本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)開(kāi)發(fā)方法與微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

微衛(wèi)星標(biāo)記又稱(chēng)短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STR)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)，指由2個(gè)以上核苷酸為重復(fù)單元串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成。微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)指的是在基因組上含有微衛(wèi)星標(biāo)記的座位，微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在基因組上數(shù)量豐富且均勻分布，微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)指的是尋找基因組上的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的過(guò)程。不同樣本中，同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)可能不同，在樣本間存在長(zhǎng)度變異，因此微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性主要指同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的不同微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度多態(tài)性。微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)指的是檢測(cè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度的技術(shù)。不同樣本的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度多態(tài)性可以用來(lái)對(duì)樣本的身份進(jìn)行鑒定，因此，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛，包括生物多樣性鑒定、動(dòng)植物品種指紋身份證鑒定等等。

傳統(tǒng)的棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)與檢測(cè)包括以下步驟：基因組提取、基因組片段化、連接接頭、擴(kuò)增、與簡(jiǎn)單重復(fù)序列雜交、純化雜交產(chǎn)物、雜交產(chǎn)物克隆、克隆產(chǎn)物大腸桿菌轉(zhuǎn)化、挑取單克隆、對(duì)每一個(gè)單克隆的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行一代測(cè)序、分析測(cè)序結(jié)果獲得微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)、在多個(gè)棉花樣本中檢驗(yàn)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性、開(kāi)發(fā)出多態(tài)性高的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)、逐一擴(kuò)增并電泳檢測(cè)每一個(gè)待檢測(cè)的樣品中的每一個(gè)待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中的微衛(wèi)星標(biāo)記。

在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問(wèn)題：

棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)與檢測(cè)流程復(fù)雜、通量低、極其耗時(shí)費(fèi)力；其次，微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的電泳檢測(cè)的分辨率低，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，準(zhǔn)確的結(jié)果需要參考樣本等進(jìn)行校正。由此派生的問(wèn)題包括：開(kāi)發(fā)出來(lái)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)少，通常200個(gè)以?xún)?nèi)，占基因組上所有微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的1％左右；用于檢驗(yàn)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性的棉花樣本也少，通常在數(shù)十個(gè)左右，因此多態(tài)性檢證結(jié)果不準(zhǔn)確；微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的側(cè)翼序列保守性未知，影響擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的引物的通用性；檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的數(shù)量有限，一般在一個(gè)待檢測(cè)的樣品中檢測(cè)數(shù)十個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，導(dǎo)致建立的樣本的DNA身份證信息不完整、不準(zhǔn)確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)開(kāi)發(fā)方法與微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度檢測(cè)方法。所述技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)開(kāi)發(fā)方法，所述方法包括：

將n個(gè)具有多態(tài)性的棉花樣本等質(zhì)量混合，獲得混合樣本，其中n＞1；

提取所述混合樣本的基因組；

將所述混合樣本的基因組片段化，獲得基因組片段；

將多個(gè)具有簡(jiǎn)單重復(fù)序列的探針作為探針組，利用所述探針組中的每個(gè)探針?lè)謩e與所述基因組片段進(jìn)行雜交，獲得多個(gè)雜交溶液，對(duì)多個(gè)所述雜交溶液中成功雜交的基因組片段分別進(jìn)行純化，得到多個(gè)純化的雜交基因組片段；

將多個(gè)所述純化的雜交基因組片段等質(zhì)量混合后，利用高通量測(cè)序檢測(cè)混合后的所述純化的雜交基因組片段，獲得第一高通量測(cè)序片段；

從所述第一高通量測(cè)序片段中，篩選有效的所述高通量測(cè)序片段，所述有效的高通量測(cè)序片段包括微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記；

根據(jù)所述有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的兩側(cè)序列的同源性對(duì)所述有效的高通量測(cè)序片段進(jìn)行分類(lèi)，同一類(lèi)的所述有效的高通量測(cè)序片段為同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所述有效的高通量測(cè)序片段，若同一個(gè)所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所述有效的高通量測(cè)序片段的條數(shù)≥α1，則成功開(kāi)發(fā)一個(gè)所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，其中，α1為第一判定閾值且α1≥(高通測(cè)序深度×有效的高通量測(cè)序片段的比例/基因組上能檢測(cè)到的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)數(shù))×概率保證。

通常，為了便于純化所述雜交溶液中成功雜交的基因組片段，可以對(duì)探針進(jìn)行功能化標(biāo)記，例如可以

利用生物素標(biāo)記的具有簡(jiǎn)單重復(fù)序列的探針與所述基因組片段進(jìn)行雜交，獲得雜交溶液；

利用鏈霉親和素磁珠純化所述雜交溶液中成功雜交的基因組片段，獲得純化的基因組片段。

在上述步驟中由于探針具有生物素標(biāo)記，使得成功雜交的基因組片段也被生物素標(biāo)記，從而可以利用鏈霉親和素磁珠從所述雜交溶液中純化出來(lái)。所述利用生物素標(biāo)記和鏈霉親和素磁珠純化的技術(shù)為公知技術(shù)。

具體地，α1≥20。

具體地，所述微衛(wèi)星標(biāo)記指由≥2個(gè)堿基組成的重復(fù)單元串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成的序列。

具體地，所述有效的高通量測(cè)序片段中的所述微衛(wèi)星標(biāo)記的兩側(cè)序列的堿基數(shù)均≥1個(gè)，且所述有效的高通量測(cè)序片段中的所述微衛(wèi)星標(biāo)記中至少有一側(cè)的序列的堿基數(shù)≥10個(gè)。

具體地，所述從成功開(kāi)發(fā)的所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，選擇所述待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的方法包括：

選擇所述待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)為H值最大的所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，其中，H值為所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性指數(shù)，其中，i為按所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所述有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度進(jìn)行分類(lèi)時(shí)，第i個(gè)類(lèi)別，S為所述類(lèi)別的數(shù)目，ai為第i個(gè)類(lèi)別的有效的所述高通量測(cè)序片段的數(shù)目占總的有效的所述高通量測(cè)序片段的數(shù)目的比例。

具體地，選擇所述n個(gè)具有多態(tài)性的棉花樣本的方法包括：選擇外部形態(tài)不同的棉花樣本、生物分類(lèi)不同的棉花樣本、標(biāo)記互不相同的棉花樣本或不同生態(tài)區(qū)域的野生資源的棉花樣本。

具體地，所述探針的數(shù)量為12個(gè)，每個(gè)所述探針的簡(jiǎn)單重復(fù)序列中的重復(fù)單元為CT、GA、TG、AC、TA、TGT、CCA、ATC、CCT、AGA、ATG或CAA，每個(gè)所述探針的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)為6～20，優(yōu)選為6～15，例如重復(fù)次數(shù)為8或12。

具體地，所述探針的序列如序列表中SEQ IN NO:1-SEQ IN NO:12所示。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種上述開(kāi)發(fā)方法成功開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括：

從成功開(kāi)發(fā)的所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，選擇待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)；

利用多重?cái)U(kuò)增引物擴(kuò)增所述待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，得到第二高通量測(cè)序片段，通過(guò)分析所述第二高通量測(cè)序片段，獲得所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度。

具體地，所述從成功開(kāi)發(fā)的所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，選擇所述待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的方法包括：

選擇所述待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)為H值最大的所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，其中，H值為所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性指數(shù)，其中，i為按所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所述有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度進(jìn)行分類(lèi)時(shí)，第i個(gè)類(lèi)別，i為自然數(shù)；ai為第i個(gè)類(lèi)別的有效的所述高通量測(cè)序片段的數(shù)目占總的有效的所述高通量測(cè)序片段的數(shù)目的比例。

具體地，制備所述多重?cái)U(kuò)增引物的方法包括：

從選擇的所述待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所有所述有效的高通量測(cè)序片段中，提取所述微衛(wèi)星標(biāo)記并挑選出最長(zhǎng)的所述微衛(wèi)星標(biāo)記作為多重?cái)U(kuò)增引物的模版序列的微衛(wèi)星標(biāo)記；

從選擇的所述待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所有所述有效的高通量測(cè)序片段中，提取所述微衛(wèi)星標(biāo)記的左側(cè)序列并挑出長(zhǎng)度大于α2個(gè)堿基的所有序列，從挑選出的所述所有序列中，挑選出頻率最高的序列，以所述頻率最高的序列作為參考序列，將所述參考序列與所有的所述微衛(wèi)星標(biāo)記的左側(cè)序列進(jìn)行比對(duì)，在所述頻率最高的序列中獲得每一個(gè)堿基的覆蓋倍數(shù)和變異頻率；在所述頻率最高的序列中，將所述覆蓋倍數(shù)≤1/α3或所述變異頻率≥α3的堿基變?yōu)镹后作為所述多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的左側(cè)序列，其中，N為A、T、C和G四種堿基中任意一種及以上的堿基；α2為第二判定閾值，α2＝(所述第一高通量測(cè)序片段的平均長(zhǎng)度-所述多重?cái)U(kuò)增引物的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的長(zhǎng)度)÷2；α3為第三判定閾值，α3≥5×(1-所述第一高通量測(cè)序片段的準(zhǔn)確度)；

按照與所述多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的左側(cè)序列相同的方法，獲得多重?cái)U(kuò)增引物序列的模板序列的右側(cè)序列；

將所述多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的左側(cè)序列、所述多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的微衛(wèi)星標(biāo)記和所述多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的右側(cè)序列依次連接，得到所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列，利用所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列，獲得所述多重?cái)U(kuò)增引物。

具體地，獲得所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的所述微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度的方法為：去除所述第二高通量測(cè)序片段中的所述微衛(wèi)星標(biāo)記后，獲得所述第二高通量測(cè)序片段的左邊界序列和所述第二高通量測(cè)序片段的右邊界序列；利用所述左邊界序列和所述右邊界序列將所述第二高通量測(cè)序片段中的每個(gè)片段比對(duì)到所述待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)上；截取每一個(gè)所述待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所述第二高通量測(cè)序片段中的所述微衛(wèi)星標(biāo)記；將獲得的所述微衛(wèi)星標(biāo)記按長(zhǎng)度進(jìn)行分類(lèi)，并計(jì)算第i個(gè)類(lèi)別的真實(shí)度R_i＝N_i/N_max，其中，i為按所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所述有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度進(jìn)行分類(lèi)時(shí)，第i個(gè)類(lèi)別，N_i為所述第i個(gè)類(lèi)別的所述第二高通量測(cè)序片段的數(shù)量，N_max為所有類(lèi)別的所述第二高通量測(cè)序片段的數(shù)量的最大值；若所述真實(shí)度R_i≥α4，則所述第i個(gè)類(lèi)別的所述微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度為所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的所述微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度，若所述真實(shí)度R_i<α4，則所述第i個(gè)類(lèi)別的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度不為所述微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的所述微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度，其中，α4為第四判定閾值且α4＝0.15。

具體地，將所述混合樣本的基因組片段化的方法為機(jī)械打斷或酶切。

本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是：本發(fā)明提供的棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)與檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單、快捷、高通量、全面且準(zhǔn)確。時(shí)間消耗由1～2年縮短到1～2天；開(kāi)發(fā)出的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量由基因組中所有微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的1％左右提高到接近100％；檢驗(yàn)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性的棉花樣本的數(shù)量由數(shù)十個(gè)提升到不受限制，多態(tài)性結(jié)果檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性大為提高；可獲得微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的側(cè)翼序列的保守性，確保了擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的引物的通用性；將多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)作為一個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)，而不是逐一檢測(cè)，多個(gè)待檢測(cè)的棉花樣本只進(jìn)行一次檢測(cè)，而不是多次檢測(cè)，極大地減少了微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)檢測(cè)的工作量，因此，檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的數(shù)量幾乎不受限制。微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)檢測(cè)的結(jié)果為堿基，正確率接近100％；微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)檢測(cè)分辨率提升至最高分率：?jiǎn)螇A基；不再需要參照品種對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。

本發(fā)明實(shí)施例中未注明或詳細(xì)描述的操作流程或操作規(guī)范均為普通分子生物學(xué)技術(shù)人員所熟知的操作。本發(fā)明實(shí)施例中未注明的試劑或生物材料均為市場(chǎng)上銷(xiāo)售的常用試劑或生物材料，均為普通分子生物學(xué)技術(shù)人員所熟知的，且可以在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)到。

實(shí)施例

棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)方法：

將n個(gè)具有多態(tài)性的棉花樣本等量混合，獲得混合樣本，其中n＞1。

具有多態(tài)性的樣本包括：外部形態(tài)不同的棉花樣本(形態(tài)多態(tài)性)、生物分類(lèi)(如不同亞種、變種或品種)不同的棉花樣本、標(biāo)記(如蛋白質(zhì)標(biāo)記)互不相同的棉花樣本或不同生態(tài)區(qū)域的野生資源的棉花樣本，其中，所選擇的棉花樣本越多(n值越大)，多態(tài)性越豐富，所開(kāi)發(fā)出的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的適用性越廣。本實(shí)施例中，待開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的物種為棉花，所選擇的棉花為不同的棉花品種，它們分別是：鄂雜棉11F1、創(chuàng)雜棉21、中棉所63、銀興棉4號(hào)、中棉所72、中棉所66、同舟雜棉6號(hào)、冀棉616、銀興棉5號(hào)、益豐3號(hào)、創(chuàng)雜棉28、創(chuàng)雜棉27、荊雜棉166F1、中棉所59、冀創(chuàng)棉1、魯棉研23、冀創(chuàng)18F1、創(chuàng)雜棉20、冀棉169、晉棉-26、邯雜306、德棉998、魯05H9、石抗278、泗雜棉6號(hào)、冀棉616、魯棉研28號(hào)、中植棉8號(hào)、國(guó)欣棉9號(hào)、奧棉6號(hào)、國(guó)欣棉8號(hào)、欣抗棉318、嘉星5號(hào)、瑞雜816、新陸中60號(hào)和科抗棉2號(hào)，共36個(gè)品種，這些棉花品種是中國(guó)廣泛使用的品種，公開(kāi)且公知，于市場(chǎng)上采購(gòu)獲得。其中，微衛(wèi)星標(biāo)記指由≥2個(gè)堿基組成的重復(fù)單元串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成的序列。

取以上36個(gè)棉花品種的等質(zhì)量葉片并混合，提取混合樣本的基因組，提取方法按照天根生化科技(北京)有限公司的貨號(hào)為DP320的新型植物基因組提取試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行。在本實(shí)施例中所選的棉花樣本為葉片，作為公知常識(shí)，該棉花樣本還可以取自種子等部位。

將混合樣本的基因組片段化，獲得基因組片段。具體地，將混合樣本的基因組片段化的方法包括：機(jī)械打斷或酶切?；蚪M片段化的長(zhǎng)度控制在高通量測(cè)序時(shí)可檢測(cè)的片段長(zhǎng)度范圍內(nèi)。本實(shí)施例中，高通量測(cè)序采用PROTON高通量測(cè)序儀的PI芯片，其檢測(cè)長(zhǎng)度約為200bp，因此，獲取的基因組片段的長(zhǎng)度的峰值也盡量控制在200bp附近。本實(shí)施例采用自動(dòng)聲波聚焦破碎儀Covaris S220(美國(guó)Covaris生產(chǎn)，型號(hào)為S220)破碎混合樣本的基因組，破碎方法按該儀器的操作手冊(cè)《DNA Shearing with S220/E220Focused-ultrasonicator》(版本號(hào):010308Rev G)中所記載的獲取200bp(峰值)目標(biāo)片段的方法進(jìn)行，破碎后即獲得混合樣本的基因組片段，采用美國(guó)Quawell公司生產(chǎn)的Q5000分光光度計(jì)按其雙鏈DNA的程序?qū)蚪M片段進(jìn)行檢測(cè)后，將濃度稀釋或濃縮到100ng/μL，獲得基因組片段。

將多個(gè)生物素標(biāo)記的具有簡(jiǎn)單重復(fù)序列的探針作為探針組，利用探針組與基因組片段進(jìn)行雜交，獲得雜交溶液。具有簡(jiǎn)單重復(fù)序列的探針中的重復(fù)單元的堿基數(shù)≥2個(gè)。具體地，探針的簡(jiǎn)單重復(fù)序列中的重復(fù)單元為CT、GA、TG、AC、TA、TGT、CCA、ATC、CCT、AGA、ATG或CAA，這12個(gè)探針可以與所有可能的2堿基和3堿基為重復(fù)單元的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行雜交，因此，可以用于所有物種中的基因組片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的釣取。前期實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)了不同探針長(zhǎng)度鉤取微衛(wèi)星標(biāo)記的效率，發(fā)現(xiàn)探針的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)為6～20時(shí)，效率較高，優(yōu)選的重復(fù)次數(shù)為6～15，例如8或12。在本實(shí)施例中，該探針組包括12個(gè)探針，這12個(gè)探針的序列分別如序列表中SEQ IN NO:1-SEQ IN NO:12所示。以上探針均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成并進(jìn)行5’端生物素標(biāo)記。前期的實(shí)驗(yàn)表明，將不同探針?lè)謩e釣取基因組片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的效率優(yōu)于將所有探針混合后釣取基因組片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的效率，因此，在本實(shí)施例中利用不同探針?lè)謩e釣取基因組片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記，具體地，將以上每個(gè)探針?lè)謩e用無(wú)酶水溶解為等摩爾濃度(10pM/μL)的溶液，取以上探針組中的12個(gè)探針各1μL分別與5μg混合樣本的基因組片段混勻后雜交，分別獲得12種雜交溶液。雜交的程序?yàn)椋?5℃10分鐘，65℃10分鐘，37℃10分鐘。

利用鏈霉親和素磁珠純化雜交溶液中成功雜交的基因組片段，獲得純化的基因組片段。具體地，利用鏈霉親和素磁珠分別純化12種雜交溶液，其純化過(guò)程為：將獲得的12種中的1種雜交溶液置于磁力架(美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn))上，至雜交溶液澄清后，吸去溶液，用無(wú)酶水清洗磁珠2次，取10μL無(wú)酶水與鏈霉親和素磁珠混合，于PCR儀中95℃加熱5分鐘，迅速置于磁力架上，獲得的溶液即為第一個(gè)探針的純化的雜交基因組片段。按與獲取的第一個(gè)探針的純化的雜交基因組片段相同的方法，依次獲取所有12個(gè)純化的雜交基因組片段，將它們混合在一起，即最終獲得所有探針的純化的雜交基因組片段。為了能夠成功純化雜交基因組片段，在本實(shí)施例中，采用生物素標(biāo)記的具有簡(jiǎn)單重復(fù)序列的探針配合鏈霉親和素磁珠的方式，在其它實(shí)施例中，也可以采用其它的方式進(jìn)行基因組片段的雜交和純化。

利用二代高通量測(cè)序檢測(cè)純化的雜交基因組片段，獲得第一高通量測(cè)序片段。利用DNA文庫(kù)制備試劑盒(由英國(guó)NEB公司生產(chǎn)，貨號(hào)為E6270L)并按該試劑盒的操作手冊(cè)構(gòu)建二代高通量測(cè)序文庫(kù)，利用獲得的二代高通量測(cè)序文庫(kù)和試劑盒Ion PI Template OT2 200Kit v2(美國(guó)invirtrigen公司生產(chǎn)，貨號(hào)為4485146)進(jìn)行測(cè)序前的ePCR(Emulsion PCR，乳化聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增，操作方法按該試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行，獲得ePCR擴(kuò)增產(chǎn)物。利用ePCR擴(kuò)增產(chǎn)物和試劑盒Ion PI Sequencing 200Kit v2(美國(guó)invirtrigen公司生產(chǎn)，貨號(hào)為4485149)在Proton二代高通量測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序，操作方法按該試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行。在本實(shí)施例中，高通量測(cè)序量設(shè)置為10M測(cè)序片段(1M＝100萬(wàn))，測(cè)序長(zhǎng)度設(shè)置為500cycle(循環(huán))，測(cè)序結(jié)束后，獲得第一高通量測(cè)序片段。

從第一高通量測(cè)序片段中，篩選有效的高通量測(cè)序片段。其中，有效的高通量測(cè)序片段包括微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記，有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的兩側(cè)序列的堿基數(shù)均≥1個(gè)，且有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記中至少有一側(cè)的序列的堿基數(shù)≥10個(gè)。分析第一高通量測(cè)序片段中的每一條片段是否含有微衛(wèi)星標(biāo)記，去掉不含有微衛(wèi)星標(biāo)記的第一高通量測(cè)序片段。在保留下來(lái)的第一高通量測(cè)序片段中，分析微衛(wèi)星標(biāo)記的兩側(cè)序列的堿基數(shù)是否均≥1個(gè)，如果是，則表明微衛(wèi)星標(biāo)記在第一高通量測(cè)序片段中是完整的，這一點(diǎn)是必要的，因?yàn)槲⑿l(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性是指微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度多態(tài)性，只有確保微衛(wèi)星標(biāo)記是完整的，才能正確獲得微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度多態(tài)性，以便正確地進(jìn)行后續(xù)分析。微衛(wèi)星標(biāo)記的兩側(cè)序列均小于10個(gè)堿基的第一高通量測(cè)序片段無(wú)法準(zhǔn)確地進(jìn)行后續(xù)的同源性分析，會(huì)因?yàn)樾蛄羞^(guò)短而引入誤差，因此，進(jìn)一步去掉微衛(wèi)星標(biāo)記的兩側(cè)序列均小于10個(gè)堿基的第一高通量測(cè)序片段。經(jīng)過(guò)以上流程，最終保留下來(lái)的第一高通測(cè)序片段即為有效的高通量測(cè)序片段。

其中，在分析第一高通量測(cè)序片段中的每一條片段是否含有微衛(wèi)星標(biāo)記時(shí)，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中常用的分析軟件進(jìn)行分子，也可以簡(jiǎn)單的通過(guò)人工對(duì)每個(gè)第一高通量測(cè)序片段進(jìn)行判斷。

根據(jù)有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的兩側(cè)序列的同源性對(duì)有效的高通量測(cè)序片段進(jìn)行分類(lèi)，同一類(lèi)的有效的高通量測(cè)序片段為同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的有效的高通量測(cè)序片段，若同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的有效的高通量測(cè)序片段的條數(shù)≥α1，則成功開(kāi)發(fā)一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，其中，α1為第一判定閾值且α1≥(高通測(cè)序深度×有效的高通量測(cè)序片段的比例/基因組上能檢測(cè)到的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)數(shù))×概率保證。α1的具體取值可根據(jù)高通量測(cè)序的深度進(jìn)行調(diào)整。將有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記去掉，將剩余的兩側(cè)序列合并成一條完整的序列，采用軟件Megablast(版本2.2.26)在合并后的完整的序列間進(jìn)行成對(duì)的比對(duì)分析，比對(duì)的各參數(shù)設(shè)置為：參數(shù)-e設(shè)置為1e-5；參數(shù)-p設(shè)置為0；參數(shù)–v設(shè)置為5000；參數(shù)-m設(shè)置為1。將具有同源性(同源性指在DNA序列上相似)的有效的高通量測(cè)序片段歸為同一類(lèi)，同時(shí)計(jì)算類(lèi)別內(nèi)包含的有效的高通量測(cè)序片段的數(shù)量，若包含的有效的高通量測(cè)序片段的數(shù)量≥α1條時(shí)，則該類(lèi)別的有效的高通量測(cè)序片段為一個(gè)成功開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的高通量測(cè)序片段。其具體原理如下：基因組上同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在高通量測(cè)序過(guò)程中，可能被檢測(cè)到多次，由于高通量測(cè)序的對(duì)象為包含了多個(gè)具有多態(tài)性的樣本的混合樣本，因此，同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度存在多態(tài)性變異，微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的兩側(cè)序列也存在變異，因此，不能要求同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所有有效的高通量測(cè)序片段的序列完全相同，只能根據(jù)高通量測(cè)序片段的同源性來(lái)判定是否為同一微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，其中，高通量測(cè)序片段包括微衛(wèi)星標(biāo)記與微衛(wèi)星標(biāo)記的兩側(cè)序列，因此，高通量測(cè)序片段的同源性可以是微衛(wèi)星標(biāo)記的同源性或者微衛(wèi)星標(biāo)記的兩側(cè)序列的同源性。不同的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中的微衛(wèi)星標(biāo)記可能相同，因此，不能根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記的同源性判定有效的高通量測(cè)序片段是否屬于同一微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，只能根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的兩側(cè)序列的同源性判定有效的高通量測(cè)序片段是否屬于同一微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)。之所以要求同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的有效的高通量測(cè)序片段的數(shù)量≥α1是為了防止諸如樣本被污染等難以控制的因素造成的假陽(yáng)性。α1≥3是生物信息學(xué)中確認(rèn)一個(gè)片段真實(shí)存在時(shí)，一般采用的閾值，α1的具體取值可根據(jù)高通量測(cè)序的深度進(jìn)行調(diào)整，可按以下公式計(jì)算：α1≥(高通測(cè)序深度×有效的高通量測(cè)序片段的比例/基因組上的能檢測(cè)到的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)數(shù))×概率保證，其中，在統(tǒng)計(jì)上，概率保證一般取值為5％或1％。本實(shí)施例中，高通量測(cè)序的深度為1000萬(wàn)條，有效的高通量測(cè)序片段的比例一般為40％左右，一般基因組上的能檢測(cè)到的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)為1萬(wàn)個(gè)左右，因此，平均每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)包含的有效的高通量測(cè)序片段為400條，實(shí)際的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的測(cè)序深度呈現(xiàn)正態(tài)分布，所以，一般低于平均有效的高通量測(cè)序片段數(shù)1/20(5％)的分布較少。因此，本實(shí)施例中，α1取值為20條。按以上流程和標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)施例中，共成功開(kāi)發(fā)出17888個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)。

選擇待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)為H值最大的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，其中，H值為微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性指數(shù)，其中，i為按微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度進(jìn)行分類(lèi)時(shí)，第i個(gè)類(lèi)別，i為自然數(shù)；ai為第i個(gè)類(lèi)別的有效的高通量測(cè)序片段的數(shù)目占總的有效的高通量測(cè)序片段的數(shù)目的比例。如表1的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)按有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度進(jìn)行分類(lèi)，共有3種：(TG)20、(TG)21和(TG)22，因此S＝3；該微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的總的有效的高通量測(cè)序片段的數(shù)目為40，其中，第1種微衛(wèi)星標(biāo)記(TG)20的數(shù)目為3條，因此a1＝3/40＝7.50％，同樣計(jì)算a2＝32/40＝80％，a3＝5/40＝12.50％。將以上值代入H的計(jì)算公式獲得該微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的H值為0.98。

按與表1的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)相同的計(jì)算方法，計(jì)算本實(shí)施例中所有成功開(kāi)發(fā)出的所有微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的H值，所有獲得的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的H值由大到小排列，選擇排序前50位的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)為本實(shí)施中待檢測(cè)的樣本中需要檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)。參數(shù)50根據(jù)實(shí)際需要定，例如，在棉花純度鑒定時(shí)，1個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)即可，在棉花指紋圖譜構(gòu)建時(shí)，一般選擇50個(gè)左右的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，在品種間實(shí)質(zhì)性派生關(guān)系分析時(shí)，則要求選擇大概300個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)才能滿(mǎn)足要求。之所以選擇H值最大的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，是因?yàn)樗鼈兊膮^(qū)分能力最強(qiáng)，用最少的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)可以盡可能區(qū)分更多的樣本并提供盡可能多的信息，而區(qū)分樣本是微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)最核心的任務(wù)。

提取微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所有有效的高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記，如表1所列的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記為3條(TG)20、32條(TG)21和5條(TG)22的集合。提取微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所有有效高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記的左側(cè)序列組成微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的左側(cè)序列，如表1的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的左側(cè)序列為3條(A)2G(A)2、5條(A)87G(A)3、27條(A)86G(A)3和5條(A)81G(A)4的集合。同樣的方法，獲得微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的右側(cè)序列，如表1的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記的右側(cè)序列為3條(A)4G(A)80、5條(A)3G(A)2、27條(A)3G(A)81和5條2G(A)85的集合。

棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度的檢測(cè)方法：

從成功開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，選擇待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物。下面以表1中的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)為例，介紹如何選擇微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)并設(shè)計(jì)多重?cái)U(kuò)增引物。

設(shè)計(jì)擴(kuò)增選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物的方法包括：從選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所有有效的高通量測(cè)序片段中，提取微衛(wèi)星標(biāo)記，從中挑選出最長(zhǎng)的微衛(wèi)星標(biāo)記，作為多重?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星標(biāo)記；如表1的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，(TG)22為最長(zhǎng)的微衛(wèi)星標(biāo)記，因此，(TG)22為該微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)的模板序列的微衛(wèi)星標(biāo)記。之所以選擇最長(zhǎng)的微衛(wèi)星標(biāo)記是保證所設(shè)計(jì)的多重?cái)U(kuò)增引物所擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)的長(zhǎng)度不會(huì)超過(guò)多重PCR的擴(kuò)增能力，從而減少微衛(wèi)星檢測(cè)時(shí)的數(shù)據(jù)缺失。

從選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的所有有效的高通量測(cè)序片段中，提取微衛(wèi)星標(biāo)記的左側(cè)序列，從中挑出長(zhǎng)度大于α2個(gè)堿基的所有序列，α2為第二判定閾值，α2＝(二代高通量測(cè)序技術(shù)所能檢測(cè)的第一高通量測(cè)序片段的平均長(zhǎng)度-多重?cái)U(kuò)增引物的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的長(zhǎng)度)÷2。本實(shí)施例中，第一高通量測(cè)序片段的平均長(zhǎng)度為200bp，多重?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度為44(TG重復(fù)22次，長(zhǎng)度為44)，因此α2＝78bp。因此，微衛(wèi)星標(biāo)記的左側(cè)序列中，挑出的長(zhǎng)度大于α2的所有序列為5條(A)87G(A)3、27條(A)86G(A)3和5條(A)81G(A)4的集合。從挑選出的所有序列中，挑選出頻率最高的序列，例如上述挑出的長(zhǎng)度大于α2的所有序列中，頻率最高的序列為(A)86G(A)3。以頻率最高的序列作為參考序列與所有的微衛(wèi)星標(biāo)記的左側(cè)序列進(jìn)行比對(duì)，獲得頻率最高的序列中每一個(gè)堿基的覆蓋倍數(shù)和變異頻率。例如，表1的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，應(yīng)該以(A)86G(A)3為參考序列與所有的左側(cè)序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)時(shí)，參考序列(A)86G(A)3的5’端的第1個(gè)堿基為A，其被覆蓋了5+27＝32倍，由于該位置全是A，因此，變異頻率為0，(A)86G(A)3的5’端的第87個(gè)堿基為G，其同樣被覆蓋了5+27＝32倍，其中，不為G的堿基有5個(gè)(在5條(A)81G(A)4中)，因此變異頻率為5÷(5+27+5)＝0.175，按以上方法，計(jì)算獲得(A)86G(A)3中每一個(gè)堿基的覆蓋倍數(shù)和變異頻率。將頻率最高的序列中的覆蓋倍數(shù)≤1/α3或變異頻率≥α3的堿基變?yōu)镹后作為多重?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)的左側(cè)序列，其中，N為A、T、C和G四種堿基中任意一種及以上的堿基；α3為第三判定閾值，α3≥5×(1-第一高通量測(cè)序片段的準(zhǔn)確度)，α3的具體值根據(jù)多重?cái)U(kuò)增引物的通用性的要求的嚴(yán)格程度和高通量測(cè)序的深度進(jìn)行調(diào)整，要求通用性越強(qiáng)或高通量測(cè)序深度越深，則α3的值越小。在本實(shí)施例中，高通量測(cè)序的準(zhǔn)確度為99％，因此α3≥5×(1-99％)＝5％，本實(shí)施例要求所設(shè)計(jì)的多重?cái)U(kuò)增引物的通用性強(qiáng)，因此，α3取值為5％。因此，在表1的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，將出頻率最高的序列((A)86G(A)3)中的覆蓋倍數(shù)≤1/5％＝20或變異頻率≥0.05的堿基記為變?yōu)镹后作為多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的左側(cè)序列。對(duì)于(A)86G(A)3第1個(gè)堿基，其被覆蓋了32倍且變異頻率為0，因此，不改變?yōu)镹，對(duì)于(A)86G(A)3第86個(gè)堿基，其覆蓋倍數(shù)32倍但變異頻率為0.175≥0.05，因此，將該堿基變?yōu)镹，按此規(guī)則，在表1的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的左側(cè)序列為(A)85NNN(A)2。變異頻率高的堿基混合樣本中變異度大，因此，所設(shè)計(jì)的多重?cái)U(kuò)增引物通用性差，覆蓋倍數(shù)低的堿基誤差大，把它們都變成N后，在后續(xù)的多重引物設(shè)計(jì)流程中，就可以避開(kāi)這些堿基位點(diǎn)，以確保設(shè)計(jì)出來(lái)的多重?cái)U(kuò)增引物可以在不同樣本間通用。傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)由于工作量的限制，一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的邊界序列往往只能被檢測(cè)到一次或少數(shù)幾次，不能獲得并避開(kāi)引物設(shè)計(jì)區(qū)的變異堿基，難以保障擴(kuò)增引物的通用性，易造成數(shù)據(jù)缺失。

按與多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的左側(cè)序列完全相同的方法，獲得多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的右側(cè)序列。在表1的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的右側(cè)序列為(A)2NNN(A)80。將多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的左側(cè)序列、多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的微衛(wèi)星標(biāo)記和多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列的右側(cè)序列依次連接，得到微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列，利用微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列，獲得多重?cái)U(kuò)增引物。表1中的假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列為(A)85NNN(A)2(TG)22(A)2NNN(A)80。

按與上述相同的方法與參數(shù)，獲得本實(shí)施中最終選擇的50個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列。

表1一個(gè)假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的第一高通量測(cè)序片段

表1所示的第一高通量測(cè)序片段類(lèi)型中，帶下劃線(xiàn)的部分代表微衛(wèi)星標(biāo)記，括號(hào)內(nèi)的字母表示微衛(wèi)星標(biāo)記的重復(fù)單元，括號(hào)后的數(shù)字代表重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)。

利用所有微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物。具體方法如下：將獲得的50個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增引物的模板序列用100個(gè)N連接起來(lái)，構(gòu)建成一個(gè)人工參考基因組。登錄多重PCR引物在線(xiàn)設(shè)計(jì)網(wǎng)頁(yè)https://ampliseq.com/，在“Application type”選項(xiàng)選擇“DNA Hotspot designs(single-pool)”。并在“Select the genome you wish to use”選項(xiàng)中選擇“Custom”后，上傳構(gòu)建人工參考基因組?！癉NA Type”選項(xiàng)選擇“Standard DNA”。在“Add Hotspot”選項(xiàng)中，填入構(gòu)建的人工參考基因組中每一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的起始位置與終止位置，最后點(diǎn)擊“Submit targets”按鈕提交并獲得多重?cái)U(kuò)增引物的序列。本實(shí)施例中，所選擇的50個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，成功設(shè)計(jì)了多重?cái)U(kuò)增引物的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)為48個(gè)，這個(gè)48個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)即為待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)。本實(shí)施例采用美國(guó)賽默飛世爾公司提供的多重PCR技術(shù)，其能夠同時(shí)擴(kuò)增多至12000個(gè)測(cè)試區(qū)域，因此，本發(fā)明有能力一次性檢測(cè)12000個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，這是傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)檢測(cè)能力的12000倍。

通過(guò)多重?cái)U(kuò)增引物擴(kuò)增待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，得到第二高通量測(cè)序片段。本實(shí)施例中，待檢測(cè)的樣本為武漢棉花田中取的100株棉花葉片，將100株棉花葉片等量混合后獲得混合樣本，利用植物基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)：DP305，生產(chǎn)公司：天根生化科技(北京)有限公司)按其操作手冊(cè)提供的方法提取獲得混合樣本的基因組DNA。采用所設(shè)計(jì)的48對(duì)多重?cái)U(kuò)增引物和文庫(kù)構(gòu)建試劑盒2.0(由美國(guó)LifeTechnology公司生產(chǎn)，貨號(hào)為4475345)并按該試劑盒的操作手冊(cè)對(duì)混合樣本的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)，利用獲得的高通量測(cè)序文庫(kù)和試劑盒Ion PI Template OT2 200Kit v2(美國(guó)invirtrigen公司生產(chǎn)，貨號(hào)為4485146)進(jìn)行測(cè)序前的ePCR(Emulsion PCR，乳化聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增，操作方法按該試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行，獲得ePCR產(chǎn)物。利用ePCR產(chǎn)物和試劑盒Ion PI Sequencing 200Kit v2(美國(guó)invirtrigen公司生產(chǎn)，貨號(hào)為4485149)在Proton二代高通量測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序，操作方法按該試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行。在本實(shí)施例中，高通量測(cè)序量設(shè)置為1M測(cè)序片段(1M＝100萬(wàn))，高通量測(cè)序長(zhǎng)度設(shè)置為500cycle(循環(huán))，測(cè)序結(jié)束后，獲得第二高通量測(cè)序產(chǎn)物。

通過(guò)分析第二高通量測(cè)序產(chǎn)物，獲得微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度。具體方法為：去除第二高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記后，獲得第二高通量測(cè)序片段的左邊界序列和第二高通量測(cè)序片段的右邊界序列；利用左邊界序列和右邊界序列將第二高通量測(cè)序片段中的每個(gè)片段比對(duì)到待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)上；截取每一個(gè)待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的第二高通量測(cè)序片段中的微衛(wèi)星標(biāo)記；將獲得的微衛(wèi)星標(biāo)記按長(zhǎng)度進(jìn)行分類(lèi)，并計(jì)算第i個(gè)類(lèi)別的真實(shí)度R_i＝N_i/N_max，其中，N_i為第i個(gè)類(lèi)別的第二高通量測(cè)序片段的數(shù)量，N_max為所有類(lèi)別的第二高通量測(cè)序片段的數(shù)量的最大值；若真實(shí)度R_i≥α4，則第i個(gè)類(lèi)別的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度為微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度，若真實(shí)度R_i<α4，則第i個(gè)類(lèi)別的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度不為微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度，其中，α4為第四判定閾值。微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性是由于微衛(wèi)星標(biāo)記中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不一致造成的長(zhǎng)度多態(tài)性，因此，微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的檢測(cè)主要是指檢測(cè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度。一般的物種為二倍體，如果樣本是純合的，那么，同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)應(yīng)該只包含一種微衛(wèi)星標(biāo)記的等位位點(diǎn)，如果樣本是雜合的，則同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)有2個(gè)不同微衛(wèi)星標(biāo)記的等位位點(diǎn)。如果樣本是多倍體，如棉花和棉花，則判定標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)該做相應(yīng)調(diào)整。微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增時(shí)，微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增可能會(huì)產(chǎn)生滑動(dòng)，因此，在第二高通量測(cè)序片段中，部分由于滑動(dòng)產(chǎn)生的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度與混合樣本中的真實(shí)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度不相同，從而形成干擾噪音，真實(shí)度R_i可以反應(yīng)了干擾噪音的強(qiáng)弱，R_i值越大，則干擾越小。因此，需要設(shè)定一個(gè)真實(shí)度的判定閾值α4以確定第i種類(lèi)別中的微衛(wèi)星標(biāo)記是否真實(shí)存在。在缺乏已有參考資料的情況下且為純合體(一個(gè)位點(diǎn)只可能有一種基因型)時(shí)，α4一般取值為0.6；若為雜合體時(shí)，則可利用0.6/X作為α4的值，其中，X為待檢測(cè)物種的倍性水平，例如若為4倍體，則α4的值為0.6/4＝0.15。若已知的滑動(dòng)產(chǎn)生的微衛(wèi)星標(biāo)記干擾的大小，則可以制定更具體的標(biāo)準(zhǔn)。例如，當(dāng)已知某個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在100次檢測(cè)中，有95次以上的滑動(dòng)產(chǎn)生的干擾微衛(wèi)星標(biāo)記的比例均小于0.3，那么，我們可以將α4的取值確定為0.3，那么，我們有95％的置信度保障我們獲得的第i個(gè)類(lèi)別的微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型是真實(shí)存在的。值得一提的是，若α4取值較大，則判定微衛(wèi)星標(biāo)記真實(shí)存在時(shí)犯錯(cuò)的概率就較低，但可能將部分真實(shí)存在的微衛(wèi)星標(biāo)記誤判為不存在；相反，若α4取值較小，則更多真實(shí)存在的微衛(wèi)星標(biāo)記將被判斷出來(lái)，但判定微衛(wèi)星標(biāo)記真實(shí)存在時(shí)犯錯(cuò)的概率就較高。因此，本實(shí)施例中α4的取值只是其中一種方式，需要根據(jù)實(shí)際需要或者已有的研究結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。在本實(shí)施例子中，因?yàn)槿狈⒖假Y料確定α4的值且待測(cè)樣本為二倍體，為雜合體，所以，α4取值為0.6/4＝0.15。由于滑動(dòng)產(chǎn)生的虛假的微衛(wèi)星標(biāo)記與真實(shí)的微衛(wèi)星標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度差異不大，而且傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測(cè)方法多為電泳，無(wú)法區(qū)分較小的長(zhǎng)度差異，即使能夠區(qū)分，也無(wú)法準(zhǔn)確定量，因此，傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)時(shí)，無(wú)法計(jì)算或無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算R_i的值，造成大量的不準(zhǔn)確甚至錯(cuò)誤的結(jié)論。

下面再次假定表1為一個(gè)檢測(cè)到的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，說(shuō)明如何檢測(cè)混合樣本中待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)。在表1中假定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的第二高通量測(cè)序片段中，截取的微衛(wèi)星標(biāo)記為3條(TG)20、32條(TG)21和5條(TG)22的集合，將截取的微衛(wèi)星標(biāo)記按重復(fù)單元分類(lèi)，均為T(mén)G，保留出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)單元的微衛(wèi)星標(biāo)記，它們?yōu)?條(TG)20、32條(TG)21和5條(TG)22的集合；將保留下來(lái)的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)一步按長(zhǎng)度進(jìn)行分類(lèi)，共獲得3個(gè)類(lèi)別，分別為(TG)20、(TG)21和(TG)22。在這3個(gè)類(lèi)別中，占有最多的第二高通量測(cè)序片段的數(shù)量的類(lèi)別為第2個(gè)類(lèi)別(TG)21，即N_max＝N₂＝32。第1個(gè)類(lèi)別(TG)20占有的第二高通量測(cè)序片段的數(shù)量為3條，即N₁＝3，那么，R1＝3/32<α4＝0.15，因此，判定第1個(gè)類(lèi)別(TG)20并不是真實(shí)存在的，是由滑動(dòng)引起的。同樣，計(jì)算R₂＝1，R₃＝5/32，根據(jù)同樣的標(biāo)準(zhǔn)，判定，第2個(gè)和第3類(lèi)別是真實(shí)存在的。因此，混合樣本中待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度為類(lèi)別2和類(lèi)別3的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度，即表1中假定的待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度為42bp和44bp(第二個(gè)類(lèi)別TG重復(fù)21次，因此其長(zhǎng)度為21×2bp＝42bp；第三個(gè)類(lèi)別TG重復(fù)22次，因此其長(zhǎng)度為22×2bp＝44bp)。

按與上述假定的實(shí)施例中相同的方法和參數(shù)再次進(jìn)行檢測(cè)，成功檢測(cè)了本實(shí)施例中，48個(gè)待檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度。

本發(fā)明實(shí)施例提供的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)方法與檢測(cè)方法快捷、簡(jiǎn)單、全面、準(zhǔn)確。傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)方法，由于工作量大，只能發(fā)現(xiàn)基因組中大約1％左右的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，也只能在小于100個(gè)樣本中驗(yàn)證微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，理論上可以發(fā)現(xiàn)基因組上所有微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，針對(duì)棉花的微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)的實(shí)施例中，發(fā)現(xiàn)了1萬(wàn)多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，大致為棉花所有微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的50％，因此，在微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)能力上，提高了50倍，如果增加高通量的測(cè)序量(這是很容易辦到的)，則可以將微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)能力提高到80倍甚至接近100倍，都是比較容易實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明實(shí)施例是將微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)(發(fā)現(xiàn))與多態(tài)性檢測(cè)合二為一，并沒(méi)有付出額外的工作，但對(duì)于傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)工作來(lái)說(shuō)，是耗時(shí)且難以實(shí)現(xiàn)的，如在36個(gè)棉花品種中檢測(cè)17888個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性，相當(dāng)于傳統(tǒng)的檢測(cè)中做了36*17888＝643968次PCR擴(kuò)增與電泳，這個(gè)工作量是不可想象的。除此之外，傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)技術(shù)由于工作量大，沒(méi)有能力檢測(cè)同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的多個(gè)序列，所以，不能分析多重?cái)U(kuò)增引物的保守性，導(dǎo)致開(kāi)發(fā)出來(lái)的微衛(wèi)星標(biāo)記的多重?cái)U(kuò)增引物的通用性差，而本發(fā)明實(shí)施例解決了這一問(wèn)題。以本發(fā)明的棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度的檢測(cè)方法中一次檢測(cè)了48個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)為例，對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，則需要48次PCR擴(kuò)增和電泳。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，即使是檢測(cè)1萬(wàn)個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，其工作量也不會(huì)增加，但對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，工作量則增加了1萬(wàn)倍。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是通過(guò)電泳判定微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度，但電泳是存在誤差的，因此，需要參照品種進(jìn)行對(duì)比，從而增加了檢測(cè)的工作量，而且，很少有實(shí)驗(yàn)室能夠有一套完整的參照品種，而本發(fā)明實(shí)施例采用的是高通量測(cè)序，獲得的是堿基序列，由于所得結(jié)果是絕對(duì)值，所以沒(méi)有誤差，因此，不再需要參照品種。此外，電泳檢測(cè)無(wú)法分辨不同單株，比如，本發(fā)明在棉花檢測(cè)中的樣本是100個(gè)單株的混合，在電泳結(jié)果中，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算同一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的不同微衛(wèi)星標(biāo)記的比例，因此，無(wú)法分辨單株，從而無(wú)法計(jì)算雜株率等重要指標(biāo)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 江漢大學(xué)

<120> 棉花微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)開(kāi)發(fā)方法與微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)內(nèi)的微衛(wèi)星標(biāo)記的長(zhǎng)度檢測(cè)方法

<160>12

<170>PatentIn version 3.4

<210> 1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 1

ctctctctct ctctctctct ctct 24

<210> 2

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<212>DNA

<213>人工序列

<400> 2

gagagagaga gagagagaga gaga 24

<210> 3

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<212>DNA

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<400> 3

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtg 24

<210> 4

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<212>DNA

<213>人工序列

<400> 4

acacacacac acacacacac acac 24

<210> 5

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<212>DNA

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<400> 5

tatatatata tatatatata tata 24

<210> 6

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<400> 6

tgttgttgtt gttgttgttg ttgt 24

<210> 7

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<400> 7

ccaccaccac caccaccacc acca 24

<210> 8

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<400> 8

atcatcatca tcatcatcat catc 24

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cctcctcctc ctcctcctcc tcct 24

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agaagaagaa gaagaagaag aaga 24

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atgatgatga tgatgatgat gatg 24

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caacaacaac aacaacaaca acaa 24