專利名稱：一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標(biāo)記、試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標(biāo)記、試劑盒及其檢測方法，具體地涉及MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)及其與卵巢癌的相關(guān)性，及檢測這些SNP的方法和試劑盒，屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，2008年全球新發(fā)病例225500人，死亡140200人。由于起病隱匿，癥狀不明顯，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屆晚期，晚期卵巢癌患者5年生存率僅為30 45%左右，預(yù)后差，而早期卵巢癌患者5年生存率高達(dá)90%，這提示我們提高卵巢癌患者預(yù)后和生存的關(guān)鍵是早診、早治，因此探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制，尋找鑒定卵巢癌易感人群的分子標(biāo)記，卵巢癌患者分子分型和預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)記，對于高危人群或易感個體及卵巢癌患者實施有效的早診、早治和個體化防治具有重要意義。現(xiàn)有技術(shù)中，雖然已經(jīng)有超過200個候選基因和20個遺傳區(qū)域的1100個遺傳變異與卵巢癌易感性相關(guān)，但是與卵巢癌相關(guān)性很強(qiáng)的遺傳變異卻很少。并且沒有MTDH基因SNP與卵巢癌相關(guān)性的報道。因此，本領(lǐng)域急需進(jìn)一步尋找卵巢癌易感基因，開發(fā)檢測卵巢癌高危人群和易感個體的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本申請的發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進(jìn)行了測定和分析，首次發(fā)現(xiàn)MTDH和卵巢癌易感性密切相關(guān)，可作為卵巢癌易感性檢測或者早期診斷的分子標(biāo)記，因此，本發(fā)明提供了一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒及其方法，以及體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示， 其與正常的MTDH基因相比，區(qū)別在于第231位存在一個單核苷酸多態(tài)性G>A，即第231位的堿基包括堿基G和堿基A兩種情形，當(dāng)為堿基G時，為正常的MTDH基因，當(dāng)為堿基A時，為突變的MTDH基因gctacaaatt agtaggaaaa gaatagtgcc gcccacgggc tttccaactt ttgaattctg 60gggactaaca acagagagca agagtgaatg agccaaacga cgcaaacgtg ccctcgccag 120gctggcaact ggtaggcacg cagtgtatta gttgccctgg agagaaacac cctggagaga 180aatacccaat ttgtgaacta aacctaggtc ccggaagaac agtgttcggc rtcagactcc 240231 位，r = G 或Agttgagctca ttctggaagg atccaactgg cgccaccagg gagaaaaagc gattccacct 300caataacact ccagaaaaag gcatgaagag ccctatacct gccagggcga ctttgaccta 360
gacccggtga cccggttcct agcgctgcag ccctacccgc cccccgcccg cccccgcctt 420gcacggagcc cctcctctgt actcattcgt tgcgccacgt ctcctaactc tgcgccacca 480gccaccccgc gaaggcgtcc accaattaac ccctcccagc ttctggtcta cagtaacggg 540tccccaacgc cgcgtcttaa ccaggcccga accgaccacc gccaaccttc cctgacacgc 600ctttgcccca cccgaccccg cccgccccca cgtgacgccc acgccccgcc cactggcgcc 660cacgtgaccc acggtcgtcc ccgcgcgcgg cgtggatcgc ggcccaagcc gccattgttc 720cgccgaggga ggacagcggg gcctggcgct ggcgccgaga cgccgcttag cggccgccac 780 tggagacact ccctcccgcc tcccgggtct cctggcggcg gcggagtgag gctgacagcg 840gggaacctgg gagacccctc cgccctcccc gcggtggcag cggccgatcc ccggctccgg 900cgcgagggac ggccgcgatg cgctcggcct gaggttaccc ggcccggccc ttcctcgctt 960ccctcgacta ttccactgcg tctccgcgcc ccggcgtcat cctgcgagtc cctctgacgg 1020gagggaagat ggctgcacgg agctggcagg acgagctggc ccagcaggcc gaggagggct 1080cggcccggct gcgggaaatg ctctcggtcg gcctaggctt tctgcgcacc gagctgggcc 1140tcgacctggg gctggagccg aaacggtacc 1170一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，包括特異性引物，該引物為一對，具有SEQID NO :2和SEQ ID NO :3的序列，能夠特異性的擴(kuò)增MTDH基因的引物，能特異性地擴(kuò)增出長度 200 2700bp。進(jìn)一步地，試劑盒還包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer組成。PCR反應(yīng)液中各組分的用量關(guān)系為常規(guī)的，對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知常識。一種體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，步驟如下(I)用MTDH基因特異性引物擴(kuò)增樣品的MTDH基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物為一對，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的序列；(2)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性231G>A;231G>A突變位置編號基于SEQ ID NO:1的序列。一種對個體的卵巢癌易感性或患病風(fēng)險進(jìn)行檢測或診斷的方法，步驟如下檢測該個體的MTDH基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的MTDH基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白進(jìn)行比較，存在差異就表明該個體患卵巢癌的可能性低于正常人群。所述差異是指是否存在單核苷酸多態(tài)性231G>A ；231G>A突變位置編號基于SEQ ID NO:1的序列。本發(fā)明的用于檢測卵巢癌易感性的分子標(biāo)記、試劑盒及其方法，以及體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，檢測簡單、準(zhǔn)確、快速，特異性強(qiáng)，對于高危人群或易感個體及卵巢癌患者實施有效的早診、早治和個體化防治具有重要意義。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1 MTDH基因突變的檢測及與卵巢癌的關(guān)聯(lián)分析1.1研究對象選取卵巢癌患者145例，2008年9月 2011年4月于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院確診治療，臨床資料從病歷獲得。年齡匹配的對照病人254例，為齊魯醫(yī)院健康體檢中心健康查體婦女。大部分受試者均為山東省內(nèi)漢族居民。取受試人員外周血1. 5ml，于-80°C冷藏保存。所有受試人員均按照山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會要求征得同意。1.2DNA 提取用常規(guī)酚氯仿法提取受試者外周血DNA，具體如下(I)取400ul血加于1. 5ml離心管中。(2)加入 800ul PBS,混勻，3500g，15min，棄上清；重復(fù)一遍。(3)加入 400ul 裂解液，37°C，lh。(4)加入蛋白酶 K 4ul,濃度 200ug/ml。(5) 55°C水浴消化過夜(4_12h)。(6)加入400ul的Tris飽和酹,混合搖動lOmin。(7) 5000g，15min，取水相。(8)加入 IOOul NaAc，800ul 無水乙醇，-20°C，20min。(9) 12000g, 5min,棄上清。(10) 600ul 70% 冰乙醇，12000g，5min，棄上清，重復(fù)一次。(11) 12000rpm離心，10分鐘。棄上清，晾干。溶于100 μ I TE。(12)測定濃度和純度，分裝，凍存于_80°C。1. 3引物、PCR擴(kuò)增和測序從GenBank 下載 MTDH 基因組序列(Gene ID: 92140 ；Nucleotide AC_000140. 1G1: 157734173)，用primer premier5. 0設(shè)計引物。具體引物詳細(xì)信息見表I。表I引物序列表
權(quán)利要求
1.一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標(biāo)記，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NOI所示，第231位存在一個單核苷酸多態(tài)性G>A，即第231位的堿基包括堿基G和堿基A兩種情形。
2.一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，其特征在于包括特異性引物，該引物為一對，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，其特征在于還包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer組成。
4.一種體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟如下 (1)用MTDH基因特異性引物擴(kuò)增樣品的MTDH基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物為一對，具有 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 的序列； (2)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性231G>A;231G>A突變位置編號基于SEQ ID NO:1的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，第231位存在一個單核苷酸多態(tài)性G>A。一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，包括特異性引物，該引物為一對，具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列。一種體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，步驟如下(1)用MTDH基因特異性引物擴(kuò)增樣品的MTDH基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性231G>A。本發(fā)明的用于檢測卵巢癌易感性的分子標(biāo)記、試劑盒及其方法，以及體外檢測樣品是否存在MTDH基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，檢測簡單、準(zhǔn)確、快速，特異性強(qiáng)。
文檔編號C12N15/12GK102994512SQ20121046420
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者孔北華, 劉曉燕, 苑存忠 申請人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院