本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及兩株嗜熱菌株合成長鏈二元酸的方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

長鏈二元酸是一種含有10個及以上碳原子的脂肪族二羧酸(簡稱dcn)，作為化工中重要的中間原料，用于合成麝香、共聚酰胺熱溶膠、尼龍工程塑料、高溫電介質(zhì)、耐寒增塑劑、高級潤滑油、高級油漆和涂料等精細(xì)化工產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于化工、輕工、農(nóng)藥、醫(yī)藥、液晶材料等領(lǐng)域。由于長鏈二元酸在自然界中并不單獨存在，所以長鏈二元酸的合成一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。

長鏈二元酸主要合成方法為化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法的條件苛刻，成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重，限制了其商業(yè)發(fā)展。生物法工藝以來源豐富的石蠟或脂肪酸為原料，經(jīng)由微生物發(fā)酵得到長鏈二元酸，條件溫和，過程環(huán)保，是綠色長鏈二元酸，多種優(yōu)勢的存在使生物法替代化學(xué)法成為必然趨勢。由于在夏季或者高溫地區(qū)，難以將發(fā)酵溫度維持在30℃左右。因此，選育出能夠在高溫條件下保持其產(chǎn)酸能力的菌株就有著十分重要的意義。

目前未見有報道關(guān)于嗜熱微生物合成長鏈二元酸的方法與應(yīng)用方面的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供嗜熱微生物合成制備長鏈二元酸的方法。

1本發(fā)明提出嗜熱菌株合成長鏈二元酸的應(yīng)用方法，包括嗜熱微生物篩選、分離及鑒定的方法以及嗜熱微生物合成制備長鏈二元酸的方法，

具體步驟如下：

(1)采集的土壤樣本則直接采用稀釋涂布法在正十二烷選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，于30℃、37℃和45℃水浴中培養(yǎng)3～5天。根據(jù)菌落的形態(tài)選擇有差別的單菌落接種到對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，同樣溫度下水浴搖床培養(yǎng)3～5天。

(2)選擇能夠在正十二烷選擇培養(yǎng)基，即以烷烴作為唯一碳源的培養(yǎng)基上能夠生長的菌株，在含有甲基紅指示劑的指示培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

(3)同時，挑取選擇培養(yǎng)基上能夠生長的單菌落，接種于不添加甲基紅指示劑的50ml指示培養(yǎng)基中，分別在30℃、37℃、45℃條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的第一天起，每天取出1ml培養(yǎng)液，并滴加1～2滴甲基紅指示劑，記錄培養(yǎng)4天培養(yǎng)過程中的顏色變化情況。

(4)挑選滴入指示劑后發(fā)生顏色變化明顯的菌株，進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵、生理生化及分子鑒定實驗，最終確定兩株菌株分別為食樹脂假單胞菌及類產(chǎn)堿假單胞菌。

(5)將篩選出的產(chǎn)酸菌株接入50ml種子培養(yǎng)基中，分別在30℃、37℃、45℃下培養(yǎng)48h。

(6)36h擴(kuò)大培養(yǎng)過后，加入15％已滅菌的正十二烷，進(jìn)入產(chǎn)酸期。產(chǎn)酸期持續(xù)4天，每隔12h或24h調(diào)整ph為7.5。

(7)取經(jīng)離心、過濾后的發(fā)酵清液30ml，分別將15ml加入到2支15ml離心管中，并通過滴定法和分光光度法兩種方法進(jìn)行十二烷二元酸濃度的檢測。

本發(fā)明優(yōu)點在于

1.本發(fā)明實現(xiàn)了篩選出兩株能夠在高溫條件下，利用烷烴類碳源合成長鏈二元酸的新菌株(一般發(fā)酵溫度維持在30℃)。

2.本發(fā)明篩選出的高溫環(huán)境中生長的嗜熱微生物在菌體酶活性、對環(huán)境的適應(yīng)性等方面較正常菌株具有突出優(yōu)勢，解決了發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸在高溫環(huán)境下的難以進(jìn)行的難題。

3.本發(fā)明的工藝簡單，經(jīng)由微生物發(fā)酵得到長鏈二元酸，條件溫和，過程環(huán)保，是綠色長鏈二元酸，適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

4.本發(fā)明制備的長鏈二元酸在國內(nèi)生產(chǎn)起步較晚，以它為原材料合成的下游高檔精細(xì)化工類產(chǎn)品目前主要以進(jìn)口為主。長鏈二元酸是不可替代的原料，在國內(nèi)為節(jié)約能源、使生產(chǎn)能夠全年連續(xù)進(jìn)行創(chuàng)造更多經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖130℃下液體搖瓶培養(yǎng)取樣滴加甲基紅指示劑結(jié)果

圖237℃下液體搖瓶培養(yǎng)取樣滴加甲基紅指示劑結(jié)果

圖345℃下液體搖瓶培養(yǎng)取樣滴加甲基紅指示劑結(jié)果

圖42號、6號菌株16srdna電泳結(jié)果

圖5篩選出的2號、6號菌株生長曲線測定結(jié)果

圖6十二烷二元酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

具體實施方式

下面通過實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。

實施例1：

(1)采集的土壤樣本則直接采用稀釋涂布法在正十二烷選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，于30℃水浴中培養(yǎng)3～5天。根據(jù)菌落的形態(tài)選擇有差別的單菌落接種到對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，同樣溫度下水浴搖床培養(yǎng)3～5天。

(2)選擇能夠在正十二烷選擇培養(yǎng)基即以烷烴作為唯一碳源的培養(yǎng)基上能夠生長的菌株，在含有甲基紅指示劑的指示培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

(3)同時，挑取選擇培養(yǎng)基上能夠生長的單菌落，接種于不添加甲基紅指示劑的50ml指示培養(yǎng)基中，在30℃條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的第一天起，每天取出1ml培養(yǎng)液，并滴加1～2滴甲基紅指示劑，記錄培養(yǎng)4天培養(yǎng)過程中的顏色變化情況。(見圖1)

實施例2：

(1)采集的土壤樣本則直接采用稀釋涂布法在正十二烷選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，于37℃水浴中培養(yǎng)3～5天。根據(jù)菌落的形態(tài)選擇有差別的單菌落接種到對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，同樣溫度下水浴搖床培養(yǎng)3～5天。

(2)選擇能夠在正十二烷選擇培養(yǎng)基即以烷烴作為唯一碳源的培養(yǎng)基上能夠生長的菌株，在含有甲基紅指示劑的指示培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

(3)同時，挑取選擇培養(yǎng)基上能夠生長的單菌落，接種于不添加甲基紅指示劑的50ml指示培養(yǎng)基中，分別在37℃條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的第一天起，每天取出1ml培養(yǎng)液，并滴加1～2滴甲基紅指示劑，記錄培養(yǎng)4天培養(yǎng)過程中的顏色變化情況。(見圖2)

實施例3：

(1)采集的土壤樣本則直接采用稀釋涂布法在正十二烷選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，于45℃水浴中培養(yǎng)3～5天。根據(jù)菌落的形態(tài)選擇有差別的單菌落接種到對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，同樣溫度下水浴搖床培養(yǎng)3～5天。

(2)選擇能夠在正十二烷選擇培養(yǎng)基即以烷烴作為唯一碳源的培養(yǎng)基上能夠生長的菌株，在含有甲基紅指示劑的指示培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

(3)同時，挑取選擇培養(yǎng)基上能夠生長的單菌落，接種于不添加甲基紅指示劑的50ml指示培養(yǎng)基中，分別在45℃條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的第一天起，每天取出1ml培養(yǎng)液，并滴加1～2滴甲基紅指示劑，記錄培養(yǎng)4天培養(yǎng)過程中的顏色變化情況。(見圖3)

本實驗中所用的樣品——土壤、泉水以及沉積物樣本均采自50℃～90℃的高溫環(huán)境下，其中所生活的均是嗜熱微生物，而嗜熱微生物在菌體酶活性及對環(huán)境的適應(yīng)能力方面較之于常溫菌株有著一定的優(yōu)越性。因此，從這些樣本中篩選出能夠利用烷烴并且可以轉(zhuǎn)化為長鏈二元酸的菌株，尤其是能夠在較高溫度下依舊能夠保持其發(fā)酵能力的菌株，對于降低工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸的成本并解決在夏季及高溫地區(qū)難以進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的問題具有重要的價值。

以下通過實施例5、6進(jìn)一步制備長鏈二元酸。

實施例4：

挑取實施例1的單菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后對其生理生化特征分析進(jìn)行初步分類，檢驗細(xì)菌能否在以烷烴為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長、v-p反應(yīng)類型以及是否產(chǎn)氨，下表為挑選出的2號、6號菌株的實驗記錄，包括生理生化實驗結(jié)果(見表1)，并對其進(jìn)行pcr擴(kuò)增其16srdna(見圖4)和測序分析(見表2)。

表12號、6號菌株形態(tài)觀察及生理生化實驗記錄

表22號、6號菌株測序分析結(jié)果

實施例5：

(1)將實施例1篩選出的產(chǎn)酸菌株接入50ml種子培養(yǎng)基中，分別在30℃、37℃、45℃下培養(yǎng)48h。

(2)36h擴(kuò)大培養(yǎng)過后，加入15％已滅菌的正十二烷，進(jìn)行菌株生長曲線測定(見圖5)。進(jìn)入產(chǎn)酸期產(chǎn)酸期持續(xù)4天，每隔12h或24h時調(diào)整ph為7.5。

實施例6：

(1)將實施例2篩選出的產(chǎn)酸菌株接入50ml種子培養(yǎng)基中，分別在30℃、37℃、45℃下培養(yǎng)48h。

(2)36h擴(kuò)大培養(yǎng)過后，加入15％已滅菌的正十二烷，進(jìn)入產(chǎn)酸期。產(chǎn)酸期持續(xù)4天，每隔12h或24h調(diào)整ph為7.5。

(3)取經(jīng)離心、過濾后的發(fā)酵清液30ml，分別將15ml加入到2支15ml離心管中，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物十二烷二元酸測定(見圖6)。