本發(fā)明屬于桃樹(shù)育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)與桃樹(shù)流膠病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

桃是原產(chǎn)我國(guó)西部的薔薇科核果類(lèi)果樹(shù)，也是世界栽培范圍最廣泛的果樹(shù)之一。桃流膠病是影響桃產(chǎn)業(yè)健康有序發(fā)展的重要因素之一，給我國(guó)桃生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害。

桃樹(shù)流膠病由真菌多主葡萄糖殼菌(Botryosphaeria dothidea)侵染所致，主要發(fā)生在樹(shù)體主干和側(cè)枝，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)發(fā)展到結(jié)果枝及果實(shí)。發(fā)病初期皮孔流出淡黃色透明膠，膠凝結(jié)后漸變紅褐色，病部稍腫，皮層及木質(zhì)部變褐腐朽，腐生其他雜菌，樹(shù)勢(shì)逐漸衰弱，葉小而黃，果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)枝干枯死，整株死亡，果實(shí)發(fā)病由果核內(nèi)分泌黃色膠質(zhì)，溢出果面，病部硬化，嚴(yán)重時(shí)不能正常生長(zhǎng)發(fā)育(趙密珍等，1996；馬瑞娟等，2002；李智，2014)。

桃流膠病在我國(guó)南北方產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，但在長(zhǎng)江流域及以南的高溫多雨地區(qū)尤為嚴(yán)重，美國(guó)、日本等也有相關(guān)研究報(bào)道。調(diào)查顯示，2003年我國(guó)重慶部分地區(qū)桃流膠病平均發(fā)病率66.8％，2005、2006年北京大興區(qū)桃流膠病平均發(fā)病率為93.73％和91.05％，2008年廣東省桃樹(shù)種植區(qū)連平縣桃流膠病發(fā)病率達(dá)100％。2009年湖北孝感、仙桃等地部分種植品種流膠病發(fā)病率達(dá)100％(陳彥等，2011；張平等，2013)。

桃流膠病的發(fā)生主要由生物和非生物因素造成，其發(fā)病程度與品種、栽培環(huán)境、栽培技術(shù)管理、樹(shù)齡等密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)于桃流膠病的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：(1)誘導(dǎo)桃流膠病的病原菌類(lèi)型及侵染方式(Britton and Hendrix，1982；Weaver et等，1974；Wang等，2011)；(2)發(fā)病后生理生化變化(李智，2014；俞明亮等，2001)；(3)發(fā)病后的防治措施(楊文，2011；Li等，1995)；(4)植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)流膠病的影響(Li等，2014)，品種抗性方面也有相關(guān)報(bào)道。

楊文(2011)分析了6個(gè)桃品種對(duì)流膠病的敏感性，發(fā)現(xiàn)‘春雪’易感，‘慶豐’和‘倉(cāng)方早生’中感，‘霞暉5號(hào)’、‘大紅袍’和‘鄂桃1號(hào)’敏感性最弱。趙密珍等(1996)調(diào)查了273個(gè)桃品種的流膠病，發(fā)現(xiàn)絕大部分品種不抗流膠病，極少數(shù)品種具有高抗能力；高抗品種有天津水蜜、白沙、皺葉黃露、大紅花，中抗品種有早甜桃、潤(rùn)州水蜜、金山水蜜、上山大玉露、大久保、岡山100號(hào)、西野、岡山白。油桃、蜜桃、硬肉桃感病稍輕，其次為水蜜桃品種群、黃桃品種群、蟠桃品種群感病重。

目前，基于全基因組重測(cè)序的SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及構(gòu)建高密度SNP芯片目前已應(yīng)用到桃果實(shí)香氣物質(zhì)的合成及冷害的遺傳機(jī)理研究中，對(duì)不同桃品種自身流膠病抗性的分子機(jī)理研究仍為空白，有必要通過(guò)分子育種手段，挖掘定位抗病基因，選擇親本，為新型抗病品種選育提供依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)與桃樹(shù)流膠病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，該SNP分子標(biāo)記位于桃的第6條連鎖群上第26.7區(qū)段，位點(diǎn)為SNP_IGA_627726，對(duì)應(yīng)染色體物理位置為7604716，與桃的流膠病的發(fā)病率有顯著相關(guān)性，具有良好的多態(tài)性，利用該SNP分子標(biāo)記對(duì)不同桃品種或品系進(jìn)行抗流膠病檢測(cè)，準(zhǔn)確率高，利于提高桃樹(shù)的育種效率，加快實(shí)現(xiàn)高溫高濕地區(qū)桃樹(shù)抗流膠病新品種的選育。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一個(gè)與桃樹(shù)流膠病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，其位于桃的第6條連鎖群上，該SNP分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，共121bp，其中，n代表A或G，且第61位堿基為A或G。

進(jìn)一步，所述SNP標(biāo)記的GG基因型個(gè)體的流膠病顯著低于AG型個(gè)體。

本發(fā)明還提供一種用于擴(kuò)增所述SNP分子標(biāo)記的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明所述的與桃樹(shù)流膠病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記用于桃樹(shù)品種或品系選育中。

一種獲得與桃樹(shù)流膠病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟：

1)構(gòu)建高密度全基因組SNP芯片

以具有抗病性的品種和感病性的品種為親本，進(jìn)行雜交，獲得雜交F₁代群體；以親本及雜交F₁代群體的基因組DNA為模板，以高密度SNP芯片為探針，探針與目標(biāo)基因組DNA片段分別進(jìn)行雜交，分別獲得親本及雜交F₁代群體的高密度全基因組SNP芯片，測(cè)定基因型，進(jìn)行基因分型數(shù)據(jù)處理；

2)構(gòu)建F₁連鎖圖譜

進(jìn)行SNP質(zhì)量控制，即去掉所檢測(cè)樣本中基因型相同的、缺失率大于0.1、及不滿(mǎn)足分離比檢驗(yàn)(p<0.01)的SNP位點(diǎn)，得到多態(tài)性SNP位點(diǎn)，用于構(gòu)建該F₁群體的遺傳連鎖圖譜；

3)QTL定位

用QTL分析軟件及復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)雜交F₁代群體的流膠病表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL初級(jí)定位和效應(yīng)檢測(cè)；

設(shè)置窗口為0.5cM，模型選擇向前/向后回歸分析方法，運(yùn)行參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，進(jìn)行QTL定位；

采用LOD閾值設(shè)置為2.5，QTL置信區(qū)間為L(zhǎng)OD值從峰值下降2對(duì)應(yīng)的區(qū)間，同時(shí)計(jì)算每個(gè)QTL對(duì)表型的貢獻(xiàn)率和遺傳效應(yīng)，將影響桃樹(shù)流膠病的主效QTL進(jìn)行初步定位，再作進(jìn)一步加密及標(biāo)記篩選，最終確定桃樹(shù)流膠病發(fā)病率緊密相關(guān)的位點(diǎn)。

優(yōu)選地，步驟1)中，所述的高密度SNP芯片為桃國(guó)際通用的RosBREED_Peach_10K 11494376的SNP芯片。

優(yōu)選地，步驟1)中，所述的抗病性的品種為‘錦繡黃桃’，所述的感病性的品種為‘玉露蟠桃’。

利用所述與桃樹(shù)流膠病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記檢測(cè)桃樹(shù)流膠病的方法，包括以下步驟：

1)提取待測(cè)桃樹(shù)的基因組DNA；

2)利用權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，將所述待測(cè)桃樹(shù)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果；

4)基于所述測(cè)序結(jié)果，確定所述待測(cè)桃樹(shù)的所述SNP標(biāo)記的基因型；

5)根據(jù)步驟4)的SNP標(biāo)記的基因型，判定所述待測(cè)桃樹(shù)的流膠病抗性，所述SNP標(biāo)記位點(diǎn)的基因型為AG時(shí)，桃樹(shù)流膠病發(fā)病率較高，基因型為GG時(shí)，桃樹(shù)流膠病發(fā)病率較低或不發(fā)病。

本發(fā)明研究人員對(duì)桃樹(shù)流膠病發(fā)生狀況進(jìn)行了多年調(diào)查，發(fā)現(xiàn)‘錦繡黃桃’在栽培過(guò)程中表現(xiàn)出高抗的特性，并采用此材料配置了多個(gè)雜交體系，其中，‘錦繡黃桃’ב玉露蟠桃’的雜交后代已出現(xiàn)流膠病性狀的性狀分離，通過(guò)構(gòu)建該群體的高密度遺傳圖譜，找出流膠病性狀相關(guān)基因，并定位在遺傳圖譜上，從而促進(jìn)桃樹(shù)抗流膠病育種的進(jìn)程。

本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記可用于檢測(cè)桃品種、品系或育種材料的流膠病抗病性。

本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記位于桃的第6條連鎖群上，基于桃全基因組序列信息及國(guó)際通用的9K SNP芯片，該位點(diǎn)為RosBREED_Peach_10K11494376array上的SNP_IGA_627726位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)連鎖群上的6：26.7區(qū)段，對(duì)應(yīng)染色體物理位置7604716。

本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記與桃的流膠病有顯著相關(guān)性，具有良好的多態(tài)性，對(duì)不同桃品種或品系的抗流膠病的檢測(cè)具有重要應(yīng)用價(jià)值，該分子標(biāo)記在不同桃品種或品系流膠病病情鑒定中的應(yīng)用，為抗流膠病品種選擇過(guò)程中早期親本選擇及雜交后期后代選擇提供了一個(gè)新的鑒定方法，提高流膠病抗性檢測(cè)的準(zhǔn)確性，提高育種效率，同時(shí)還能夠克服桃樹(shù)常規(guī)育種時(shí)周期長(zhǎng)，占地面積大、育種效率低等問(wèn)題。

本發(fā)明的有益效果：

1)本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記與桃樹(shù)流膠病抗性相關(guān)的QTL緊密連鎖，與桃流膠病有顯著相關(guān)性，具有良好的多態(tài)性，利用該SNP分子標(biāo)記對(duì)不同桃品種或品系進(jìn)行抗流膠病檢測(cè)，準(zhǔn)確率高，利于提高桃樹(shù)的育種效率，加快實(shí)現(xiàn)高溫高濕地區(qū)桃樹(shù)抗流膠病新品種的選育。

2)本發(fā)明在篩選SNP分子標(biāo)記時(shí)，以具有抗病性的品種和感病性的品種為親本，后代在流膠病抗性上分離度高，有利于進(jìn)行QTL定位。

3)利用本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記對(duì)不同桃品種或品系進(jìn)行抗流膠病檢測(cè)，在桃樹(shù)的育苗期就可以準(zhǔn)確檢測(cè)出是否為抗流膠病基因型，便于早期篩選，不需等到發(fā)病后才能采取相關(guān)措施，縮短育種周期，降低育種成本，同時(shí)還能克服桃樹(shù)常規(guī)育種時(shí)占地面積大、育種效率低等問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的不同基因型發(fā)病情況對(duì)照。

圖2為本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記的位點(diǎn)示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例與桃樹(shù)流膠病抗性相關(guān)的QTL緊密連鎖的SNP分子標(biāo)記的獲得，包括以下步驟：

1)構(gòu)建F₁雜交群體

利用抗流膠病強(qiáng)的優(yōu)良鮮食黃肉桃栽培品種‘錦繡黃桃’與抗流膠病弱的蟠桃品種‘玉露蟠桃’為親本構(gòu)建F₁群體，最終得到80份雜交后代，且后代群體存在流膠病性狀分離。

2)提取基因組DNA

用Qiagen DNeasy mini Kit試劑盒提取2個(gè)桃親本及80個(gè)雜交后代的基因組DNA，按照試劑盒提供方法，具體如下：

①稱(chēng)取0.1g冷凍葉片，在液氮中快速研磨，置于2ml滅菌的離心管中。

②加400μl AP1緩沖液和4μl RNase A到上述離心管中，渦旋混勻，65℃水浴10min，上下混勻2-3次。

③加130μl AP2緩沖液到混合液中混勻，冰浴5min，14000rpm 15-25℃離心5min。

④吸取上清到QIAshredder離心柱中，14000rpm，離心2min，轉(zhuǎn)移回收管中的液體到2ml新管中。

⑤加1.5倍AP3/E緩沖液，混勻，吸取650μl混合液(含沉淀)加入到置于2ml回收管的新的DNeasy離心柱中(2ml回收管)，8000rpm離心1min，倒掉回收管中液體。

⑥將DNeasy Mini離心柱置于新的2ml回收管中，加入500μl AW緩沖液，8000rpm離心1min，棄管中液體，留回收管。

⑦加500μl Buffer AW到DNesay Mini離心管，14000rpm，離心2min，棄回收管。

⑧將DNeasy Mini離心柱放入1.5ml離心管中，加50μl AE緩沖液于過(guò)濾膜上，室溫放置5min后，8000rpm離心1min，重復(fù)步驟⑧，合并DNA。

⑨采用核酸蛋白分析儀ND-1000(Thermo Scientific，USA)檢測(cè)DNA濃度，A260/280比值在1.8-2.0判定為合格，同時(shí)，取1μl在1.0％的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，取30μl DNA(濃度>100ng/μl)原液保存于-20℃中備用。

3)構(gòu)建高密度全基因組SNP芯片

利用Illumina Infinium II array的Beadtype探針(桃國(guó)際通用RosBREED_Peach_10K 11494376的高密度SNP芯片)分別與步驟2)中的目標(biāo)基因組DNA片段進(jìn)行雜交，所用試劑盒及雜交方法步驟由Illumina公司提供，具體步驟如下：

①DNA模板擴(kuò)增：利用λDNA和PicoGreen熒光染料進(jìn)行基因組DNA濃度精確定量，取4μl 50ng/μl的基因組DNA加到裝有20μl MA1的MSA3板中，加4μl 0.1N NaOH溶液，1600rpm混勻1min，280×g離心1min，室溫孵育10min，然后加34μl MA2和38ul MSM混勻離心，蓋膜，制成MSA3板，MSA3板置于雜交箱中37℃恒溫20-24h，進(jìn)行基因組擴(kuò)增。

②DNA擴(kuò)增產(chǎn)物片斷化：擴(kuò)增好的MSA3板50×g離心1min，加入25μl FMS試劑，蓋蓋，1600rpm混勻1min，22×g離心1min，然后37℃孵育1min。

③DNA沉淀：MSA3板中加50μl PM1試劑，封蓋，1600rpm離心1min，37℃孵育1min，22℃50×g離心1min，棄硅膠蓋，每孔加入155μl異丙醇，蓋新的硅膠蓋，顛倒混勻，4℃放置30min后3000×g離心20min，棄上清液，倒置96孔板1h，室溫下晾干。

④DNA重懸：在MSA3板中加23μl RA1試劑，封膜后置于48℃雜交箱中孵育1h，1800rpm混勻1min后在280×g離心。

⑤DNA與芯片磁珠雜交：在Hyb槽內(nèi)加入400μl PB2緩沖液，置于2-8℃保存，將重懸的MSA3板中的DNA樣品95℃變性20min，然后室溫靜置30min，然后280×g離心，棄蓋。將未開(kāi)封的新的SNP芯片組裝到雜交槽上，按照DNA順序把12μl DNA樣品點(diǎn)到芯片相應(yīng)的位置上，封蓋。最后將點(diǎn)好DNA樣品的雜交槽放置在預(yù)熱好的48℃的雜交爐中雜交16h。

⑥芯片清洗、單堿基延伸及染色：首先將高密度SNP芯片安裝在齒條上，浸入PB1溶液中，在1，2號(hào)洗盤(pán)中分別清洗芯片1min。組裝芯片在流相槽中，加入150ml PB1，固定芯片，并置凹槽與Fixture上。雜交后，用RA1試劑洗去未雜交上的和非特異性結(jié)合的DNA樣品，然后在芯片表面加入XC1和XC2試劑準(zhǔn)備進(jìn)行延伸反應(yīng)。加入200ul TEM試劑孵育15min到使單堿基擴(kuò)增的引物與DNA樣本雜交上，并使帶有標(biāo)記的核苷酸鏈接到擴(kuò)增引物上。加入450μl 95％的甲酰胺/1mM EDTA溶液孵育1min(2次)來(lái)移除雜交好的DNA，加入450μl XC3孵育1min(2次)試劑中和后，開(kāi)始進(jìn)行多次染色。

⑦包被芯片：染色結(jié)束后，取下芯片放在加有310ml PB1試劑的洗盤(pán)中上下異動(dòng)10次，然后放置5min，然后在加有310ml XC4的洗盤(pán)中清洗，最后放在真空干燥泵中晾干50-55min。

⑧芯片上機(jī)掃描。

⑨將所得原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入GenomeStudio數(shù)據(jù)分析軟件(Illumina，Inc.)和“TOP/BOT”Strand分析方法，得到每個(gè)樣本的SNP基因分型數(shù)據(jù)，分別設(shè)定GenTrain和Gencall 10％為0.4和0.2來(lái)區(qū)分純合和雜合位點(diǎn)。

4)鑒定F₁雜交群體流膠病抗性

于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行試驗(yàn)基地桃種質(zhì)資源圃進(jìn)行雜交后代及親本的流膠病抗性分析，對(duì)于資源圃?xún)?nèi)2年生桃樹(shù)，流膠病病情調(diào)查分為6個(gè)等級(jí)。

病情等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)為全株正常，無(wú)流膠，無(wú)病斑植株；1級(jí)為主干、主枝和一級(jí)側(cè)枝有散生或1-2個(gè)流膠點(diǎn)(流膠塊直徑小于3cm)；2級(jí)為主干、主枝和一級(jí)側(cè)枝上有1/4以下面積的連片流膠，無(wú)法區(qū)分各流膠點(diǎn)；3級(jí)為主干、主枝和一級(jí)側(cè)枝上有1/4-1/2以下面積的連片流膠，無(wú)法區(qū)分各流膠點(diǎn)，4級(jí)為主干、主枝和一級(jí)側(cè)枝上有1/2-3/4以下面積的連片流膠，無(wú)法區(qū)分各流膠點(diǎn)；5級(jí)為主干、主枝和一級(jí)側(cè)枝上有3/4以上面積的連片流膠，無(wú)法區(qū)分各流膠點(diǎn)。

根據(jù)加權(quán)平均法計(jì)算雜交后代的發(fā)病指數(shù)，主干占70％比重，主枝和一級(jí)側(cè)枝之和占30％比重，從而計(jì)算得到流膠病表型數(shù)據(jù)，參見(jiàn)表1和圖1。

表1

由表1及圖1可見(jiàn)，所述SNP位點(diǎn)的基因型為AG時(shí)，桃樹(shù)流膠病的發(fā)病率顯著高于基因型為GG時(shí)。

5)分子標(biāo)記與抗病基因的連鎖分析

采用軟件Joinmap 4.0構(gòu)建遺傳圖譜，使用WinQTL cartographer 2.5QTL定位軟件，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，設(shè)置窗口為0.5cM，模型選擇向前/向后回歸分析方法，運(yùn)行參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，進(jìn)行QTL定位；采用LOD閾值設(shè)置為2.5，QTL置信區(qū)間為L(zhǎng)OD值從峰值下降2對(duì)應(yīng)的區(qū)間，同時(shí)計(jì)算每個(gè)QTL對(duì)表型的貢獻(xiàn)率和遺傳效應(yīng)。

利用高密度SNP芯片對(duì)80個(gè)F₁雜交后代及2個(gè)親本進(jìn)行基因分型，最終構(gòu)建了一張包含538個(gè)位點(diǎn)的連鎖群，覆蓋8個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)度為530.38cM，其中，第6連鎖群LG6包含84個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)，基于該遺傳連鎖圖譜及80份雜交后代的基因型數(shù)據(jù)和流膠病表型數(shù)據(jù)，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，進(jìn)行QTL分析及效應(yīng)檢測(cè)，最終在第6連鎖群檢測(cè)到一個(gè)與流膠病抗性相關(guān)的QTL，位于第6連鎖群的26.7區(qū)間，參見(jiàn)圖2，附近標(biāo)記為SNP_IGA_627726，對(duì)應(yīng)染色體物理位置7604716，其LOD、貢獻(xiàn)率較大，分別為4.71和20％。

<110> 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 一個(gè)與桃樹(shù)流膠病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記

<160> 3

<210> SEQ ID NO. 1

<211> 121

<212> DNA

<213> 桃（Peach）

<220>

<221> gene

<235> (1)...(121)

<220>

<221> mutation

<235> (61)

<223> n=a或g

<400> 1

ttcttcaacc tttccagaac tcgcgaaccc atcaatcaag aactgatacg tcttgatatc 60

naatgccatt ccttcctttt ccatcacaag caatatcaga tccaactctg gaaagttcca 120

t 121

<210> SEQ ID NO. 2

<211> 11

<212> 人工合成

<213> 桃（Peach）

<220>

<221> primer_bind

<235> (1)...(11)

<223>

<400> 2

cttcaacctt tccagaactc g 11

<210> SEQ ID NO. 3

<211> 23

<212> 人工合成

<213> 桃（Peach）

<220>

<221> primer_bind

<235> (1)...(11)

<223>

<400> 3

tggaactttc cagagttgga t 11