑量。25、制備多臂聚合前藥的方法，包括(a)提供一當量包含可用的20-羥基的喜樹堿或喜樹堿類似物和一當量或多當量的包含可用的羧酸基的雙官能連接基；(b)使兩種反應(yīng)物在有效形成具有可用的氨基的喜樹堿雙官能連接基中間體的條件下反應(yīng)；和(c)相對于式(I)活化聚合物的每個活性位點，使一當量或多當量的所得中間體與一當量的式(I)的活化的聚合物反應(yīng)，其中式(I)是R,、R2、R3和R4獨立為OH或(L)m-D;L是雙官能連接基；D是喜樹堿或喜樹堿類似物的殘基；m是0或正整lt;和n是正整數(shù)；^^牛是R,、R2、R3和R4不全為OH。26、制備多臂聚合前藥的方法，包括(a)使一當量包含可用的20-羥基的喜樹堿或喜樹堿類似物，和一當量或多當量的包含可用的羧酸基的雙官能連接基在有效形成具有可用的氨基的喜樹堿雙官能連接基中間體的條件下反應(yīng)；和(b)相對于式(I)的活化聚合物的每個活性位點，使一當量或多當量所得來自步驟(a)的中間體與一當量的式(I)的活化的聚合物，其中式(I)是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>在有效形成具有以下結(jié)構(gòu)的多臂聚合前藥條件下發(fā)應(yīng)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中R)、R2、R3和R4獨立為OH或(L)m-D;L是雙官能連接基；D是喜樹堿或喜樹堿類似物的殘基；m是O或正整lt;和n是正整貌^^牛是R,、R2、R3和R4不全為OH。26.<image>imageseeoriginaldocumentpage10</image>全文摘要公開了四臂-聚乙二醇-7-乙基-10-羥基喜樹堿軛合物，如式(I)；公開了制備軛合物的方法和利用該軛合物治療哺乳動物的方法。文檔編號A61K31/785GK101420963SQ200780012790公開日2009年4月29日申請日期2007年2月9日優(yōu)先權(quán)日2006年2月9日發(fā)明者烏德春,普賈·薩普拉,瑪麗亞·B·魯比奧,洪趙申請人:安佐制藥股份有限公司