本發(fā)明屬于抗生素發(fā)酵無(wú)菌檢查技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種農(nóng)用抗生素發(fā)酵過(guò)程中雜菌的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程大多為純種培養(yǎng)過(guò)程，需要在無(wú)雜菌污染的情況下進(jìn)行。發(fā)酵生產(chǎn)的環(huán)節(jié)比較多，尤其是好氧液態(tài)深層分批單一純種發(fā)酵生產(chǎn)，由于發(fā)酵周期較長(zhǎng)，發(fā)酵工序較復(fù)雜，如無(wú)菌空氣制備，菌種培養(yǎng)的無(wú)菌操作，培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備、管道的滅菌，培養(yǎng)過(guò)程的滅菌操作等，每一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能造成污染雜菌。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)，都有可能遭受雜菌的污染。為了防止染菌，人們采取了一系列措施，如改進(jìn)生產(chǎn)工藝，對(duì)發(fā)酵罐、管道和其他附屬設(shè)備、培養(yǎng)基及空氣等過(guò)程嚴(yán)格滅菌，對(duì)蒸汽、無(wú)菌空氣除嚴(yán)格按無(wú)菌要求供應(yīng)外，還健全了生產(chǎn)技術(shù)管理制度，大大降低了生產(chǎn)過(guò)程染菌率。但是至今仍無(wú)法完全避免染菌的嚴(yán)重威脅，輕者影響了產(chǎn)品的收率和產(chǎn)品的質(zhì)量，重者會(huì)導(dǎo)致“倒罐”，甚至停產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

據(jù)報(bào)道，國(guó)外抗生素發(fā)酵染菌率為2%～5%，國(guó)內(nèi)的青霉素發(fā)酵染菌率2%，鏈霉素、紅霉素和四環(huán)素發(fā)酵染菌率5%，谷氨酸發(fā)酵噬菌體感染率1%～2%。染菌對(duì)發(fā)酵產(chǎn)率、提取率、得率、產(chǎn)品質(zhì)量和三廢治理等都有很大的影響。

從國(guó)內(nèi)外目前的報(bào)道來(lái)看，在現(xiàn)有的科學(xué)技術(shù)條件下要做到完全不染菌是不可能的。目前要做的是要提高生產(chǎn)技術(shù)水平，強(qiáng)化生產(chǎn)過(guò)程管理，防治發(fā)酵染菌的發(fā)生。一旦發(fā)生染菌，應(yīng)盡快找出污染的原因，并采取相應(yīng)的有效措施，把發(fā)酵染菌造成的損失降低到最小。

發(fā)酵過(guò)程是否染菌應(yīng)以無(wú)菌試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行判斷，無(wú)菌試驗(yàn)是對(duì)生產(chǎn)菌種斜面或孢子瓶、搖瓶種子、各級(jí)種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)液，定期取樣培養(yǎng)，定期檢查是否染菌的過(guò)程。在發(fā)酵過(guò)程中，如何及早發(fā)現(xiàn)雜菌的污染并及時(shí)采取措施加以處理，是避免染菌造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要手段。因此，生產(chǎn)上要求能準(zhǔn)確、迅速地檢查出雜菌的污染。

目前常用于檢查是否染菌的無(wú)菌試驗(yàn)方法主要有顯微鏡檢查法、酚紅肉湯培養(yǎng)法、平板（雙碟）培養(yǎng)法、發(fā)酵過(guò)程的異常觀察法等。

如《生物工藝原理（第三版）/高等教育規(guī)劃教材》第十一章發(fā)酵生產(chǎn)染菌及其防治，第二節(jié)發(fā)酵異?，F(xiàn)象及原因分析，二染菌的檢查和判斷。簡(jiǎn)要概述了酚紅肉湯培養(yǎng)法、平板（雙碟）培養(yǎng)法發(fā)酵生產(chǎn)染菌的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法缺點(diǎn)：檢測(cè)前后對(duì)比不明顯不利于分辨，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。

因此，本領(lǐng)域迫切需要一種觀察明顯，培養(yǎng)時(shí)間短，檢測(cè)快速的農(nóng)用抗生素發(fā)酵過(guò)程中雜菌的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明旨在提供一種準(zhǔn)確、快速的農(nóng)用抗生素發(fā)酵過(guò)程中雜菌的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)抗生素發(fā)酵過(guò)程中及時(shí)、快速判斷雜菌污染，從而達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量的控制。

本發(fā)明提供的農(nóng)用抗生素發(fā)酵過(guò)程中雜菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

（1）培養(yǎng)基的配制

按照質(zhì)量百分比，培養(yǎng)基配方為：葡萄糖（ar）：2-5%，蛋白胨（br）：0.5-1%，牛肉膏（br）：0.5-1%，nacl（ar）：0.1-0.5%，指示劑：0.1-0.5%，瓊脂：1-1.5%，余量為水；ph：6.8～7.2；

（2）滅菌

在110-150℃下滅菌10-60min；

（3）擺斜面

把滅好菌的試管擺成斜面；

（4）檢測(cè)

將檢測(cè)液少許加入無(wú)菌樣中，放入36～37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)12～16小時(shí)，觀察無(wú)菌斜面是否有黃斑，黃斑則染雜菌。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基的配制步驟為：①稱取nacl、蛋白胨和牛肉膏，加水待溶解；②加入葡萄糖后加熱溶解；③加入1%苯酚紅溶液溶解均勻；④加入瓊脂加熱溶解后，分裝到20×200mm試管中，加棉塞包扎。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照質(zhì)量百分比，培養(yǎng)基配方為：葡萄糖（ar）：2%，蛋白胨（br）：0.5%，牛肉膏（br）：0.5%，nacl（ar）：0.5%，指示劑：0.5%，瓊脂：1.5%，余量為水；ph：7.2。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的指示劑為1wt%的苯酚紅溶液。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，1%苯酚紅溶液的配制方法為：①稱取苯酚紅1g加95%的酒精10ml；②加無(wú)鹽水90ml；③攪拌均勻用中速濾紙過(guò)濾。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用10%naoh調(diào)值。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基中的水選自ph5.5～6.5、電導(dǎo)率≤2us/cm的無(wú)鹽水。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟（4）中的培養(yǎng)條件為溫度36～37℃，濕度50～60%。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所有操作均為無(wú)菌操作。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟（4）中具體的檢測(cè)步驟為：按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的條件，分別取適量無(wú)菌培養(yǎng)液和培養(yǎng)液，于無(wú)菌苯酚紅試管斜面中，在溫度36～37℃；濕度50～60%的條件下培養(yǎng)12～16小時(shí)后，進(jìn)行肉眼觀察。

與現(xiàn)有技術(shù)中的顯微鏡檢查法、酚紅肉湯培養(yǎng)法、平板（雙碟）培養(yǎng)法、發(fā)酵過(guò)程的異常觀察法相比，本發(fā)明通過(guò)所培養(yǎng)基配方與所述檢測(cè)方法配合使用，菌斑明顯，易于觀察，簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的判定，比現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)方法能節(jié)省至少50%的時(shí)間，適于普遍推廣應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

2015年7月生產(chǎn)多抗霉素時(shí)出現(xiàn)的幾批染菌罐，用酚紅肉湯培養(yǎng)法確定染菌為40小時(shí)左右，這時(shí)發(fā)酵罐ph開(kāi)始急劇下降，糖耗快，氨氮降低，發(fā)酵單位開(kāi)始下滑，只能提前放罐，嚴(yán)重影響正常生產(chǎn)。采用如下條件：培養(yǎng)基：配方：葡萄糖（ar）：20g；蛋白胨（br）：5g；牛肉膏（br）：5g；nacl（ar）：5g；1%苯酚紅液（指示劑）：5ml；瓊脂：15g；水：1000ml；ph：6.8～7.2。1%苯酚紅液配制：①稱取苯酚紅（指示劑）1g加95%酒精10ml；②加無(wú)鹽水90ml；③攪拌均勻用中速濾紙過(guò)濾。配制方法：①稱取nacl、蛋白胨和牛肉膏，加水待溶解；②加入葡萄糖后加熱溶解；③加入1%酚紅液溶解均勻后，用10%naoh調(diào)ph6.8～7.2；④加入瓊脂加熱溶解后，分裝到20×200mm試管中，加棉塞包扎。滅菌：在115℃下滅菌30min。擺斜面：把滅好菌的試管擺成斜面。檢測(cè)方法：①將發(fā)酵液每8h少許加入無(wú)菌樣中（注意整個(gè)取樣過(guò)程的無(wú)菌操作），放入36～37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。②20小時(shí)左右觀察無(wú)菌斜面時(shí)，發(fā)現(xiàn)無(wú)菌斜面有少數(shù)黃斑，顯微鏡檢查確定污染雜菌，及時(shí)采取抑菌控制方法繼續(xù)發(fā)酵，最終發(fā)酵含量和正常發(fā)酵罐批低2.0%。無(wú)菌檢測(cè)時(shí)間比用酚紅肉湯培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間快20小時(shí)左右。

實(shí)施例2

2015年9月生產(chǎn)多抗霉素時(shí)出現(xiàn)的幾批種子罐染菌，用酚紅肉湯培養(yǎng)法確定染菌為32小時(shí)左右，這時(shí)種子罐的種子液已接種到發(fā)酵罐，發(fā)酵罐ph開(kāi)始急劇下降，糖耗快，氨氮降低，泡沫增大，幾乎沒(méi)有發(fā)酵單位，只能倒罐。采用如下條件：培養(yǎng)基：配方：葡萄糖（ar）：20g；蛋白胨（br）：5g；牛肉膏（br）：5g；nacl（ar）：5g；1%苯酚紅液（指示劑）：5ml；瓊脂：15g；水：1000ml；ph：6.8～7.2。1%苯酚紅液配制：①稱取苯酚紅（指示劑）1g加95%酒精10ml；②加無(wú)鹽水90ml；③攪拌均勻用中速濾紙過(guò)濾。配制方法：①稱取nacl、蛋白胨和牛肉膏，加水待溶解；②加入葡萄糖后加熱溶解；③加入1%酚紅液溶解均勻后，用10%naoh調(diào)ph6.8～7.2；④加入瓊脂加熱溶解后，分裝到20×200mm試管中，加棉塞包扎。滅菌：在115℃下滅菌30min。擺斜面：把滅好菌的試管擺成斜面。檢測(cè)方法：①將種子液每4h少許加入無(wú)菌樣中（注意整個(gè)取樣過(guò)程的無(wú)菌操作），放入36～37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。②16小時(shí)左右觀察無(wú)菌斜面時(shí)，發(fā)現(xiàn)無(wú)菌斜面有少數(shù)黃斑，顯微鏡檢查確定污染雜菌，及時(shí)重新做種子接種，減少了經(jīng)濟(jì)損失。無(wú)菌檢測(cè)時(shí)間比用酚紅肉湯培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間快16小時(shí)左右。

實(shí)施例3

2016年4月生產(chǎn)春雷霉素時(shí)出現(xiàn)的幾批染菌罐，用酚紅肉湯培養(yǎng)法確定染菌為60小時(shí)左右，這時(shí)發(fā)酵罐ph開(kāi)始急劇上升，糖耗快，氨氮降低，發(fā)酵單位開(kāi)始下滑，泡沫增大逃逸，只能提前放罐，嚴(yán)重影響正常生產(chǎn)。采用如下條件：培養(yǎng)基：配方：葡萄糖（ar）：20g；蛋白胨（br）：5g；牛肉膏（br）：5g；nacl（ar）：5g；1%苯酚紅液（指示劑）：5ml；瓊脂：15g；水：1000ml；ph：6.8～7.2。1%苯酚紅液配制：①稱取苯酚紅（指示劑）1g加95%酒精10ml；②加無(wú)鹽水90ml；③攪拌均勻用中速濾紙過(guò)濾。配制方法：①稱取nacl、蛋白胨和牛肉膏，加水待溶解；②加入葡萄糖后加熱溶解；③加入1%酚紅液溶解均勻后，用10%naoh調(diào)ph6.8～7.2；④加入瓊脂加熱溶解后，分裝到20×200mm試管中，加棉塞包扎。滅菌：在115℃下滅菌30min。擺斜面：把滅好菌的試管擺成斜面。檢測(cè)方法：①將發(fā)酵液每8h少許加入無(wú)菌樣中（注意整個(gè)取樣過(guò)程的無(wú)菌操作），放入36～37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。②36小時(shí)左右觀察無(wú)菌斜面時(shí)，發(fā)現(xiàn)無(wú)菌斜面有少數(shù)黃斑，顯微鏡檢查確定污染雜菌，及時(shí)采取抑菌控制方法繼續(xù)發(fā)酵，最終發(fā)酵含量和正常發(fā)酵罐批低1.0%。無(wú)菌檢測(cè)時(shí)間比用酚紅肉湯培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間快24小時(shí)左右。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。