本發(fā)明涉及DNA檢測方法技術領域，尤其涉及一種以堿性橙-溴化十六烷基三甲基銨(CTMAB)為探針檢測DNA的方法。

背景技術：

核酸是遺傳信息的載體，是生命的最基本物質之一。核酸分析技術是分子生物學領域研究的基礎，對于研制新藥物和疾病治療具有非常重要的意義，是生命科學中受到廣泛關注和研究的課題。

目前，核酸分析測定的方法有很多。紫外分光光度法操作簡單，被廣泛使用；但由于靈敏度低﹑易受干擾，使其在應用上受到限制。熒光分析法具有較好的選擇性和靈敏度，近些年應用較多；但熒光試劑價格昂貴，部分熒光試劑被證實具有致癌性。1993年，Pasternack等人第一次使用普通熒光分光光度計建立了共振光散射技術。核酸的共振光散射分析方法在普通熒光分光光度計即可實現(xiàn)，具有靈敏度高﹑選擇性好﹑操作簡便﹑應用安全﹑試劑便宜等優(yōu)點。近年來，共振光散射技術在核酸分析中得到迅速發(fā)展，受到越來越廣泛的關注。

堿性橙為閃綠色結晶，遇硫酸呈黃色，稀釋呈橙色。熔點Mp為118-118.5℃，可溶于水，乙醇。堿性橙廣泛應用于染色，其結構式為：溴化十六烷基三甲基銨(CTMAB)為一種常見的陽離子表面活性劑。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種以堿性橙-CTMAB為探針檢測DNA的方法。

一種以堿性橙-CTMAB為探針檢測DNA的方法，包括以下步驟：

A、于10mL容量瓶中依次加入適量的堿性橙、BR緩沖液和CTMAB，然后用水定容至刻度，混勻，靜置15分鐘后進行測試；在200-800nm的波長范圍內，在Δλ＝0nm的條件下同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器，狹縫寬度為5.0nm，波長掃描速度為200nm/min，得到共振光散射光譜，然后在最大共振光散射峰處(λ＝560.0nm)測量溶液的共振光散射強度；

B、于10mL容量瓶中依次加入適量的堿性橙、BR緩沖液、CTMAB和DNA，然后用水定容至刻度，混勻，靜置15分鐘后進行測試；在200-800nm的波長范圍內，在Δλ＝0nm的條件下同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器，狹縫寬度為5.0nm，波長掃描速度為200nm/min，得到共振光散射光譜，然后在最大共振光散射峰處(λ＝560.0nm)測量溶液的共振光散射強度；

C、通過檢測得到的DNA加入前后堿性橙-CTMAB體系的共振光散射峰強度增加值來計算DNA濃度大小。

DNA對堿性橙-CTMAB體系共振光散射峰強度的增加程度用ΔI_RLS＝I_RLS–I⁰_RLS表示，其中，I⁰_RLS和I_RLS分別代表DNA加入前后體系的共振光散射強度。ΔI_RLS值反映DNA濃度大小，ΔI_RLS值越大說明DNA濃度越高。

以下為本發(fā)明提供的檢測方法的原理：對下列體系進行檢測，得到共振光散射光譜。

分別配置下列體系：ctDNA，CTMAB，CTMAB-ctDNA，堿性橙，堿性橙-ctDNA，堿性橙-CTMAB，堿性橙-CTMAB-ctDNA，測定各體系的共振光散射光譜，實驗結果如圖1所示。(a)ctDNA；(b)CTMAB；(c)CTMAB-ctDNA；(d)堿性橙(e)堿性橙-ctDNA；(f)堿性橙-CTMAB；(g)堿性橙-CTMAB-ctDNA。

檢測條件為:堿性橙,3.0×10^-4mol/L；CTMAB,1.6×10^-5mol/L；ctDNA,1.0×10^-6g/mL；pH＝7.50。

由檢測結果可知：堿性橙在303nm和560nm處有兩個弱的共振光散射峰。從圖1(曲線a，b)可以看出，ctDNA和CTMAB的共振光散射強度很弱，在實驗條件下沒有共振光散射峰。從圖1(曲線c)可以看出，CTMAB-ctDNA復合體系在300nm處有一個共振光散射峰，說明CTMAB與核酸發(fā)生作用，其作用力為靜電引力和疏水作用力。圖1(曲線d,e)說明ctDNA對堿性橙的共振光散射光譜幾乎沒有影響，表明ctDNA和堿性橙間的靜電力和疏水作用力比較弱。從圖1(曲線f)可以看出，CTMAB能明顯增強堿性橙的共振光散射強度。通過靜電力和疏水作用力，堿性橙溶于CTMAB膠束中而形成聚集體。圖1(曲線g)說明ctDNA能使堿性橙-CTMAB復合物的共振光散射光強度明顯增強，這表明以CTMAB為媒介，ctDNA能與堿性橙-CTMAB復合體系發(fā)生作用形成離子締合物。ctDNA對堿性橙-CTMAB復合體系共振光散射峰強度的增加程度(ΔI_RLS)能反映ctDNA濃度大小。

通過進一步的檢測，確定最佳實驗條件。

1、確定堿性橙的最佳濃度

當堿性橙濃度低于1.6×10^-4mol/L時，隨著堿性橙濃度的增大，堿性橙-CTMAB和堿性橙-CTMAB-ctDNA體系的共振光散射峰從475nm左右紅移至560nm處。當堿性橙濃度大于1.6×10^-4mol/L時，隨著堿性橙濃度的增加，位于560nm處的共振光散射峰位置不再發(fā)生變化。

堿性橙濃度對ΔI_RLS的影響如圖2所示。隨著堿性橙濃度的增加，ΔI_RLS先增強，后減弱。當堿性橙濃度為3.0×10^-4mol/L時，ΔI_RLS最強。實驗條件為:CTMAB,1.6×10^-5mol/L；ctDNA,1.0×10^-6g/mL；pH＝7.50。

2、確定CTMAB的最佳濃度

CTMAB濃度對ΔI_RLS的影響如圖3所示。同樣，隨著CTMAB濃度的增加，ΔI_RLS先增強后減弱。當CTMAB濃度為1.6×10^-5mol/L時，體系ΔI_RLS達最大值。實驗條件為：堿性橙,3.0×10^-4mol/L；ctDNA,1.0×10^-6g/mL；pH＝7.50。

3、確定最佳pH值

通過改變BR緩沖液的pH值，我們考察了pH對△I_RLS的影響，結果如圖4所示。在4.10-10.20pH范圍內，隨著pH增大，△I_RLS逐漸增強，在pH為中性7.00時達到最大值并保持穩(wěn)定。在考察范圍內，pH值7.50最接近中性pH，為最佳pH值。實驗條件為：堿性橙,3.0×10^-4mol/L；CTMAB,1.6×10^-5mol/L；ctDNA,1.0×10^-6g/mL。

4、確定最佳孵育時間

體系的穩(wěn)定性和孵育時間對一種分析方法的推廣應用具有重要意義。實驗表明，當體系各成分混合后，△I_RLS在15min達到最大(最佳孵育時間)，并能在90分鐘內保持穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

5、工作曲線和檢測限

在最佳實驗條件下(堿性橙濃度為3.0×10^-4mol/L，CTMAB濃度為1.6×10^-5mol/L，pH為7.50，穩(wěn)定時間15min)，繪制ctDNA的工作曲線，得到如下分析參數(shù)：線性范圍：2.5×10^-8～5×10^-7g/mL(相關性系數(shù)＝0.989),5×10^-7～3×10^-5g/mL(相關性系數(shù)＝0.991)，檢測限：8.5ng/mL(S/N＝3)。可見，該方法線性范圍寬且有較高的靈敏度。

本方案的有益之處在于：本發(fā)明以堿性橙-溴化十六烷基三甲基銨(CTMAB)為探針，建立了測定DNA的靈敏的共振光散射方法。測試在普通的熒光分光光度計上選擇合適的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度，采用相等的激發(fā)和發(fā)射波長同時掃描激發(fā)和發(fā)射單色器(Δλ＝0nm)即可得到。本發(fā)明以DNA加入前后堿性橙-CTMAB體系共振光散射強度出現(xiàn)的靈敏信號(共振光散射峰強度增加值，ΔI_RLS)為檢測信號，建立其與DNA濃度之間的關系。本研究方法具有操作簡單﹑測定靈敏度高等特點，檢測限可達納克級，為生化和臨床分析提供了一條新的途徑，具有廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1：共振光散射光譜圖。

圖2：堿性橙濃度對ΔI_RLS的影響圖。

圖3：CTMAB濃度對ΔI_RLS的影響圖。

圖4：pH對ΔI_RLS的影響圖。

具體實施方式

實施例

一種以堿性橙-CTMAB為探針檢測DNA的方法，包括以下步驟：

A、于10mL容量瓶中依次加入適量的堿性橙、BR緩沖液和CTMAB，然后用水定容至刻度，混勻，靜置15分鐘后進行測試；在200-800nm的波長范圍內，在Δλ＝0nm的條件下同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器，狹縫寬度為5.0nm，波長掃描速度為200nm/min，得到共振光散射光譜，然后在最大共振光散射峰處(λ＝560.0nm)測量溶液的共振光散射強度；

B、于10mL容量瓶中依次加入適量的堿性橙、BR緩沖液、CTMAB和DNA，然后用水定容至刻度，混勻，靜置15分鐘后進行測試；在200-800nm的波長范圍內，在Δλ＝0nm的條件下同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器，狹縫寬度為5.0nm，波長掃描速度為200nm/min，得到共振光散射光譜，然后在最大共振光散射峰處(λ＝560.0nm)測量溶液的共振光散射強度；

C、通過檢測得到的DNA加入前后堿性橙-CTMAB體系的共振光散射峰強度增加值來計算DNA濃度大小。

DNA對堿性橙-CTMAB體系共振光散射峰強度的增加程度用ΔI_RLS＝I_RLS–I⁰_RLS表示，其中，I⁰_RLS和I_RLS分別代表DNA加入前后體系的共振光散射強度。ΔI_RLS值反映DNA濃度大小，ΔI_RLS值越大說明DNA濃度越高。

利用標準加入法測定了合成樣品中核酸的含量，實驗結果見表1。從表中結果可見，該方法對合成樣品中核酸含量的測定結果令人滿意。

表1合成樣品中核酸的測定

實驗條件:BSA:1.0×10^-6g/mL；Mg²⁺:1.0×10^-6mol/L；K⁺:6.0×10^-6mol/L；Na⁺:1.0×10^-5mol/L；pH＝7.50

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。