本發(fā)明涉及雷公藤主要活性成分雷公藤二萜類化合物生物合成，具體涉及雷公藤二萜合酶twcps1在制備松香烷型二萜化合物中的應(yīng)用，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

藥用植物雷公藤(tripterygiumwilfordii.hook.f.)是一味中草藥，被廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥的治療(raphaelagm，mildredw，royf，etal.comparisonoftripterygiumwilfordiihookfversussulfasalazineinthetreatmentofrheumatoidarthritis：arandomizedtrial[j].annalsofinternalmedicine，2009，151(4)：229-240.taoxl，lipskype.thechineseanti-inflammatoryandimmunosuppressiveherbalremedytripterygiumwilfordiihookf.[j].rheumaticdiseaseclinicsofnorthamerica，2000，26(1)：29-50.)。萜類成分為雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚內(nèi)酯(triptophenolide)和雷公藤紅素(celastrol)等。從中藥中的活性成分開(kāi)發(fā)新藥是一種很有潛力的方式，然而由于植物的生長(zhǎng)緩慢，再加上這些有效成分在植物體中的含量不多，因而大大限制了它的發(fā)展。通過(guò)探尋和闡釋萜類成分在雷公藤中的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制，有助于為藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用生物技術(shù)提高目標(biāo)成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來(lái)廣闊的應(yīng)用空間。

雷公藤甲素具有抗腫瘤、抗炎、抗排異、抗生育等藥理作用，與丹參酮類化合物同屬松香烷型二萜。目前已證實(shí)丹參中的smcps與smks基因能催化ggpp形成松香烷型二萜化合物前體次丹參酮二烯，然而將smcps與smks聯(lián)合使用制備次丹參酮二烯合成效率低，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用、影響了其他松香烷型二萜化合物的合成研究。由于雷公藤甲素、丹參酮等松香烷型二萜化合物的良好應(yīng)用前景，產(chǎn)業(yè)上迫切需要一種高產(chǎn)率的、不依賴于天然提取途徑的松香烷型二萜化合物前體合成方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明將克隆得到的雷公藤二萜合酶基因twcps1和丹參中的smksl1基因分別構(gòu)建表達(dá)載體，成功生成了次丹參酮二烯。進(jìn)一步證實(shí)了twcps1基因在合成雷公藤甲素等松香烷型二萜合成中的作用，且提供了一種合成松香烷型二萜前體的方法，為雷公藤甲素的生物合成奠定基礎(chǔ)。

次丹參酮二烯是一種重要的松香烷型二萜化合物前體，由于其發(fā)現(xiàn)于丹參，因此將丹參中的smcps1與smksl1用于制備丹參酮。除了丹參以外，其他的植物中盡管也存在二萜合酶ks、cps，也可能產(chǎn)生二萜類化合物，但通常不能催化合成次丹參酮二烯或合成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于丹參自身smcps1與smksl1的組合。本發(fā)明在研究雷公藤甲素合成代謝途徑的過(guò)程中，意外的發(fā)現(xiàn)雷公藤二萜合酶中的twcps1，與smksl1組合使用時(shí)能夠成功合成次丹參酮二烯，且產(chǎn)量高于smcps1與smksl1的組合。即：本發(fā)明用雷公藤二萜合酶twcps1能夠用于生產(chǎn)松香烷型二萜化合物前體，并且以其代替丹參二萜合酶smcps1，取得了產(chǎn)量提高的技術(shù)效果。值得注意的是，其他植物來(lái)源的二萜合酶(如擬南芥atcps)、雷公藤來(lái)源的其他種類的二萜合酶(如twcps2、twcps3)等與丹參smksl1組合則不能催化合成次丹參酮二烯。本發(fā)明所述twcps1+smksl1的組合合成松香烷型二萜化合物前體次丹參酮二烯的技術(shù)方案具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供了一種合成雷公藤松香烷型二萜類化合物前體合成的方法：具體將twcps1基因的cdna克隆到原核表達(dá)載體pmal-c2x，構(gòu)建帶有twcps1基因的重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)入e.coli表達(dá)宿主菌，通過(guò)誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)初步純化后，加入到以ggpp為底物的體外酶促反應(yīng)體系中，正己烷萃取反應(yīng)產(chǎn)物，采用gc-ms可同時(shí)檢測(cè)到產(chǎn)物。通過(guò)將twcps1基因的orf克隆到真核表達(dá)載體pesc-trp，構(gòu)建帶有twcps1基因的重組表達(dá)載體；并通過(guò)定點(diǎn)突變等方法，通過(guò)酵母by-t20發(fā)酵生成產(chǎn)物，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析twcps1基因的功能。研究結(jié)果表明，本發(fā)明與雷公藤二萜類化合物合成有關(guān)的基因具有二萜合酶基因的dxdd特征結(jié)構(gòu)域，酶促反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因催化雷公藤二萜類化合物的早期合成步驟，對(duì)于培育高品質(zhì)的藥用植物品種特別是培育具有高雷公藤甲素含量的雷公藤品種具有重要的理論及實(shí)際意義。

本發(fā)明提供雷公藤二萜合酶或其基因在合成二萜類化合物中的用途，所述雷公藤二萜合酶的氨基酸序列如seqidno：2所示，所述雷公藤二萜合酶基因的序列如seqidno：1所示。

本發(fā)明所述雷公藤二萜合酶或其基因在合成二萜類化合物中的用途，其中所述二萜類化合物包括雷公藤甲素或其前體、丹參酮或其前體等。

本發(fā)明所述雷公藤二萜合酶或其基因在合成二萜類化合物中的用途，其中所述二萜類化合物為松香烷型二萜類化合物前體，更具體的，所述二萜類化合物是次丹參酮二烯。

本發(fā)明所述雷公藤二萜合酶或其基因在合成二萜類化合物中的用途，其特征在于將雷公藤合酶或其基因與丹參二萜合酶smksl1或其基因聯(lián)合使用。

本發(fā)明所述雷公藤二萜合酶或其基因在合成二萜類化合物中的用途，其特征在于雷公藤合酶或其基因與丹參二萜合酶smksl1或其基因同時(shí)使用或先后使用，

本發(fā)明所述雷公藤二萜合酶或其基因在合成二萜類化合物中的用途，其特征在于先使用雷公藤合酶或其基因?qū)gpp催化形成cpp，再使用丹參二萜合酶smksl1或其基因催化cpp合成松香烷型二萜類化合物前體。

本發(fā)明還提供一種合成松香烷型二萜類化合物前體的方法，其包括：

(1)將雷公藤二萜合酶基因twcps1表達(dá)盒插入第一原核表達(dá)載體中，制備表達(dá)外源雷公藤二萜合酶twcps1的重組大腸桿菌，超聲破碎菌體，取含有重組twcps1蛋白的上清液；

(2)將丹參二萜合酶基因smksl1表達(dá)盒插入第二原核表達(dá)載體中，制備表達(dá)外源丹參二萜合酶smksl1的重組大腸桿菌，超聲破碎菌體，取含有重組smksl1蛋白的上清液；

(3)以ggpp為底物，以步驟(1)中獲得的含重組twcps1蛋白的上清液為催化劑，催化ggpp產(chǎn)生cpp；

(4)以步驟(3)獲得的cpp為底物，以步驟(2)獲得的含重組smksl1蛋白的上清液為催化劑，催化cpp產(chǎn)生松香烷型二萜類化合物前體。

本發(fā)明所述合成松香烷型二萜類化合物前體的方法，步驟(1)所述的原核表達(dá)載體為pmal-c2x，所述twcps1基因插入bamhi和sali之間。

本發(fā)明所述合成松香烷型二萜類化合物前體的方法，在步驟(3)的催化反應(yīng)完成后還包括脫磷的步驟。

本發(fā)明所述合成松香烷型二萜類化合物前體的方法，在步驟(4)完成后還包括對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行g(shù)c-ms分析的步驟，其中在第13.06分出現(xiàn)的峰為次丹參酮二烯。

附圖說(shuō)明

圖1雷公藤二萜合酶原核表達(dá)載體構(gòu)建

圖2宿主菌e.colitransb(de3)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物sds-page蛋白電泳分析(c：陰性對(duì)照即空表達(dá)載體pmal-c2x表達(dá)產(chǎn)物；m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶由上往下分別為200、116、97.2、66.4、29.0、20.1、14.3、6.5kda；箭頭表示目的重組蛋白；1：重組質(zhì)粒pmaltwcps1的表達(dá)；2：重組質(zhì)粒pmaltwcps3的表達(dá)產(chǎn)物；3：重組質(zhì)粒pmaltwks的表達(dá)產(chǎn)物；4：重組質(zhì)粒pmaltwcps2的表達(dá)產(chǎn)物；5：重組質(zhì)粒pmaltwges2表達(dá)產(chǎn)物；6：重組質(zhì)粒pmaltwges1表達(dá)產(chǎn)物)

圖3定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)

圖4雷公藤二萜合酶真核表達(dá)載體構(gòu)建

圖5cps催化底物ggpp形成產(chǎn)物提取離子色譜圖，第13.83分的峰為cpp，質(zhì)譜荷質(zhì)比為275m/z。由上而下依次為twcps1、twcps2、twcps3、smcps、atcps、空載體。

圖6(cps+ks)催化ggpp形成產(chǎn)物提取離子色譜圖，第13.06分的峰為次丹參酮二烯，第13.03分的峰為對(duì)映貝殼杉烯，第13.83分的峰為cpp，第13.96分的峰為16α-貝殼杉烷，第13.46分的峰為ggoh。

圖7twcps2c311d、twkst318d催化ggpp形成產(chǎn)物提取離子色譜圖，第13.46分的峰為ggoh。

圖8by-t20/pesc-trp-twcps3+twks、by-t20/pesc-trp-twcps3+twksa608m、by-t20/pesc-trp發(fā)酵產(chǎn)物提取離子色譜圖，第13.03分的峰為對(duì)映貝殼杉烯。

圖9by-t20/pesc-trp、by-t20/pesc-trp-twcps1、by-t20/pesc-trp-twcps3+twks、by-t20/pesc-trp-twcps3+twksa608m發(fā)酵產(chǎn)物提取離子色譜圖第12.99分的峰為淚杉醇((+)-manool)，第13.03分的峰為對(duì)映貝殼杉烯，第13.83分的峰為cpp，第13.96分的峰為16α-貝殼杉烷。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

雷公藤(tripterygiumwilfordiihook.f.)懸浮細(xì)胞在文獻(xiàn)“雷公藤4-(5’-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤蘚醇激酶基因的全長(zhǎng)克隆與表達(dá)分析.中國(guó)中藥雜志，2015，40(21)：4165-4170”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從首都醫(yī)科大學(xué)分子生藥與中藥資源實(shí)驗(yàn)室獲得。

smartertmracecdnaamplificationkit，primestargxldnapolymerase購(gòu)自takara公司；peasy-bluntsimplecloningkit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，ggpp購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為g6025。

實(shí)施例一、雷公藤twcps1原核表達(dá)載體構(gòu)建(圖1)

以含有雷公藤twcps1基因全長(zhǎng)cdna的載體pmd-19-tps質(zhì)粒為模板，用含酶切位點(diǎn)引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增基因編碼區(qū)(引物序列見(jiàn)表3-1)。dna聚合酶采用高保真dna聚合酶(primestarhsdnapolymerase)。pcr參數(shù)為98℃3min，1循環(huán)；98℃10s，60℃10s，72℃2min30s，30循環(huán)；72℃7min；4℃維持。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)genejetgelextractionkit膠回收(方法如下)。

genejetgelextractionkit膠回收步驟：

(1)取pcr產(chǎn)物與6×loadingbuffer預(yù)混合，在1.5％瓊脂糖凝膠上以低電壓(約5vcm-1)電泳30-60min；

(2)用解剖刀或剃刀片切割含有dna片段的凝膠，盡可能的靠近dna片段切割，以減小凝膠的含量，將膠片放在事先稱重的1.5ml離心管并稱重。記錄膠片的重量。注意避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外燈下，損害dna而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

(3)加1∶1量的bindingbuffer到膠片中(量以重量計(jì)，如每100毫克瓊脂糖凝膠加100微升的bindingbuffer)；

(4)在50-60℃的條件下溫育凝膠混合物10min，期間顛倒混勻2-3次，促進(jìn)膠融化，保證膠全部溶解，在上柱前將凝膠混合物快速渦旋混勻一次；

(5)轉(zhuǎn)移最多800μl凝膠溶解液到基因回收純化柱，13000g離心1min，棄去流出液，然后將柱放回相同的收集管；

(6)加入700μlwashbuffer(已用乙醇稀釋)到genejet純化柱。13000g離心1min，棄去流出液，然后將柱放回相同的收集管；

(7)離心空genejet純化柱13000g離心1min，徹底去除殘留的washbuffer；

(8)將genejet純化柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的1.5ml離心管，加30-50μlddh2o(可60℃預(yù)熱)于純化柱膜，13000g離心1min；

(9)丟掉genejet純化柱并儲(chǔ)存純化的dna在-20℃。

經(jīng)純化后的pcr產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，采用neb公司t4dna連接酶定向連入經(jīng)相同雙酶切的表達(dá)載體pmal-c2x中(方法如下)，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、藍(lán)白菌落篩選及陽(yáng)性克隆的初步篩選，并送樣測(cè)序鑒定，得到經(jīng)測(cè)序核苷酸序列無(wú)突變重組質(zhì)粒pmaltps，并將經(jīng)的重組質(zhì)粒pmaltps轉(zhuǎn)化至大腸桿菌e.colitransb(de3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞。與此同時(shí)，將擬南芥中功能明確的atcps(催化ggpp形成ent-cpp)、atks(催化ent-cpp形成對(duì)映貝殼杉烯)及丹參中功能明確的smcps1(催化ggpp形成nor-cpp)、smksl1(催化nor-cpp形成次丹參酮二烯)構(gòu)建到pmal-c2x原核表達(dá)載體上(smcps1、smksl1利用實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pet32smcps1及pet32smksl1)，將雷公藤twcps1、twks分別與其他植物來(lái)源的cps、ks進(jìn)行對(duì)比。

采用takaraquickcut酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)：

表1：雙酶切反應(yīng)體系

雙酶切反應(yīng)(50μl體系)

內(nèi)切酶1酶切完成后，加入1μl內(nèi)切酶2繼續(xù)酶切。注意：最適酶切溫度較低的內(nèi)切酶應(yīng)先進(jìn)行酶切，若最適酶切溫度相同，可同時(shí)加入同時(shí)酶切。

采用nebt4dna快速連接試劑盒進(jìn)行dna片段連接反應(yīng)：

表2：連接反應(yīng)體系

連接反應(yīng)(20μl體系)

＊dna與載體摩爾比約為3∶1-10∶1

25℃連接5min(可適當(dāng)延長(zhǎng)連接時(shí)間)。

表3構(gòu)建原核表達(dá)載體引物序列

實(shí)施例二、重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

誘導(dǎo)表達(dá)

100mmol·l-1iptg：稱取238.3mg的iptg用10ml的ddh2o溶解，過(guò)濾分裝-20℃保存；lb培養(yǎng)基：trytone1.0％，yeastextract0.5％，nacl1.0％，agar1.5％，ph7.0。

操作步驟：

(1)將酶切鑒定正確且經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的含目的基因的重組質(zhì)粒，取1μl轉(zhuǎn)化至50μltransb(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂板lb+amp(氨芐青霉素鈉)固體平板，37℃倒置培養(yǎng)12-16h；

(2)挑取單克隆菌落經(jīng)酶切鑒定后轉(zhuǎn)到含100μg·ml-1amp的2mllb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至od600到0.6-1.0；

(3)取1ml菌液5000g4℃離心5min收集菌體，用新鮮lb+amp液體培養(yǎng)基混懸菌體，轉(zhuǎn)接到100mllb+amp液體培養(yǎng)基中；

(4)37℃培養(yǎng)至宿主菌密度(od600)達(dá)到0.6-1.0時(shí)，加入適量iptg誘導(dǎo)劑(終濃度約0.4mm)，在低溫下(16℃)誘導(dǎo)培養(yǎng)8h；

(5)4℃3000g離心20min收獲菌體，預(yù)冷的5mlhepes緩沖液(50mmhepes，100mmkcl，7.5mmmgcl2，5mmdtt，1mmpmsf，5％甘油，ph7.2)重懸；

(6)置冰浴中超聲破菌(30％功率，超聲5s，間隔5s，持續(xù)3min)；大腸桿菌破碎液在4℃，15000g離心30min，取上清液；

(7)上清液經(jīng)蛋白超濾管濃縮(4℃5000g40min)至1.5ml。

取上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sds-page)凝膠電泳檢測(cè)。

以空質(zhì)粒pmal-c2x轉(zhuǎn)化transb(de3)表達(dá)菌進(jìn)行表達(dá)為對(duì)照。

實(shí)施例三、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)(圖2)

試劑配制

30％丙烯酰胺貯存液(神經(jīng)毒性，操作時(shí)配戴口罩及手套)：在通風(fēng)櫥中，稱取丙烯酰胺29.2g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加ddh2o溶解后，定容到100ml。針頭濾器過(guò)濾后置棕色瓶中，4℃保存；

ph8.8tris-hcl分離膠緩沖液：配制1.5mtris-hcl，并調(diào)節(jié)ph至8.8，4℃保存；

ph6.8tris-hcl濃縮膠緩沖液：配制1mtris-hcl，并調(diào)節(jié)ph至6.8，4℃保存；

10％sds：稱取sds1.0g，蒸餾水10ml溶解，4℃保存；

10％過(guò)硫酸銨(aps)：取aps1.0g，蒸餾水10ml溶解，4℃保存；

temed(四乙基乙二胺)原液；

5×樣品緩沖液(10ml)：0.6ml1mol·l-1的tris-hcl(ph6.8)，5ml50％甘油，2ml10％的sds，0.5ml巰基乙醇，1ml1％溴酚藍(lán)，0.9ml蒸餾水?？稍?℃保存數(shù)周，或在-20℃保存數(shù)月；

10×電泳緩沖液：稱取tris30.38g，甘氨酸144g，sds10.8g，加蒸餾水約900ml，調(diào)ph8.3后，用蒸餾水定容至1000ml，置4℃保存，臨用前稀釋10倍。

實(shí)施例四、樣品制備

將蛋白質(zhì)樣品與5×樣品緩沖液在一個(gè)eppendorf管中混合，放入100℃加熱5-10min，常溫12000g離心3min，取上清點(diǎn)樣。

實(shí)施例五、電泳

操作步驟

(1)將玻璃板、樣品梳用洗滌劑洗凈，用ddh2o沖洗數(shù)次，晾干；

(2)安裝玻璃板；

(3)按如下體積配制10％分離膠15ml(配制兩塊膠)，混勻；

(4)向玻璃板間灌制分離膠，立即加入1mlddh2o壓平膠面，大約20min后膠即可聚合；

(5)按如下體積配制5％濃縮膠5ml(配制兩塊膠)，混勻；

(6)將上層ddh2o傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；

(7)裝好電泳系統(tǒng)，加入電泳緩沖液，上樣5-10μl；

(8)恒流40ma，溴酚藍(lán)跑出分離膠30min后，停止電泳；

(9)卸下膠板，剝離膠，染色，照膠。

實(shí)施例六、考馬斯亮藍(lán)染色

試劑配制

考馬斯亮藍(lán)r250染色液：0.25％考馬斯亮藍(lán)r250(w/v)，45％甲醇(v/v)，10％冰乙酸；

脫色液(1000ml)：100ml冰乙酸，250ml乙醇，蒸餾水補(bǔ)足至1000ml。

染色步驟

室溫染色45min-60min(或微波爐快染，高火20s，兩次)；用蒸餾水清洗3-5遍；加入脫色液，置于100rpm搖床上脫色，每20min更換一次脫色液至膠透明，脫色完成后，用umaxpowerlook2100xl掃描儀進(jìn)行照膠。

實(shí)施例七、酶促反應(yīng)

以ggpp為底物的酶促反應(yīng)

取實(shí)施例二、步驟(7)獲得的濃縮重組cps蛋白上清進(jìn)行酶促反應(yīng)。并以pmal-c2x空載體、pmal-c2x-atcps、pet32a(+)-smcps1轉(zhuǎn)化大腸桿菌transb(de3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，所破碎濃縮得到的重組蛋白上清進(jìn)行酶促反應(yīng)作為對(duì)照。

酶促反應(yīng)體系如下：

濃縮重組蛋白上清182μl

底物ggpp(200μm)18μl

反應(yīng)產(chǎn)物充分混合(槍頭吹打)，在室溫(25℃)、黑暗的環(huán)境下反應(yīng)2h；反應(yīng)結(jié)束后用正己烷抽提3次，每次加入0.5ml，棄有機(jī)相，留水相(留一層正己烷覆蓋水相，防止產(chǎn)物氧化)；然后用n2將水相中的正己烷徹底吹干，以免影響下一步的脫磷反應(yīng)。

脫磷反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)產(chǎn)物充分混合(槍頭吹打)，在37℃下反應(yīng)4h；脫磷后的產(chǎn)物再用正己烷抽提3次，每次加入0.5ml，將抽提所得有機(jī)相匯合在一起；用n2將提取液吹干，并加入60μl正己烷溶解，用于gc-ms分析。

以cpp為底物的酶促反應(yīng)

對(duì)twks進(jìn)行功能分析的酶促反應(yīng)是以經(jīng)cps酶催化ggpp所產(chǎn)生的產(chǎn)物(cpp)作為反應(yīng)底物，分析twks酶催化所得產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而鑒定twks功能。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

(1)配制如下酶促反應(yīng)體系，在室溫(25℃)黑暗條件下反應(yīng)2小時(shí)，使ggpp充分轉(zhuǎn)化成cpp；

濃縮重組ks蛋白上清182μl

底物ggpp(200μm)18μl

(2)向上述反應(yīng)混合液中加入等體積的twks酶，并補(bǔ)充mgcl2至10mm，在室溫(25℃)黑暗條件下，反應(yīng)過(guò)夜(12-16h)；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，體系用正己烷抽提3次(每次0.5ml)，所得正己烷相用n2吹干，然后加入60μl正己烷溶解進(jìn)行g(shù)c-ms分析。

實(shí)施例八、反應(yīng)產(chǎn)物gc-ms檢測(cè)

gc-ms分析條件為：取1μl的進(jìn)樣，無(wú)分流的模式下，50℃保持2min，20℃·min-1升至300℃，保持20min；進(jìn)樣口溫度250℃，離子源溫度250℃，電子能量70ev，對(duì)樣品進(jìn)行20-650m/z范圍掃描。gc-ms儀器為thermoscientific公司thermotrace1310/tsq8000gaschromatograph，色譜柱為db-5ms(30m×0.25mm)。(圖5、6)

實(shí)施例九、定點(diǎn)突變

采用全式金試劑盒fastmutagenesissystem對(duì)twcps2、twks進(jìn)行定點(diǎn)突變操作。

定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)

除突變位點(diǎn)外，兩條引物長(zhǎng)度大約25-30bp，5’端重疊區(qū)包含15-20bp，3’端延伸區(qū)包含至少10bp；突變位點(diǎn)位于兩條引物上，分別位于正向突變引物重疊區(qū)下游、緊鄰重疊區(qū)，反向突變引物5’端(見(jiàn)圖3)。

根據(jù)以上原則設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物，在‘dxdd’功能結(jié)構(gòu)域處將twcps2dtdc(311)突變成dtdd(311)，twcps2c311d即，將twksdadt(318)突變成dadd(318)，即twkst318d；在twks第608位氨基酸處，將氨基酸a突變成m，即twksa608m，定點(diǎn)突變引物序列見(jiàn)表4。

表4定點(diǎn)突變引物序列

定點(diǎn)突變反應(yīng)

定點(diǎn)突變反應(yīng)體系：

(1)pcr反應(yīng)條件：

(2)取10μlpcr產(chǎn)物，1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。即使觀察到多條擴(kuò)增條帶，如果目的條帶大小正確，可繼續(xù)用dmt消化及轉(zhuǎn)化反應(yīng)；

(3)加1μldmt酶于pcr產(chǎn)物中，混勻，37℃孵育1h；

(4)加入2-5μldmt酶消化產(chǎn)物于50μldmt感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；

(5)42℃準(zhǔn)確熱激45s，立即置于冰上2min；

(6)加入250μl平衡至室溫的lb培養(yǎng)基，37℃225rpm培養(yǎng)1h；

(7)取200μl菌液涂板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

(8)藍(lán)白菌落篩選及陽(yáng)性克隆的初步篩選，方法同2.2.3.1.4，并送樣測(cè)序驗(yàn)證能突變是否成功。

實(shí)施例十、酵母發(fā)酵

雷公藤二萜合酶真核表達(dá)載體構(gòu)建

采用雙酶切方法分別將二萜合酶基因twcps1、twges2及組合twcps3+twks、twcps3+twksa608m構(gòu)建到真核表達(dá)載體pesc-trp上，方法同3.2.1。先將twcps1、twges2、twks、twksa608mpcr產(chǎn)物(純化)及載體質(zhì)粒pesc-trp用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，采用neb公司t4dna連接酶定向連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、藍(lán)白菌落篩選及陽(yáng)性克隆的初步篩選，并送樣測(cè)序鑒定，得到經(jīng)測(cè)序核苷酸序列無(wú)突變重組質(zhì)粒pesctwcps1、pesctwges2、pesctwks及pesctwksa608m，再將twcps3pcr產(chǎn)物(純化)及重組質(zhì)粒pesctwks、pesctwksa608m用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，采用neb公司t4dna連接酶定向連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、藍(lán)白菌落篩選及陽(yáng)性克隆的初步篩選，并送樣測(cè)序鑒定，得到經(jīng)測(cè)序核苷酸序列無(wú)突變重組質(zhì)粒pesc-(twcps3+twks)、pesc-(twcps3+twksa608m)。見(jiàn)圖4，引物序列見(jiàn)表5。

表5構(gòu)建真核表達(dá)載體引物序列

酵母感受態(tài)制備

sd-his固體平板：sd-his+2％葡萄糖+4％agar；不加agar則成為相應(yīng)液體培養(yǎng)基；sd-his-trp固體平板：sd-his-trp+2％葡萄糖+4％agar；不加agar則成為相應(yīng)液體培養(yǎng)基。

by-t20酵母菌是在缺陷型酵母菌株by4741(基因型：matahis3δ1leu2δ0met15δ0ura3δ0)基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，致使其高效合成ggpp，并能回補(bǔ)his，故將by-t20酵母菌涂布sd-his(缺his)固體平板，30℃倒置培養(yǎng)72h。

采用zymoresearchfrozen-ezyeasttransformationii試劑盒做酵母感受態(tài)細(xì)胞：

(1)從sd-his平板上挑取新活化的單菌落，接種于10mlsd-his液體培養(yǎng)基中，30℃下振蕩培養(yǎng)至od600＝0.8-1.0左右；

(2)室溫，500g離心4min，去上清；

(3)加入10mlfrozen-ezsolution1懸浮菌體，室溫，500g離心4min，去上清；

(4)加入1mlfrozen-ezsolution2懸浮菌體，分裝至滅菌的1.5mlep管中，每管50μl；

(5)禁止用液氮速凍感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)緩慢降溫至-70℃(4℃，1h；-20℃，1h；-40℃，1h；-70℃保存)。轉(zhuǎn)化

(1)取0.2-1μg重組質(zhì)粒(少于5μl)與50μl感受態(tài)細(xì)胞混合；

(2)加入500μlfrozen-ezsolution3，劇烈混勻；

(3)30℃孵育45min，期間在此混勻2-3次；

(4)取50-150μl孵育的菌液，涂布相應(yīng)缺陷型sd平板(sd-his-trp)，晾干后，置于30℃倒置培養(yǎng)48-96h。

發(fā)酵

酵母質(zhì)粒提取及鑒定

挑取sd-his-trp固體平板上長(zhǎng)出來(lái)的單菌落，置于10mlsd-his-trp液體培養(yǎng)基中，30℃250rpm48h；提取質(zhì)粒，用特異性引物pcr驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入by-t20酵母菌。

酵母質(zhì)粒提取(天根公司酵母質(zhì)粒小提試劑盒)：

(1)柱平衡：向吸附柱cp2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(當(dāng)天處理當(dāng)天使用)；

(2)取1-5ml酵母培養(yǎng)物，12000rpm離心1min，盡量吸除上清(菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體收集到一個(gè)離心管中)；

(3)向菌體中加入250μl溶液yp1(已加入rnasea)重懸沉淀，徹底懸浮菌體，加入直徑為0.45-0.55mm的酸洗玻璃珠，渦旋振蕩10min；

(4)向管中加入250μl溶液yp2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，使菌體充分混勻，室溫放置5-10min(避免劇烈震蕩，以免污染基因組dna)；(5)向管中加入350μl溶液yp3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm離心20min；取上清部分，再次離心12000rpm離心20min，以得到無(wú)微小白色沉淀的上清液；

(6)小心將上清液加入吸附柱cp2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cp2放入收集管中；

(7)向吸附柱cp2中加入500μl緩沖液pd，12000rpm離心1min，倒掉廢液；

(8)向吸附柱cp2中加入600μl漂洗液(已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cp2放入收集管中；

(9)重復(fù)步驟8；

(10)將吸附柱cp2放入收集管中置于12000rpm離心2min，去除殘余的漂洗液；

(11)將吸附柱cp2置于一個(gè)干凈的1.5mlep管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100μlddh2o，室溫放置2min，12000rpm離心2min將質(zhì)粒溶液收集到ep管中，保存-20℃。

所提取得質(zhì)粒用于pcr鑒定重組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入by-t20酵母菌中。

pcr反應(yīng)體系：

pcr反應(yīng)條件：

(備注：＊表示pcr產(chǎn)物的片段＞3kb，且每加1kb則延伸溫度延長(zhǎng)1min)

1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)目的片段條帶，則可以證明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入菌體。

半乳糖誘導(dǎo)發(fā)酵

誘導(dǎo)型sd-his-trp液體培養(yǎng)基：sd-his-trp+2％半乳糖(過(guò)濾除菌)(1)將pcr鑒定的陽(yáng)性菌液(即重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入的by-t20酵母菌)，轉(zhuǎn)接入50mlsd-his-trp液體培養(yǎng)基中，30℃250rpm培養(yǎng)12-16h；(2)室溫5000g5min離心收集菌體，轉(zhuǎn)接到100ml誘導(dǎo)型sd-his-trp液體培養(yǎng)基中，30℃250rpm誘導(dǎo)72h；

發(fā)酵產(chǎn)物提取

目標(biāo)成分為萜類化合物，脂溶性，易溶于正己烷，因此選取正己烷為溶劑萃取目標(biāo)萜類化合物。萃取步驟如下：

(1)收集發(fā)酵完成菌液，加入等體積的正己烷；

(2)超聲破菌1h，期間多次振蕩混搖；

(3)分液漏斗萃取兩次；混合兩次的萃取液，加入適量的無(wú)水硫酸鈉(120℃烘干30min)，邊加邊搖，出去萃取液的水分；

(4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干，

(5)吸取濃縮液，過(guò)0.22μmptfe針頭濾器，過(guò)濾液儲(chǔ)存于液相小瓶中，封口膜密閉，保存于4℃冰箱。

提取物gc-ms檢測(cè)

gc-ms分析條件為：取1μl的進(jìn)樣，無(wú)分流的模式下，50℃保持2min，20℃·min-1升至300℃，保持20min；進(jìn)樣口溫度250℃，離子源溫度250℃，電子能量70ev，對(duì)樣品進(jìn)行20-650m/z范圍掃描。gc-ms儀器為thermoscientific公司thermotrace1310/tsq8000gaschromatograph，色譜柱為db-5ms(30m×0.25mm)。(圖7、8、9)

上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。

序列表

<110>首都醫(yī)科大學(xué)

<120>雷公藤二萜合酶twcps1在制備松香烷型二萜化合物中的應(yīng)用

<160>24

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2792

<212>dna

<213>tripterygiumwilfordii.hook.f.

<400>1

atatgcatagtttgttaatgaaaaaggtgatcatgtactcctctcaaacaacccacgtct60

tctcttcccctctccactgcaccatcccaaaatcttcttccttcttcctcgatgccccgg120

tggtgcgtctccattgtctaagtggccacggtgctaagaagaaacgacttcactttgaca180

ttcaacagggaagaaatgctataagcaagactcacactccagaagacttatatgccaaac240

aggaatacagtgtgccagagattgtgaaggatgacgacaaggaagaggaagtggtcaaga300

ttaaagaacatgttgacatcattaagtccatgttgagctcaatggaggatggagagatta360

gcatttcagcttatgacactgcttgggttgcactcatacaagacattcacaacaatggtg420

ctcctcaattcccatcgagcctgctctggattgctgaaaatcagctaccggacgggtcat480

ggggtgacagtcgcgtatttttagcatttgatcgaataatcaatacattagcttgtgttg540

ttgctctcaagtcatggaatgttcaccctgataaatgcgaaagaggaatctcctttttga600

aagaaaatataagcatgctagaaaaagacgattccgagcacatgcttgttggctttgaat660

ttggtttccctgtgttgcttgacatggctcgaagattaggcatcgatgttcctgatgatt720

cgccattcttgcaagctatctacgtccagagagacctgaaactcaaaaggataccaaaag780

acatattgcacaatgtgcccacaacactgctccatagcttggaagcaataccagacctgg840

attggacaaagcttctaaaactacaatgtcaagatggttcactcttgttctccccatcct900

ccactgccatggcattcatcaacactaaggacgaaaactgcttgagatatctaaattacg960

tggtccagagattcaatggtggagccccaacggtttacccctacgacttgtttgagcaca1020

attgggcggttgatcgcctacaacgcttgggaatctcaagattttttcagccagagatta1080

gagaatgtatgagctatgtttacaggtattggactaaagatgggatcttctgcacaagaa1140

attcacgggttcatgatgttgacgatacagccatgggattcaggttgcttagattgcacg1200

gctatgaagttcaccctgatgcatttaggcagtttaagaagggatgcgagtttatatgct1260

atgaaggccaatcgcatccgacagtcactgtaatgtataacctgtacagggcttctcagt1320

tgatgtttcctgaagaaaagattcttgatgaggccaagcagttcacagaaaaattcctgg1380

gagaaaaacgatctgctaataagctcctagataagtggatcataactaaggatctgccag1440

gggaggtggggttcgcattggatgttccgtggtatgtatccttgcctagagtagaggcaa1500

gattcttcattcaacactacggcggcgaagatgatgtgtggcttgacaaggccctttaca1560

ggatgccctacgttaacaacaatgtgtatctagagctagcaaagcttgattacaactatt1620

gccaggcattgcatggaaccgaatggggccgtatacaaaagtggtatgaagaatgtaaac1680

caagagactttgggataagcagagaatgccttctccgtgcatattttatggctgctgcca1740

gtatatttgagccagaaaggtcgatggagcgcctcgcctgggctaagactgcgatcttgc1800

tggaaattatagtgtcttatttcaatgaggttggaaattccacagagcagaggatagcct1860

tcacaactgaattttcgatacgtgcaagtcctatgggaggctacataaatggaagaaagt1920

tagataagattggtacgacccaagaacttattcagatgctactcgcaaccatcgatcagt1980

tttcgcaggatgcattcgcggcatatgatcacgacattactcgccatttacacaactctt2040

ggaaaatgtggctgctaaagtggcaagaagaaggagatagatggctgggagaagcagagt2100

tagtgatacaaactataaatctcatggcggatcataagatcgctgagaagctctttatgg2160

gacatactaactatgaacaactcttcagcctcaccaacaaagtttgctatagtcttggtc2220

atcatgagctccaaaacaacagagaactggagcatgacatgcaaagactagtgcagttgg2280

tgctgacgaattcctcagatggtatcgactctgatatcaagaaaacgtttctcgcagtcg2340

caaagagattctactatactgcctttgtcgaccctgagaccgtgaatgtccacattgcca2400

aagtactctttgagagagtagattaacactgttgatgatgatcttgattttcaaatattg2460

agtagtactactacttgtgaacaaaatcttatgggtgctatgaacgaagaacaacaatat2520

ggacgaagacaagtagatttaattttatttgctaatggtcagtacatagggatgtacctc2580

tttcaaccatgtagcaacttgctgccttccctgccttactctcacgcttcgtaggggaaa2640

aggtctcaaggatatatatgagaatgaagtctgttgtgtatgtaactgactgaaagtcga2700

ttttcgatataaaaagtaggcatggatgatggatcgttcatacatggaaagttcctttct2760

ccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2792

<210>2

<211>807

<212>prt

<213>tripterygiumwilfordii.hook.f.

<400>2

methisserleuleumetlyslysvalilemettyrserserglnthr

151015

thrhisvalpheserserproleuhiscysthrileprolysserser

202530

serphepheleuaspalaprovalvalargleuhiscysleusergly

354045

hisglyalalyslyslysargleuhispheaspileglnglnglyarg

505560

asnalaileserlysthrhisthrprogluaspleutyralalysgln

65707580

glutyrservalprogluilevallysaspaspasplysglugluglu

859095

valvallysilelysgluhisvalaspileilelyssermetleuser

100105110

sermetgluaspglygluileserileseralatyraspthralatrp

115120125

valalaleuileglnaspilehisasnasnglyalaproglnphepro

130135140

serserleuleutrpilealagluasnglnleuproaspglysertrp

145150155160

glyaspserargvalpheleualapheaspargileileasnthrleu

165170175

alacysvalvalalaleulyssertrpasnvalhisproasplyscys

180185190

gluargglyileserpheleulysgluasnilesermetleuglulys

195200205

aspaspsergluhismetleuvalglypheglupheglypheproval

210215220

leuleuaspmetalaargargleuglyileaspvalproaspaspser

225230235240

propheleuglnalailetyrvalglnargaspleulysleulysarg

245250255

ileprolysaspileleuhisasnvalprothrthrleuleuhisser

260265270

leuglualaileproaspleuasptrpthrlysleuleulysleugln

275280285

cysglnaspglyserleuleupheserproserserthralametala

290295300

pheileasnthrlysaspgluasncysleuargtyrleuasntyrval

305310315320

valglnargpheasnglyglyalaprothrvaltyrprotyraspleu

325330335

phegluhisasntrpalavalaspargleuglnargleuglyileser

340345350

argphepheglnprogluileargglucysmetsertyrvaltyrarg

355360365

tyrtrpthrlysaspglyilephecysthrargasnserargvalhis

370375380

aspvalaspaspthralametglypheargleuleuargleuhisgly

385390395400

tyrgluvalhisproaspalapheargglnphelyslysglycysglu

405410415

pheilecystyrgluglyglnserhisprothrvalthrvalmettyr

420425430

asnleutyrargalaserglnleumetpheprogluglulysileleu

435440445

aspglualalysglnphethrglulyspheleuglyglulysargser

450455460

alaasnlysleuleuasplystrpileilethrlysaspleuprogly

465470475480

gluvalglyphealaleuaspvalprotrptyrvalserleuproarg

485490495

valglualaargphepheileglnhistyrglyglygluaspaspval

500505510

trpleuasplysalaleutyrargmetprotyrvalasnasnasnval

515520525

tyrleugluleualalysleuasptyrasntyrcysglnalaleuhis

530535540

glythrglutrpglyargileglnlystrptyrgluglucyslyspro

545550555560

argasppheglyileserargglucysleuleuargalatyrphemet

565570575

alaalaalaserilephegluprogluargsermetgluargleuala

580585590

trpalalysthralaileleuleugluileilevalsertyrpheasn

595600605

gluvalglyasnserthrgluglnargilealaphethrthrgluphe

610615620

serileargalaserprometglyglytyrileasnglyarglysleu

625630635640

asplysileglythrthrglngluleuileglnmetleuleualathr

645650655

ileaspglnpheserglnaspalaphealaalatyrasphisaspile

660665670

thrarghisleuhisasnsertrplysmettrpleuleulystrpgln

675680685

glugluglyaspargtrpleuglyglualagluleuvalileglnthr

690695700

ileasnleumetalaasphislysilealaglulysleuphemetgly

705710715720

histhrasntyrgluglnleupheserleuthrasnlysvalcystyr

725730735

serleuglyhishisgluleuglnasnasnarggluleugluhisasp

740745750

metglnargleuvalglnleuvalleuthrasnserseraspglyile

755760765

aspseraspilelyslysthrpheleualavalalalysargphetyr

770775780

tyrthralaphevalaspprogluthrvalasnvalhisilealalys

785790795800

valleuphegluargvalasp

805

<210>3

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgcggatccatgcatagtttgttaatgaaaaaggtg36

<210>4

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gcactgcagttaatctactctctcaaagagtactttgg38

<210>5

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cgcggatccatgtctcttcagtatcatgttctaaactcc39

<210>6

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gcactgcagctagactttttgaaacaagactttggag37

<210>7

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cgcggatccatgtctatcaaccttcgctcctc32

<210>8

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cgcgtcgactcaagttaaagattcttcctgtaagc35

<210>9

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cgcagcttcgcgataccgatgataccgccatg32

<210>10

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tcatcggtatcgcgaagctgcgaatttcttgtccag36

<210>11

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gagatattttccgatgctgacgattgtgccatggc35

<210>12

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

atcgtcagcatcggaaaatatctcttcatctccctgc37

<210>13

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gttggatttgctaaagtctatgttaagggaag32

<210>14

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

atagactttagcaaatccaaccacatctcaat32

<210>15

<211>35

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