本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物提取、分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鹿藥多糖及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多糖(Polysaccharides)是由單糖連接形成的大分子物質(zhì)，為生物體必需的生物大分子之一，在細胞識別、生物體受精、生長發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)衡態(tài)的維持等方面都起著重要作用。由于其特殊的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生物活性，使得多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，如疫苗、抗腫瘤或抗病毒藥物，以及制備藥物緩釋劑、醫(yī)用透析膜、人工血液、人工皮膚等。目前，有關(guān)多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理作用與機理、構(gòu)效關(guān)系已成為生命科學(xué)研究中最活躍的領(lǐng)域之一。從不同生物體內(nèi)提取的多糖具有不同的生理作用。
鹿藥(Smilacinajaponica A.Gray)為百合科鹿藥屬多年生草本植物，我國野生鹿藥資源分布十分廣泛，儲量巨大。鹿藥為藥食同源植物，地上部分的幼嫩莖葉從出苗到開花前均可食用，味道鮮美，是廣受歡迎的山野菜；而地下部分的根莖及根為民間常用中藥，性味“甘、苦、溫，無毒”，具有補氣益腎、祛風(fēng)除濕、活血調(diào)經(jīng)功能，用于治療風(fēng)濕骨痛、神經(jīng)性頭痛、乳腺炎、月經(jīng)不調(diào)、癰癤腫毒、跌打損傷等癥。目前，也有報道稱，豬、雞等養(yǎng)殖戶將鹿藥添加在飼料中喂養(yǎng)動物，以提高動物的免疫力?，F(xiàn)代化學(xué)及藥理研究顯示鹿藥根莖中含有黃酮、皂苷、多糖等活性成分，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)鹿藥中多糖含量較高，約占干燥生藥的20％，且具有抗氧化和抑制腫瘤細胞增殖的作用。除上述研究外，未見有關(guān)鹿藥多糖的研究報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了填補目前鹿藥多糖成分研究的空白，本發(fā)明提供一種鹿藥多糖及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明為解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明的一種鹿藥多糖的制備方法，包括以下步驟：
步驟一、超聲水提
以水為溶劑對鹿藥根莖及根進行超聲提取，料液比1∶20，超聲溫度30℃，超聲時間20min，超聲提取3次，合并濾液，得到鹿藥多糖水提取液；
步驟二、乙醇分級沉淀
將步驟一所得的鹿藥多糖水提取液減壓濃縮至原體積的1/10，加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為70％，4℃放置24h后，7000r/min離心10min，分離出上清液得沉淀物，將所得沉淀物用無水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌后冷凍干燥得70％乙醇沉淀鹿藥粗多糖；向上清液中繼續(xù)加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80％，按上述方法處理得到80％乙醇沉淀鹿藥粗多糖；繼續(xù)向上清液中加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為90％，按上述方法處理得到90％乙醇沉淀鹿藥粗多糖；
步驟三、純化
將步驟二所得的70％乙醇沉淀鹿藥粗多糖、80％乙醇沉淀鹿藥粗多糖和90％乙醇沉淀鹿藥粗多糖分別依次經(jīng)脫蛋白、離子交換色譜柱分離純化、透析、瓊脂糖凝膠柱分離純化、醇沉干燥后得到三種均一組分的鹿藥多糖。
作為優(yōu)選的實施例，所得的三種均一組分的鹿藥多糖的比旋光度分別為-45°、-75°、-35°；以葡萄糖計所得的三種均一組分的鹿藥多糖中的多糖含量分別為89.22％、93.05％、59.83％。
作為優(yōu)選的實施例，所述脫蛋白的具體步驟為：
將步驟二所得的70％乙醇沉淀鹿藥粗多糖、80％乙醇沉淀鹿藥粗多糖和90％乙醇沉淀鹿藥粗多糖分別配制成濃度為2mg/mL的多糖水溶液，采用Sevag法分別除蛋白6次，經(jīng)冷凍干燥后得到三種脫蛋白的鹿藥多糖。
作為優(yōu)選的實施例，采用Sevag法除蛋白的工藝條件為：氯仿與正丁醇的體積比為4∶1，濃度為2mg/mL的多糖水溶液與Sevag試劑的體積比為2∶1，洗脫6次，每次振蕩15min。
作為優(yōu)選的實施例，所述離子交換色譜柱分離純化的具體步驟為：
將所得的脫蛋白的鹿藥多糖加入蒸餾水溶解至濃度為45mg/mL，以離子交換色譜柱分離，依次采用超純水及0.1～0.4mol/L NaCI溶液洗脫，采用苯酚-硫酸法檢測，合并呈峰部分。
作為優(yōu)選的實施例，所述離子交換色譜柱為DEAE Sepharose FF色譜柱，填料95mL。
作為優(yōu)選的實施例，步驟三中，所述透析的具體步驟為：
將所得的呈峰部分濃縮后以截留分子量4000Da的透析袋進行透析，先以自來水透析48h，再以蒸餾水透析24h，得到截留物質(zhì)。
作為優(yōu)選的實施例，步驟三中，所述瓊脂糖凝膠柱分離純化的具體步驟為：
將所得的截留物質(zhì)通過Sephacryl S-300色譜柱分離純化，以超純水洗脫，采用苯酚-硫酸法追蹤檢測，收集呈單峰的洗脫液，洗脫液依次經(jīng)減壓濃縮、無水乙醇沉淀、冷凍干燥后得到均一組分的鹿藥多糖。
本發(fā)明還提供了一種采用上述的制備方法獲得的鹿藥多糖。
采用上述的制備方法獲得的鹿藥多糖在促進豬小腸上皮細胞增殖方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是：
1、本發(fā)明提供了一種操作簡單、重復(fù)性好、污染小、效率高、方法學(xué)良好，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的提取分離純化鹿藥多糖的方法，填補了目前鹿藥多糖成分研究的空白。
2、通過本發(fā)明的制備方法得到的鹿藥多糖為均一組分，具有促進豬小腸上皮細胞增殖的作用，有潛力被開發(fā)成養(yǎng)豬飼料的添加劑或提高免疫力的藥物。
3、本發(fā)明能夠從鹿藥中提取出新型多糖，并且該多糖具有獨特的功效，能夠為鹿藥資源的開發(fā)利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。
4、采用本發(fā)明的制備方法獲得的三種均一組分的鹿藥多糖的比旋光度分別為-45°、-75°、-35°；以葡萄糖計所得的三種均一組分的鹿藥多糖中的多糖含量分別為89.22％、93.05％、59.83％。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1鹿藥多糖的制備
本發(fā)明的一種鹿藥多糖的制備方法，包括鹿藥多糖的提取和鹿藥多糖的純化兩個步驟。
1、鹿藥多糖的提取，包括以下步驟：
(1)超聲水提：將鹿藥根莖及根洗凈、陰干、粉碎，以水為溶劑對其進行超聲提取，通過正交實驗考察料液比、超聲溫度、超聲時間、提取次數(shù)對提取率的影響，最終得到最佳提取工藝：料液比1∶20，超聲溫度30℃，超聲時間20min，超聲提取3次，按照此最佳工藝提取，合并濾液，得到鹿藥多糖水提取液。
(2)乙醇分級沉淀：將上述所得的鹿藥水提取液減壓濃縮至原體積的1/10，加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為70％，4℃放置24h后，7000r/min離心10min，分離出上清液，將所得沉淀物用無水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌后冷凍干燥得70％乙醇沉淀鹿藥粗多糖，標(biāo)記為SJP1；向上清液中繼續(xù)加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80％，按上述方法(4℃放置24h后，7000r/min離心10min，分離出上清液，將所得沉淀物用無水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌后冷凍干燥)處理得到80％乙醇沉淀鹿藥粗多糖，標(biāo)記為SJP2；向上清液中繼續(xù)加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為90％，按上述方法(4℃放置24h后，7000r/min離心10min，分離出上清液，將所得沉淀物用無水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌后冷凍干燥)處理得到90％乙醇沉淀鹿藥粗多糖，標(biāo)記為SJP3。
2、鹿藥多糖的純化，包括以下步驟：
將乙醇分級沉淀所得的70％乙醇沉淀鹿藥粗多糖、80％乙醇沉淀鹿藥粗多糖和90％乙醇沉淀鹿藥粗多糖分別依次經(jīng)脫蛋白、離子交換色譜柱分離純化、透析、瓊脂糖凝膠柱分離純化、醇沉干燥后得到三種均一組分的鹿藥多糖。其具體步驟如下：
(1)脫蛋白：將乙醇分級沉淀所得的SJP1、SJP2、SJP3分別配制成濃度為2mg/mL的多糖水溶液，采用Sevag法除蛋白，通過正交實驗確定最佳工藝，按照最佳工藝條件：氯仿∶正丁醇＝4∶1(V/V)，多糖水溶液(2mg/mL)∶Sevag試劑＝2∶1(V/V)，洗脫6次，每次振蕩15min以除蛋白，將水層冷凍干燥后得到三種脫蛋白的鹿藥多糖。
(2)離子交換色譜柱分離純化：將上述脫蛋白的鹿藥多糖加入蒸餾水進行溶解，至鹿藥多糖濃度為45mg/mL，過DEAE Sepharose FF色譜柱，填料95mL，依次采用超純水及0.1～0.4mol/L NaCI溶液洗脫，流速1mL/min，自動接收器以5mL/管進行收集，采用苯酚-硫酸法檢測，合并呈峰部分；
(3)透析：將上述呈峰部分濃縮后，以截留分子量4000Da的透析袋進行透析，先以自來水透析48h，再以蒸餾水透析24h，得到截留物質(zhì)。
(4)瓊脂糖凝膠柱分離純化：將上述透析后的截留物質(zhì)通過Sephacryl S-300色譜柱分離純化，所用凝膠為Sephacryl S-300，以超純水洗脫，采用苯酚-硫酸法追蹤檢測，收集呈良好單峰的洗脫液，洗脫液依次經(jīng)過減壓濃縮、無水乙醇沉淀、沉淀冷凍干燥后從SJP1、SJP2、SJP3中分別對應(yīng)得到一種均一組分的鹿藥多糖，分別標(biāo)記為SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1。
實施例2鹿藥多糖含量的測量
利用紫外分光光度法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸顯色測定鹿藥多糖含量，其具體過程如下：
1、苯酚液的制備：稱取新蒸餾的苯酚4g，加蒸餾水溶解，定容至100mL，混勻后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，得4％苯酚溶液，置冰箱中備用。
2、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品200mg，用蒸餾水溶解定容至100mL容量瓶中，取10mL再定溶至100mL，搖勻即得0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL分別置于具塞試管中，加蒸餾水至1mL，搖勻，加入4％苯酚溶液0.75mL，搖勻，迅速加入濃硫酸3.0mL，搖勻，于40℃水浴中保溫30min，取出，置冰水浴中5min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，測定最大吸收波長490nm的吸光度，以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝11.677x+0.3249，R2＝0.9958。
以葡萄糖計所得的三種均一組分的鹿藥多糖中的多糖含量分別為89.22％、93.05％、59.83％。
實施例3
對實施例1中得到的三種均一組分的鹿藥多糖SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1進行旋光度測定：分別稱取25mg三種均一組分的鹿藥多糖SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1，以蒸餾水溶解，定容至25mL，以水為空白對照，自動旋光儀測量旋光度，經(jīng)計算，三種均一組分的鹿藥多糖SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1的比旋光度分別為-45°、-75°、-35°。
對三種均一組分的鹿藥多糖溶液進行稀釋測定吸光度，稀釋后比旋光度沒有變化，進一步說明SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1均為均一組分的鹿藥多糖。
實施例4鹿藥多糖對豬小腸上皮細胞增殖的影響
將豬小腸上皮細胞PIEC以DMEM培養(yǎng)基復(fù)蘇、培養(yǎng)，選對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度為1×104個/mL，接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24h，吸去培養(yǎng)液，加入含有鹿藥多糖的培養(yǎng)液200μL，鹿藥多糖設(shè)置6個不同終濃度組(1.25μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)，陰性對照組(含溶媒DMSO的培養(yǎng)液)，另設(shè)調(diào)零組(只加培養(yǎng)液)，每組設(shè)6復(fù)孔，加藥后置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，吸去含有鹿藥多糖的培養(yǎng)液，加入體積比為4∶1的無血清培養(yǎng)液和MTT(終濃度5mg/mL)共100μL，繼續(xù)孵育4h，小心吸去上清液后每孔加入150μL DMSO，放于震蕩器上震蕩使結(jié)晶完全溶解(5min)后，于酶標(biāo)儀在570nm處檢測各孔的吸光度(A值)，統(tǒng)計三種鹿藥多糖對豬小腸上皮細胞PIEC增殖的影響情況，結(jié)果見表1。
表1三種鹿藥多糖對PIEC細胞增殖的影響(n＝4，x±s)
注：與空白對照組相比，*p<0.05，**p<0.01。
由此可見，三種鹿藥多糖SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1對豬小腸上皮細胞PIEC均有促進增殖作用，總體來說，在實驗濃度范圍內(nèi)都是隨著濃度增大而促進作用減弱，濃度達到40μg/mL時，鹿藥多糖SJP1-1、SJP2-1出現(xiàn)微弱的抑制作用；在濃度1.25～10μg/mL范圍內(nèi)，對豬小腸上皮細胞PIEC增殖的促進作用是SJP3-1>SJP2-1>SJP1-1>鹿藥呋甾皂苷。
小腸上皮細胞是小腸的功能細胞，其功能主要為在消化道中分泌消化液消化食物、吸收和交換營養(yǎng)物質(zhì)及免疫屏障作用，被認(rèn)為在宿主黏膜表面的天然及獲得性免疫系統(tǒng)中起中心調(diào)節(jié)作用。鹿藥多糖對豬小腸上皮細胞PIEC增殖有明顯的促進作用，可以應(yīng)用于制備有益于豬小腸上皮細胞增殖方面的藥物或飼料添加劑，為鹿藥多糖作為豬飼料添加劑提高免疫力及改善腸道黏膜損傷修復(fù)等的藥物研究提供參考。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。