背景技術(shù)：

化合物2-(2，6-二氯苯亞甲基)氨基胍，也稱為胍那芐，是一種用作抗高血壓藥物的α-2型α激動(dòng)劑。

胍那芐的不同衍生物已經(jīng)被報(bào)道。例如，US 3,982,020(山德士公司)公開了取代的苯亞甲基肼類衍生物及其用途：作為降血糖-抗高血糖藥物、抗肥胖藥物和消炎藥。US 2004/0068017(博士倫公司)公開了取代的苯亞甲基肼類衍生物能夠增加眼部細(xì)胞里明膠酶A的活性。這些分子在治療原發(fā)性開角型青光眼方面有應(yīng)用。WO 2008/061647(源禾制藥公司)公開引年N-(2-氯-3，4-二甲氧基苯亞甲基氨)胍用作VEGFR抑制劑，及其在治療或預(yù)防在腫瘤的生長和/或炎癥條件下有害血管形成的相關(guān)應(yīng)用。WO 2005/031000(阿卡迪亞制藥公司)公開了取代的苯亞甲基肼類衍生物，及其在治療急性疼痛和慢性神經(jīng)性疼痛中的用途。最后，EP1908464(法國國家科學(xué)研究中心CNRS)公開了胍那芐和氯胍那芐，及其在治療包括亨廷頓氏病在內(nèi)的多膠氨擴(kuò)張相關(guān)疾病方面的用途。

最近有報(bào)道稱胍那芐在許多其他領(lǐng)域的疾病方面有治療潛力。最近注意到胍那芐有抗朊病毒活性(Tribouillard-Tanvier等，2008年，《公共科學(xué)圖書館·綜合3》，e1981)。有報(bào)道稱胍那芐在保護(hù)細(xì)胞免于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊方面具有驚人寬廣的活性，在細(xì)胞試驗(yàn)中顯示突變亨廷頓蛋白的積累減弱(WO 2008/041133)，并且保護(hù)保護(hù)細(xì)胞免于在Min6和INS-1胰腺β細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中容易發(fā)生胰島素Akita突變體的錯(cuò)誤折疊表達(dá)的致死作用(Tsaytler等，2011年，《科學(xué)》，332卷，第91-94頁)。WO2014/138298和韋等(《自然通訊》2015年，6卷，第6532頁，DOI：10.1038/ncomms7532)公開了胍那芐螞蟻及其在治療脫髓鞘疾病例如多發(fā)性硬化方面的使用。

還有研究表明，當(dāng)海拉細(xì)胞暴露于由N-糖基化衣霉素抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的其他細(xì)胞毒性ER-應(yīng)激時(shí)，胍那芐能夠以劑量依賴方式促進(jìn)海拉細(xì)胞的存活率(Tsaytler等，《科學(xué)》，2011年)。細(xì)胞生存能力的定量評(píng)估顯示，胍那芐以大約0.4μM的半數(shù)有效濃度使得ER應(yīng)激下的海拉細(xì)胞的存活率加倍。α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑氯壓定和α2-腎上腺素受體拮抗劑依法克生(efaroxan)都不能保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒性ER應(yīng)激的侵害，依法克生不會(huì)干擾胍那芐的保護(hù)作用(Tsaytler等，《科學(xué)》，2011年)。這些觀察表明，胍那芐保護(hù)細(xì)胞免于致命ER應(yīng)激的作用機(jī)制與α2-腎上腺素受體無關(guān)。胍那芐通過連接到蛋白磷酸酶1的調(diào)節(jié)子單位，PPP1R15A(GADD34)，選擇性地破壞翻譯起始因子2(eIF2α)的α子單元的應(yīng)激誘導(dǎo)的脫磷酸作用，從而保護(hù)細(xì)胞免于遭受其他錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的致命累積。胍那芐通過可用的伴侶將應(yīng)激下細(xì)胞的翻譯速率設(shè)置為可控制的水平，從而恢復(fù)蛋白質(zhì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。有報(bào)道稱胍那芐不連接到構(gòu)建的PPP1R15B(CReP)，因此不抑制非應(yīng)激下細(xì)胞的翻譯(Tsaytler等，《科學(xué)》，2011年)。

不能通過安裝足夠的未折疊蛋白響應(yīng)(UPR)來保持ER內(nèi)的蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，被認(rèn)為是很多病理狀況的驅(qū)動(dòng)因素。因此，本文所描述的分子能抑制eIF2a磷酸酶對(duì)蛋白質(zhì)合成的微調(diào)，可能對(duì)大量疾病引起的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有治療作用，尤其是對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累有治療作用。

Tribouillard-Tanvier等，《公共科學(xué)圖書館·綜合3》，e1981(2008年)和EP1908464A公開了亞芐基胍衍生物包含胍作為末端基團(tuán)。然而，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)末端基團(tuán)易于代謝，其影響化合物的生物利用度。此外，以前的研究還表明，(雜)芳基團(tuán)必須至少被二鹵化，以使化合物表現(xiàn)出有用的藥理活性(例如參見Tribouillard-Tanvier等，《公共科學(xué)圖書館·綜合3》，e1981(2008年)和EP1908464A，CNRS)。然而，與以前的研究結(jié)果相反，本申請(qǐng)的申請(qǐng)人驚人地發(fā)現(xiàn)包含修飾的末端基團(tuán)的單鹵代(雜)芳基衍生物也具有活性。因此，期望提供替代物，其具有增強(qiáng)的活性和/或生物利用度。

本發(fā)明旨在提供基于胍那芐中心結(jié)構(gòu)的替代化合物，所述化合物對(duì)治療蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激相關(guān)疾病、尤其是與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)積累有關(guān)的疾病具有潛在治療應(yīng)用。

發(fā)明概述

本發(fā)明的第一方面涉及通式(I)的化合物，或其藥學(xué)可接受的鹽，

其中：

Hal＝F、Cl、Br、I

X是-CR1＝或-N＝，

Y是-CR2＝或-N＝，

Z是-CR3＝或-N＝，

W是-CR4＝或-N＝，

R1選自H、Hal、烷基和O-烷基；

R2選自H、Hal、烷基、O-烷基和C(O)R6；

R3選自H、Hal、烷基和O-烷基；

R4是H、Cl、F、I或Br；

R5是H或烷基、環(huán)烷基、芳烷基、烯基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基、C(O)-烷基和C(O)-芳基，并且上述每一個(gè)基團(tuán)被一個(gè)或多個(gè)R7基團(tuán)任選取代；

R6選自O(shè)H、O-烷基、O-芳基、芳烷基、NH₂、NH-烷基、N(烷基)₂、NH-芳基、CF₃、烷基和烷氧基；

每個(gè)R₇獨(dú)立地選自鹵素、OH、CN、COO-烷基、芳烷基、雜環(huán)基、S-烷基、SO-烷基、SO₂-烷基、SO₂-芳基、COOH、CO-烷基、CO-芳基、NH₂、NH-烷基、N(烷基)₂、CF₃、烷基和烷氧基。

其中，如果Hal是Cl且R4也是Cl時(shí)，R5不是H。

本發(fā)明的第二方面涉及包含通式(II)化合物的藥物組合物，

其中：

Hal＝F、Cl、Br、I

X是-CR1＝或-N＝，

Y是-CR2＝或-N＝，

Z是-CR3＝或-N＝，

W是-CR4＝或-N＝，

R1選自H、Hal、烷基和O-烷基；

R2選自H、Hal、烷基、O-烷基和C(O)R6；

R3選自H、Hal、烷基和O-烷基；

R4是H、Cl、F、I或Br；

R5是H或烷基、環(huán)烷基、芳烷基、烯基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基、C(O)-烷基和C(O)-芳基，并且上述每一個(gè)基團(tuán)被一個(gè)或多個(gè)R7基團(tuán)任選取代；

R6選自O(shè)H、O-烷基、O-芳基、芳烷基、NH₂、NH-烷基、N(烷基)₂、NH-芳基、CF₃、烷基和烷氧基；

每個(gè)R₇獨(dú)立地選自鹵素、OH、CN、COO-烷基、芳烷基、雜環(huán)基、S-烷基(Salkyl)、SO-烷基、SO₂-烷基、SO₂-芳基、COOH、CO-烷基、CO-芳基、NH₂、NH-烷基、N(烷基)₂、CF₃、烷基和烷氧基。

其中，如果Hal是Cl且R4也是Cl時(shí)，R5不是H；

所述藥物組合物還具有合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。

本發(fā)明的第三方面涉及通式(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，用于治療與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是治療與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的疾病，特別是與蛋白病構(gòu)象紊亂有關(guān)的疾病：

其中：

Hal＝F、Cl、Br、I

X是-CR1＝或-N＝，

Y是-CR2＝或-N＝，

Z是-CR3＝或-N＝，

W是-CR4＝或-N＝，

R1選自H、Hal、烷基和O-烷基；

R2選自H、Hal、烷基、O-烷基和C(O)R6；

R3選自H、Hal、烷基和O-烷基；

R4是H、Cl、F、I或Br；

R5是H或烷基、環(huán)烷基、芳烷基、烯基、環(huán)烯基、雜環(huán)基、芳基、C(O)-烷基和C(O)-芳基，并且上述每一個(gè)基團(tuán)被一個(gè)或多個(gè)R7基團(tuán)任選取代；

R6選自O(shè)H、O-烷基、O-芳基、芳烷基、NH₂、NH-烷基、N(烷基)₂、NH-芳基、CF₃、烷基和烷氧基；

每個(gè)R7獨(dú)立地選自鹵素、OH、CN、COO-烷基、芳烷基、雜環(huán)基、S-烷基、SO-烷基、SO₂-烷基、SO₂-芳基、COOH、CO-烷基、CO-芳基、NH₂、NH-烷基、N(烷基)₂、CF₃、烷基和烷氧基。

和藥學(xué)上可接受的賦形劑。

通式(I)是通式(II)的一個(gè)具體實(shí)施例。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的化合物，例如胍那芐，上文定義的通式(I)或(II)的化合物有利地對(duì)腎上腺素α2A受體不表現(xiàn)出活性。對(duì)于α-2腎上腺素活性的缺失使得這些化合物在治療下列疾病方面有治療作用：與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的疾病。α-2腎上腺素活性的缺失意味著可以以合適的劑量服用通式(I)或(II)的化合物來治療上述疾病，而對(duì)血壓沒有任何明顯的作用。

發(fā)明詳述

如在此所使用的，術(shù)語“烷基”包括飽和直鏈和支鏈烷基基團(tuán)。優(yōu)選地，所述烷基基團(tuán)是C_1-20烷基基團(tuán)，更優(yōu)選地是C_1-15，還優(yōu)選地是C_1-12烷基基團(tuán)，還優(yōu)選地是C_1-6烷基基團(tuán)，更優(yōu)選地是C_1-3烷基基團(tuán)。特別優(yōu)選地烷基基團(tuán)例如包括：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊烷基和己基。

如在此所使用的，術(shù)語“環(huán)烷基”指的是環(huán)狀烷基基團(tuán)。優(yōu)選地，所述環(huán)烷基是C_3-12環(huán)烷基基團(tuán)。

如在此所使用的，術(shù)語“烯基”指的是包含一個(gè)或多個(gè)碳碳雙鍵的基團(tuán)，可以是支鏈的或無支鏈的。優(yōu)選地，所述烯基是C_2-20烯基基團(tuán)，更優(yōu)選地是C_2-15烯基基團(tuán)，還優(yōu)選地是C_2-12烯基基團(tuán)，或優(yōu)選地是C_2-6烯基基團(tuán)，更優(yōu)選地是C_2-3烯基基團(tuán)。術(shù)語“環(huán)烯基”據(jù)此解釋。

如在此所使用的，術(shù)語“芳基”指的是C_6-12芳香基團(tuán)。典型的例子包括苯基和萘基等。

如在此所使用的，術(shù)語“雜環(huán)”(在此也稱為“雜環(huán)基(heterocyclyl)”和“雜環(huán)的(heterocyclic)”)指的是4到12元雜環(huán)，優(yōu)選地是包含一個(gè)或多個(gè)雜原子的4到12元，優(yōu)選4到6元飽和、不飽和或部分不飽和環(huán)狀基團(tuán)，所述雜原子選自N、O和S，并且所述環(huán)狀基團(tuán)其可選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)CO基團(tuán)。術(shù)語“雜環(huán)”包括下文定義的雜芳基和雜環(huán)烷基基團(tuán)。

如在此所使用的，術(shù)語“雜芳基”指的是4到12元芳香烴，包括一個(gè)或多個(gè)雜原子。優(yōu)選地，所述雜芳基基團(tuán)是包含一個(gè)或多個(gè)雜原子N、O或S的4到6元環(huán)芳香基團(tuán)。合適的雜芳基基團(tuán)包括吡咯、吡唑、嘧啶、吡嗪、吡啶、喹啉、噻吩、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噻唑、惡唑、異噻唑、異惡唑、咪唑、呋喃等等。

如在此所使用的，術(shù)語“雜環(huán)烷基”指的是包含一個(gè)或多個(gè)雜原子的3到12元，優(yōu)選的4到6元環(huán)狀脂肪基團(tuán)，所述雜原子選自N、O和S。優(yōu)選5到6元含N雜環(huán)烷基。優(yōu)選的雜環(huán)烷基基團(tuán)包括哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、硫代嗎啉基和嗎啉基。更優(yōu)選地，所述雜環(huán)烷基基團(tuán)選自N-哌啶基、N-吡咯烷基、N-哌嗪基、N-硫代嗎啉基和N-嗎啉基。

如在此所使用的，術(shù)語“芳烷基”包括但不限于具有芳基和烷基兩個(gè)官能團(tuán)的基團(tuán)。舉例來說，該術(shù)語包括烷基基團(tuán)的一個(gè)氫原子被芳基例如苯基取代的基團(tuán)。典型的芳烷基基團(tuán)包括芐基、苯乙基等等。

以下是通式(I)或(II)的特定實(shí)施例：

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，Hal是Cl。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，X是-CR1＝。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，Y是-CR2＝。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，Y是N。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，Z＝-CR3＝。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，W＝-CR4＝。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，R1是H或F，更優(yōu)選H。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，R2是H或F，更優(yōu)選H。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，R3是H或F，更優(yōu)選H。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，R4是H、Cl或F，更優(yōu)選H或F，更優(yōu)選H。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，R3和R4都是H。

在一個(gè)實(shí)施例中，R5是H、烯基或烷基，每個(gè)烯基或烷基被一個(gè)或多個(gè)R7基團(tuán)任選取代。

在一個(gè)實(shí)施例中，R7基團(tuán)選自鹵素、OH、雜環(huán)基、SO-烷基、SO₂-烷基、O烷基，

在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物選自以下化合物：

及通式(I)或(II)的化合物在藥學(xué)可接受鹽。

在一個(gè)選實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物選自如上文所述的化合物4、6、10、11、12、14、17、18，更優(yōu)選，選自如上文所述的化合物4、11、17、18。

化合物

本發(fā)明一個(gè)方面涉及如上定義的通式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的優(yōu)選方面應(yīng)用時(shí)做了必要的修改。對(duì)于本發(fā)明的這個(gè)方面，特別優(yōu)選的化合物包括本文所述的化合物1、2、5和10。

制備過程

本發(fā)明的另一方面涉及制備上文所述的通式(I)或(II)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，包括通式(A)的化合物或其互變異構(gòu)體形式與通式(B)的化合物的反應(yīng)步驟：

其中R5如上文所定義

其中X、Y、Z、W和Hal如上文所定義

可選地，隨后是將如上所述的式(A)和(B)的化合物之間反應(yīng)生成的化合物的R5基團(tuán)改性為另一個(gè)R5基團(tuán)的步驟。

優(yōu)選地，該方法還可以包括將上述獲得的化合物(I)或(II)提純的步驟。

化合物(A)和(B)之間的偶聯(lián)反應(yīng)可以在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，例如，醇，例如乙醇。可以在室溫和反應(yīng)混合物的沸騰溫度之間的溫度下進(jìn)行。

R5基團(tuán)的改性反應(yīng)可以通過應(yīng)用或改進(jìn)已知的方法進(jìn)行。例如，在偶聯(lián)(A)和(B)之后獲得的化合物中，R5可以是被R7基團(tuán)取代的烷基：因此可能需要取代R7基團(tuán)。這種取代反應(yīng)通常是已知的。作為有代表性的實(shí)施例，可以預(yù)期在通式(I)或(II)的化合物中用R7＝鹵素替代R7＝OH。這種反應(yīng)可以在鹵化劑例如氯化劑例如SOCl₂存在的條件下進(jìn)行。通常，這種反應(yīng)可以在有機(jī)溶劑例如二氯甲烷中進(jìn)行。另一個(gè)有代表性的實(shí)施例是用含有R7＝N的雜環(huán)，例如吡咯烷，來代替R7＝鹵素。這種反應(yīng)可以在堿例如TEA存在的條件下進(jìn)行。通常，這種反應(yīng)可以在有機(jī)溶劑例如THF中進(jìn)行。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，該方法還可以進(jìn)一步包括通過通式(C)的化合物或其一種鹽與S-甲基異硫脲氨基脲氫碘化物(D)或其一種鹽反應(yīng)制備上文定義的通式(A)的化合物的步驟：

其中R5如上所定義，

其中Lg是離去基團(tuán)，例如-S-烷基，例如-S-甲基。

通常，通式(C)和(D)的化合物之間的反應(yīng)可以在堿性水溶液中進(jìn)行，例如在包含氫氧化鈉的水溶液中進(jìn)行。

通式(C)和(D)的化合物之間的偶聯(lián)反應(yīng)之后還可以進(jìn)一步包括提純步驟。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法可選地包括通過通式(E)化合物與肼衍生物例如水合肼或甲基肼反應(yīng)制備通式(C)化合物的步驟：

本發(fā)明的方法可選地包括由通式(E′)的化合物制備通式(E)的化合物的步驟：

其中(R5′)表示R5的前體基團(tuán)。

當(dāng)(E)不能從市場上買到時(shí)，并且不能通過下文所述從(F)和(G)制備(E)時(shí)，可能需要進(jìn)行該反應(yīng)。

因此，可能需要使用能轉(zhuǎn)化為(E)的前體(E′)。

前體是可以通過取代，消除或其他衍生化學(xué)反應(yīng)改性為所需化合物的基團(tuán)或化合物。

作為示例性實(shí)施例，可以通過應(yīng)用已知的方法或改進(jìn)已知的方法來進(jìn)行R5′到所需的R5基團(tuán)的改性反應(yīng)。例如，在通式(E)中，R5可以是被R7基團(tuán)取代的烷基：因此可能需要將(E′)中的R7′基團(tuán)改性為(E)中所需的R7′。這樣的改性反應(yīng)通常是已知的。作為有代表性的實(shí)施例，可能需要用R7＝SO2(烷基)取代包含基團(tuán)R7′＝S(烷基)的前體R5′。這種反應(yīng)可以在MCPBA存在的條件下進(jìn)行。通常，這種反應(yīng)可以在有機(jī)溶劑例如二氯甲烷中進(jìn)行。

本發(fā)明的方法可包括通過化合物(F)與N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(G)反應(yīng)，適當(dāng)?shù)刂苽浠衔?E)或(E′)的步驟。

Lg’-R5”

(F)

其中R5”表示如上所定義的R5或R5′，并且Lg′表示離去基團(tuán)，例如鹵素原子或羥基(OH)基團(tuán)，

通常，(F)和(G)的偶聯(lián)可以根據(jù)Gabriel合成條件進(jìn)行。

根據(jù)示例性實(shí)施例，該反應(yīng)可以在堿存在的條件下進(jìn)行，所述堿例如有機(jī)或無機(jī)堿，通常為TEA或K₂CO₃或NaOAc的，具體來說，其中Lg含有鹵素。

根據(jù)另一個(gè)示例性實(shí)施例，第一步可以在偶氮二羧酸二異丙酯和PPh3存在的條件下進(jìn)行，具體來說，其中Lg＝OH。

化合物(F)、(G)、(B)通常是在市場上可買到的。

通式(D)的化合物：

其中，Lg是-S-烷基，例如，-S-甲基也是本發(fā)明的一部分。

除了上文公開的方法外，本發(fā)明的化合物和方法可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法制備。這些化合物例如可以應(yīng)用下文所述的方法或改進(jìn)來合成，或本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的這些方法的變形方法來合成。合適的改進(jìn)和替換對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的和熟知的，或者可以從科學(xué)文獻(xiàn)中容易地獲得。

具體來說，這些方法可在R.C.Larock，《有機(jī)官能團(tuán)轉(zhuǎn)換》，VCH出版社，1989年中找到。

應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的化合物可以含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱取代的碳原子，并且可以以光學(xué)活性或外消旋形式分離。因此，除非特別指出特定的立體化學(xué)或異構(gòu)形式，否則這里的結(jié)構(gòu)意指其所有手性、非對(duì)映異構(gòu)體、外消旋形式和所有幾何異構(gòu)形式。如何制備和分離這種光學(xué)活性形式在本領(lǐng)域是已知的。例如，立體異構(gòu)體的混合物可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離，包括但不限于：拆分外消旋形式、正相、反相和手性色譜分析，優(yōu)先成鹽、重結(jié)晶等，或由手性原料手性合成，或有意合成目標(biāo)手性中心。

本發(fā)明的化合物可以通過多種合成途徑制備。試劑和原料是市場上能買到的，或者本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過已知的技術(shù)合成的。除非另有說明，所有取代如上文所定義。

在本文所述的反應(yīng)中，可能需要保護(hù)反應(yīng)官能團(tuán)，例如羥基、氨基、亞氨基、巰基或羧基，其中這些官能團(tuán)是最終產(chǎn)物中所需要的，以避免其不必要地參與反應(yīng)。按照慣例，可以使用傳統(tǒng)的保護(hù)基團(tuán)，例如，參見T.W.Greene和P.GM.Wuts，《有機(jī)合成中的保護(hù)基》，約翰·成利父子出版公司，1991年；J.F.W.McOmie，《有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基團(tuán)》，施普林格科學(xué)出版社，1973年。

一些反應(yīng)可以在堿存在的條件下的進(jìn)行。對(duì)在該反應(yīng)中使用的堿的性質(zhì)沒有特別限制，并且在此類型的反應(yīng)中常規(guī)使用的任何堿同樣地可以在此使用，只要其對(duì)分子的其它部分沒有不利影響。合適的堿的例子包括：氫氧化鈉、碳酸鉀、三乙胺、堿金屬氫化物，例如氫化鈉和氫化鉀；烷基鋰化合物，例如甲基鋰和丁基鋰；以及堿金屬醇鹽，例如甲醇鈉和乙醇鈉。

通常，反應(yīng)在合適的溶劑中進(jìn)行?？梢允褂枚喾N溶劑，只要它對(duì)反應(yīng)或所涉及的試劑沒有不利影響。合適的溶劑的例子包括：烴，其可以是芳族，脂族或脂環(huán)族烴，例如己烷、環(huán)己烷、苯、甲苯和二甲苯；酰胺，例如二甲基甲酰胺；醇，例如乙醇和甲醇，以及醚，例如乙醚，和四氫呋喃。

反應(yīng)可以在寬的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。通常，我們發(fā)現(xiàn)在0℃至150℃(更優(yōu)選地，約從室溫至100℃)的溫度下進(jìn)行反應(yīng)是方便的。反應(yīng)所需的時(shí)間范圍也很寬，這取決于許多因素，特別是反應(yīng)溫度和試劑的性質(zhì)。但是，只要反應(yīng)在上述優(yōu)選條件下進(jìn)行，通常3小時(shí)至20小時(shí)就足夠了。

由此制備的化合物可以通過常規(guī)方法從反應(yīng)混合物中回收。例如，可以通過從反應(yīng)混合物中蒸餾除去溶劑來回收化合物，或者如果需要，從反應(yīng)混合物中蒸餾出溶劑之后，將殘余物倒入水中，然后用與水不混溶的有機(jī)溶劑萃取，并從萃取物中蒸餾出溶劑。此外，如果需要，可以通過多種已知的技術(shù)進(jìn)一步提純反應(yīng)產(chǎn)物，例如重結(jié)晶、再沉淀或各種色譜技術(shù)，特別是柱色譜或制備型薄層色譜。

本發(fā)明的方法還可包括分離所得產(chǎn)物通式(I)的步驟。

起始反應(yīng)物和/或試劑可以是在市場上買到的，或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過應(yīng)用或調(diào)整以下公開的實(shí)驗(yàn)部分的步驟容易地制備。

治療應(yīng)用

通式(I)或(II)的化合物對(duì)于治療與錯(cuò)誤折疊和/或未折疊的蛋白質(zhì)的積累有關(guān)的疾病具有潛在的治療用途。尤其是，通式(I)或(II)的化合物對(duì)細(xì)胞毒性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和與年齡相關(guān)的疾病具有保護(hù)作用。

本發(fā)明的另一方面涉及上文定義的通式(I)或(II)的化合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)累積有關(guān)的疾病。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療這樣的疾?。涸摷膊〉淖饔脵C(jī)制中涉及錯(cuò)誤折疊和/或未折疊的蛋白質(zhì)的累積(Brown等，2012年，《生理學(xué)前沿Frontiers in Physiology》3卷，Article 263)。

本發(fā)明的另一方面涉及上文定義的通式(I)或(II)的化合物在制備用于治療蛋白質(zhì)構(gòu)象紊亂的藥物中的用途。蛋白質(zhì)構(gòu)象紊亂指的是某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不正常，從而破壞身體的細(xì)胞、組織和器官的功能的一類疾病。通常，蛋白質(zhì)不能折疊成其正常構(gòu)象，而是以這種錯(cuò)誤折疊的和/或未折疊的狀態(tài)存在，那么這些蛋白質(zhì)在某種程度上變成有毒的(毒性的獲得)，或者失去其正常功能，或其生物活性降低。蛋白質(zhì)構(gòu)象紊亂(proteopathies)，也稱為蛋白質(zhì)病(proteinopathies)、蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病或蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病，包括許多疾病，例如：阿耳滋海默氏病、帕金森氏病、朊病毒病、2型糖尿病、淀粉樣變性，以及許多各種不同的其他疾病(參見下文的非限制實(shí)施例)。

如在此所使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)病(proteinopathies)、蛋白質(zhì)構(gòu)象紊亂(proteopathies)、蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病、與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病、與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的疾病、與細(xì)胞毒性ER應(yīng)激有關(guān)的疾病、UPR相關(guān)的疾病具有同樣的含義，指的是某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不正常從而破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的疾病。

如在此所使用的，術(shù)語“錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)”和“未折疊的蛋白質(zhì)”具有相同含義，指的是未能折疊成其正常構(gòu)象的蛋白質(zhì)。

如在此所使用的，術(shù)語“制備藥物”包括將上述一種或多種化合物直接作為藥物使用，還包括在進(jìn)一步篩選活性試劑的方法中或在生產(chǎn)這種藥物的任何階段使用上述化合物。

本發(fā)明的另一方面涉及治療患者以下疾病的方法：蛋白質(zhì)構(gòu)象紊亂、和/或與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的疾病，所述方法包括給上述患者服用治療有效量的上文定義的通式(I)或(II)的化合物。

術(shù)語“方法”指的是用于完成給定任務(wù)的方式、方法、技術(shù)和步驟，包括但不限于那些已知的方式、方法、技術(shù)和步驟，或容易被化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實(shí)踐者從已知的方式、方法、技術(shù)和步驟發(fā)展而來的方式、方法、技術(shù)和步驟。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“治療”包括消除、明顯抑制、減慢或逆轉(zhuǎn)疾病或機(jī)能失調(diào)的發(fā)展，明顯地改善疾病或機(jī)能失調(diào)的臨床癥狀，或明顯地防止疾病或機(jī)能失調(diào)臨床癥狀的出現(xiàn)。

如在此所使用的，術(shù)語“疾病”、“機(jī)能失調(diào)”、“癥狀”具有相同的含義。所述疾病與ER應(yīng)激響應(yīng)活性相關(guān)，和/或與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)，尤其與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積有關(guān)。

術(shù)語“治療有效量”指的是會(huì)在一定程度上減輕被治療的疾病或機(jī)能失調(diào)的一種或多種癥狀的被服用的化合物的量。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及上文定義的通式(I)或(II)的化合物用于治療UPR疾病的用途。術(shù)語“未折疊的蛋白質(zhì)響應(yīng)”或UPR指的是細(xì)胞防御系統(tǒng)抵抗錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的一個(gè)組成部分，其能夠使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)內(nèi)的折疊適應(yīng)變化的條件。UPR被激活以響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔中未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積。在這種情況下，UPR有兩個(gè)主要目的：(i)通過終止蛋白質(zhì)的翻譯恢復(fù)細(xì)胞的正常功能，(ii)激活信號(hào)通路使參與蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶的產(chǎn)量增加。如果沒有在一定時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，或者破壞時(shí)間延長，UPR會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。UPR的上游組分是ER-固有的跨膜蛋白IRE1、ATF6和PERK，它們感知折疊缺陷，從而以協(xié)調(diào)一致的方式重編蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并且恢復(fù)蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。激活的IRE1和PERK增加參與ER折疊的基因的轉(zhuǎn)錄，例如編碼分子伴侶BiP和GRP94的那些基因。激活的PERK通過使Ser51上的翻譯起始因子2(elF2α)的子單元磷酸化來減弱球蛋白的合成，同時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子ATF4的翻譯。后者控制另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)，反過來促進(jìn)PPP1R15A/GADD34的表達(dá)。PPP1R15A是終止UPR信號(hào)的負(fù)反饋環(huán)的效應(yīng)器，會(huì)吸收蛋白質(zhì)磷酸酶1(PP1c)的催化子單元，使得elF2α脫去磷酸，從而允許蛋白質(zhì)合成從新開始。UPR失效對(duì)于很多病理狀況是有利的，通過這種適應(yīng)性響應(yīng)的足夠刺激可能糾正這些病理狀況。應(yīng)激誘導(dǎo)的elF2α磷酸酶PPP1R5A-PP1的選擇性抑制劑延遲elF2α的脫磷酸作用，因此，選擇性地延遲應(yīng)激細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，而不影響非應(yīng)激細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，其基本表達(dá)eIF2α磷酸酶PPP1R15B-PP1。這延長了UPR的有益作用。蛋白質(zhì)合成的短暫減少對(duì)應(yīng)激細(xì)胞是有利的，因?yàn)闇p少合成的蛋白質(zhì)的通量會(huì)增加分子伴侶的有效性，從而保護(hù)細(xì)胞免于錯(cuò)誤折疊的應(yīng)激(Tsaytler等，2011年，《科學(xué)》，332卷，91-94頁)。2種elF2α磷酸酶PPP1R15A-PP1和PPP1R15B-PP1的非選擇性抑制劑可能具有不希望的作用，這是因?yàn)槌掷m(xù)的翻譯抑制是有害的。事實(shí)上，PPP1R15A和PPP1R15B的同時(shí)基因消融會(huì)導(dǎo)致小鼠早期胚胎死亡，表明抑制這兩種elF2α磷酸酶PPP1R15A-PP1和PPP1R15B-PP1在有機(jī)體內(nèi)是有害的。相反的，PPP1R15A的基因消融對(duì)小鼠沒有有害作用(哈丁等，2009年，《美國國家科學(xué)院刊》，106卷，1832-1837頁)。此外，預(yù)計(jì)PPP1R15A的特異性抑制劑在非應(yīng)激細(xì)胞內(nèi)是惰性的，這是因?yàn)樵诜菓?yīng)激下PPP1R15A是不表達(dá)的。因此，選擇性PPP1R15A抑制劑被預(yù)測是安全的。當(dāng)使用的劑量只導(dǎo)致磷酸酶的部分抑制時(shí)，兩種elF2α磷酸酶的非選擇性抑制劑對(duì)治療蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病可能也是有用的。

可以通過合適的實(shí)驗(yàn)來測定抵抗ER應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用。例如，在HeLa細(xì)胞內(nèi)測定細(xì)胞保護(hù)作用，其中ER應(yīng)激是通過添加包含衣霉素的媒介引起的，即同源核苷抗生素的混合物，其抑制UDP-HexNAc：聚戊烯醇-PHexNAc-1-P族酶，用于誘導(dǎo)未折疊的蛋白質(zhì)響應(yīng)。經(jīng)設(shè)定的時(shí)間后，使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞活性試劑盒(例如，同仁化學(xué)研究所的細(xì)胞活性計(jì)數(shù)試劑盒-8)測定WST-8進(jìn)入甲瓚的減少，來檢測在抑制劑化合物存在或不存在的條件下的細(xì)胞活性。抵抗ER應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用通過ER應(yīng)激之后活細(xì)胞增加的百分比(相對(duì)于對(duì)照組)來體現(xiàn)。合適實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步詳細(xì)說明在附加的實(shí)施例中列出。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，相對(duì)于對(duì)照組(例如，沒有抑制劑化合物)，通式(I)或(II)的化合物能使UPR的保護(hù)作用延長至少10％、至少20％，更優(yōu)選地，至少30％，甚至更優(yōu)選地，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，還優(yōu)選地，至少90％.

通式(I)或(II)的化合物是PPP1R15A-PP1相互作用的抑制劑，并產(chǎn)生保護(hù)作用。優(yōu)選地，這些化合物表現(xiàn)出保護(hù)作用，EC₅₀小于5μM，更優(yōu)選地，小于2μM，還優(yōu)選地，小于1μM。優(yōu)選的化合物應(yīng)該沒有α2腎上腺素活性。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在α-2-腎上腺素功能測試中，所述化合物沒有表現(xiàn)活性。

通式(I)或(II)的某些化合物選擇性地抑制PPP1R15A-PP1，從而延長UPR的保護(hù)作用，保護(hù)細(xì)胞免于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激。因此，本發(fā)明中描述的PPP1R15A-PP1的抑制劑對(duì)治療下列疾病有治療應(yīng)用：與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的疾病，更具體地，治療蛋白質(zhì)構(gòu)象紊亂。

在一個(gè)實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物能夠抑制PPP1R15A和PPP1R15B。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物能夠選擇性抑制PPP1R15A而非PPP1R15B。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及上文定義的通式(I)或(II)的化合物，用于治療與eIF2α磷酸化途徑有關(guān)的疾病，該疾病的作用方式中涉及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積。優(yōu)選地，所述疾病是PPP1R15A相關(guān)疾病或機(jī)能紊亂。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及上文定義的通式(I)或(II)的化合物，用于治療以下疾?。河蒭IF2α磷酸化作用和/或PPP1R15A活性引起，與eIF2α磷酸化作用和/或PPP1R15A活性有關(guān)，或伴隨有eIF2α磷酸化作用和/或PPP1R15A活性的疾病，該疾病的作用方式中涉及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的積累。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及上文定義的通式(I)或(II)的化合物，用于治療UPR機(jī)能紊亂，例如但不限于衰老(Naidoo等，2008年，《神經(jīng)科學(xué)期刊》，28卷，6539-6548頁)

如在此所使用的，“PPPlR15A相關(guān)疾病或機(jī)能失調(diào)”指的是以PPP1R15A活性異常為特征的疾病或機(jī)能失調(diào)，其作用方式中涉及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積?；钚援惓Ｖ傅氖牵?i)正常情況下不表達(dá)PPP1R15A的細(xì)胞中出現(xiàn)PPP1R15A表達(dá)；(ii)增加的PPP1R15A表達(dá)；或，(iii)增加的PPP1R15A活性。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種治療疾病狀態(tài)的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法通過PP1R15A的抑制作用減輕疾病狀態(tài)，該疾病狀態(tài)的作用方式中涉及錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積，其中，所述方法包括給哺乳動(dòng)物服用治療有效量的上文定義的通式(I)或(II)的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其其藥學(xué)上可接受的鹽，用于治療與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積和/或UPR機(jī)能失調(diào)有關(guān)的疾病，其中，與胍那芐相比，所述化合物沒有腎上腺素α2激動(dòng)劑活性，或者腎上腺素α2激動(dòng)劑活性降低。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其其藥學(xué)上可接受的鹽，用于治療與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積和/或UPR機(jī)能失調(diào)有關(guān)的疾病，其中，所述化合物對(duì)于表達(dá)PPP1R15B的非應(yīng)激細(xì)胞，不抑制該細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種治療疾病的方法，所述疾病的特征在于錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積和ER應(yīng)激響應(yīng)活性，所述方法包括給病人服用治療有效量的至少一種通式(I)或(II)的化合物，其中，所述化合物能夠調(diào)節(jié)ER應(yīng)激響應(yīng)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其其藥學(xué)上可接受的鹽，用于治療與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積和/或UPR機(jī)能失調(diào)有關(guān)的疾病，其中，所述化合物對(duì)于PPP1R15A-PP1全磷酸酶具有選擇性，而對(duì)于PPP1R15B-PP1全磷酸酶沒有活性或活性降低，其中，所述化合物的比例(對(duì)PPP1R15A-PP1全磷酸酶的活性/對(duì)PPP1R15B-PP1全磷酸酶的活性)至少等于或優(yōu)于胍那芐的比例(對(duì)PPP1R15A-PP1全磷酸酶的活性/對(duì)PPP1R15B-PP1全磷酸酶的活性)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其其藥學(xué)上可接受的鹽，用于治療與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積和/或UPR機(jī)能失調(diào)有關(guān)的疾病，其中：

-所述化合物對(duì)PPP1R15A-PP1全磷酸酶具有活性，但對(duì)PPP1R15B-PP1全磷酸酶沒有活性

或活性降低，以及；

-其中，所述化合物的比例(對(duì)PPP1R15A-PP1全磷酸酶的活性/對(duì)PPP1R15B-PP1全磷酸酶

的活性)至少等于或優(yōu)于胍那芐的比例(對(duì)PPP1R15A-PP1全磷酸酶的活性/對(duì)

PPP1R15B-PP1全磷酸酶的活性)；以及

-其中，與胍那芐相比，所述化合物對(duì)腎上腺素α2激動(dòng)劑活性沒有活性或活性降低。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，用于治療具有至少一個(gè)以下特征的疾?。?1)ER應(yīng)激、(2)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的細(xì)胞累積，以及(3)UPR。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通式(I)或通式(II)的PPP1R15A抑制劑或其其藥學(xué)上可接受的鹽，用于治療與至少一個(gè)以下疾病有關(guān)的患者：(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激、(2)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的細(xì)胞累積，以及(3)未折疊蛋白質(zhì)響應(yīng)。

所述疾病與ER應(yīng)激響應(yīng)活性有關(guān)和/或與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)，尤其是與錯(cuò)誤折疊和/或未折疊蛋白質(zhì)的累積有關(guān)，更具體地，所述疾病是蛋白質(zhì)構(gòu)象紊亂。根據(jù)本發(fā)明，疾病的非限制性例子包括但不限于：

神經(jīng)退行性疾病，例如：Tau蛋白病變(例如，阿耳滋海默氏病等)、共核蛋白病(例如，帕金森氏病等)、亨廷頓氏病和相關(guān)的多聚谷氨酰胺疾病、多聚丙氨酸疾病(例如，眼咽型肌肉萎縮等)、朊病毒病(也稱為傳染性海綿狀腦病)、脫髓鞘疾病，例如：腓骨肌萎縮癥牙病(也稱為遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺性周圍神經(jīng)病)、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(也稱為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病和葛雷克氏癥)和多發(fā)性硬化。

Tau蛋白病變的例子包括但不限于：阿耳滋海默氏病、進(jìn)行性核上性麻痹、皮質(zhì)基底核退化癥、額顳葉退化癥(皮克氏病)。FTD是一種神經(jīng)變性疾病，其特征在于：進(jìn)行性神經(jīng)元損失主要涉及額葉或顳葉；僅次于阿爾茨海默病(AD)的患病率，在年青癡呆癥的病例中FTD占20％。UPR參與Tau蛋白病變已得到充分地證實(shí)(參見Stoveken，2013年，《神經(jīng)科學(xué)雜志》，33卷，36期，14285-14287頁)。不受理論的約束，可以預(yù)料本發(fā)明的化合物是PPP1R15A抑制劑，會(huì)改善Tau蛋白病變的臨床表現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療阿爾海默氏病。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療選自下列疾病的一種疾?。侯~顳癡呆(FTD)、核上性麻痹和皮質(zhì)基底核退化癥，優(yōu)選地，F(xiàn)TD。

共核蛋白病的例子包括但不限于：帕金森氏病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)衰竭和多系統(tǒng)萎縮癥。最近，Colla等(《神經(jīng)科學(xué)雜志》，2012年，32卷，10期，3306-3320頁)證明eIF2α抑制劑通過抑制PPP1R15A調(diào)節(jié)的eIF2α的脫磷酸作用來增加eIF2α的磷酸化作用(Boyce等，《科學(xué)》，2005年，307卷，935-939頁)，在α-共核蛋白病的兩種動(dòng)物模型中，明顯地改善疾病的臨床癥狀。本發(fā)明的化合物是PPP1R15A抑制劑，會(huì)改善α-共核蛋白病的臨床表現(xiàn)，例如帕金森氏病。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的化合物用于治療α-共核蛋白病，例如帕金森氏病。

多聚谷氨酰胺疾病的例子包括但不限于：脊延髓肌萎縮癥(或肯尼迪病)、亨廷頓氏病、丘腦底核萎縮、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)1型、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)2型、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(馬查多-約瑟夫病)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)6型、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)7型和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)17型。在細(xì)胞測試中，胍那芐能夠減弱亨廷頓蛋白突變體的累積(WO2008/041133)。由于亨廷頓蛋白突變體是細(xì)胞溶質(zhì)的或細(xì)胞核的，因此這一發(fā)現(xiàn)是出乎意料的。但是，以前有證據(jù)表明突變的亨廷頓蛋白的代謝與ER應(yīng)激響應(yīng)有關(guān)(Nishitoh等，2002年，《基因與生長》，16卷，1345-55頁；Rousseau等，2004年，《美國國家科學(xué)院院刊》，101卷，9648-53頁；Duennwald和Lindquist，2008年，《基因與生長》，22卷，3308-19頁)。胍那芐保護(hù)細(xì)胞免于細(xì)胞毒性ER應(yīng)激以及減弱突變的亨廷頓蛋白的累積的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)，即可能存在ER應(yīng)激響應(yīng)影響突變亨廷頓蛋白的積累。但是，由于其降血壓作用，胍那芐不能用于治療人類蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病。相反的，本發(fā)明的胍那芐衍生物PPP1R15A抑制劑不具有α2腎上腺素活性，可以用于治療多聚谷氨酰胺疾病，更具體地說，亨廷頓氏病，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物在治療亨廷頓氏病。

多聚丙氨酸疾病的例子包括：眼咽型肌肉萎縮，是由poly(A)里的聚丙氨酸束結(jié)合蛋白質(zhì)核1(PABPN1)引起的。Barbezier等(2011年，《歐洲分子生物學(xué)組織期刊》，3卷，35-49頁)證明胍那芐能減少眼咽型肌萎縮癥患者的蛋白質(zhì)累積。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽，用于治療多聚丙氨酸疾病，尤其治療眼咽型肌萎縮。

人類朊病毒疾病的例子包括但不限于：傳統(tǒng)的克雅氏病、新變型克雅氏病(nvCJD，與牛海綿狀腦病相關(guān)的人類疾病)、杰茨曼-斯脫司勒-史茵克綜合征致命性家族性失眠癥和庫魯病。胍那芐能減少朊病毒感染的小鼠的癥狀(D·特里布亞爾-戈達(dá)爾等，2008年，《公共科學(xué)圖書館·綜合3》，e1981)。但是，由于其降血壓作用，胍那芐不能用于治療人類蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病。相反的，本發(fā)明的胍那芐衍生物PPP1R15A抑制劑不具有α2腎上腺素活性，可以用于治療朊病毒疾病。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療選自下列的疾?。嚎搜攀喜?、新變型克雅氏病、杰茨曼-斯脫司勒-史茵克綜合征致命性家族性失眠癥和庫魯病。

脫髓鞘疾病的特征在于，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的雪旺細(xì)胞的損失。與脫髓鞘疾病相關(guān)的癥狀的特征在于，中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有髓鞘的軸突的損失。髓鞘細(xì)胞的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的非限制實(shí)施例(包括少突膠質(zhì)細(xì)胞和雪旺細(xì)胞)選自：CC1、髓鞘堿性蛋白(MBP)、半乳糖神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)移酶(CGT)、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)、少突細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(OMG)、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNP)、髓鞘蛋白零(MPZ)、外周髓鞘蛋白22(PMP22)、連接蛋白32(Cx32)、蛋白質(zhì)2(P2)、半乳糖腦苷脂(GalC)、硫苷脂和蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)。對(duì)雪旺細(xì)胞來說，MPZ、PMP22、Cx32和P2是優(yōu)選的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞來說，PLP、MBP和MAG是優(yōu)選的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。

在一些實(shí)施例中，脫髓鞘疾病選自腓骨肌萎縮癥(CMT)。CMT指的是遺傳神經(jīng)疾病，其特征在于慢性運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)病。不同類型的CMT疾病被識(shí)別為，例如：CMT1、CMT2、CMT4、CMTX和德熱里納-索塔斯病。根據(jù)分子遺傳學(xué)研究，CMT的子類型可進(jìn)一步細(xì)分。例如，CMT1細(xì)分為CMT1A、1B、1C、1D、1E、1F/2E和1X。在基因編碼的髓鞘蛋白零(P0)內(nèi)由超過100種突變，單一跨膜蛋白是由引起腓骨肌萎縮癥的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的髓鞘雪旺細(xì)胞產(chǎn)生的主要蛋白質(zhì)(D′Antonio等，2009年)。CHOP的基因消融，UPR內(nèi)的促凋亡基因能恢復(fù)腓骨肌萎縮癥小鼠的運(yùn)動(dòng)功能(Pennuto等，2008年，《神經(jīng)元》，57卷，393-405頁)。細(xì)胞內(nèi)的PPP1R15A抑制劑幾乎消除ER應(yīng)激下細(xì)胞的CHOP表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，表明PPP1R15A的基因或藥學(xué)抑制劑應(yīng)該減少腓骨肌萎縮癥小鼠的運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)功能障礙。最近，D’Antonio等(2013年，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》，1-18頁)證明eIF2α抑制劑治療的P0S63del小鼠，在轉(zhuǎn)棒分析實(shí)驗(yàn)中幾乎重新獲得了正常的運(yùn)動(dòng)能力，并且伴隨著形態(tài)和生理異常的恢復(fù)。對(duì)P0S63del來說，ER蛋白內(nèi)CMT相關(guān)的突變的累積不是唯一的，已經(jīng)識(shí)別出ER內(nèi)還存在至少五種其他P0突變體，并且引起UPR(Pennuto等，2008年；Saporta等，2012年，《大腦》，135卷，2032-2047頁)。此外，由于PMP22和Cx32內(nèi)的突變，ER內(nèi)的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積已經(jīng)被牽連到其他CMT神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制中(Colby等，2000年，《疾病神經(jīng)生物學(xué)》，7卷，561-573頁；Kleopa等，2002年，《神經(jīng)科學(xué)研究雜志》，68卷，522-534頁；Yum等，2002年，《疾病神經(jīng)生物學(xué)》，11卷，43-52頁)。但是，eIF2α抑制劑是有毒的，不能用于治療人類患者，D’Antonio等(2013年)。相反地，通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑被預(yù)測是安全的，能被用于治療CMTs，優(yōu)選CMT1，更優(yōu)選CMT-1A、CMT-1B、CMT-1E和CMT-1X。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療腓骨肌萎縮癥，優(yōu)選CMT-1，更優(yōu)選CMT-1A、CMT-1B、CMT-1E和CMT-1X。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療CMT，更優(yōu)選地治療CMT-1和德熱里納-索塔斯疾病。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽可以用于治療與ER內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)累積相關(guān)的CMT。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽可以用于治療CMT-1A。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽可以用于治療CMT-1B。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽可以用于治療CMT-1E。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療CMT-1X。

在另一個(gè)實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療CMT，更優(yōu)選地，用于治療CMT-1，與下列至少一種化合物結(jié)合：D-山梨醇、巴氯芬、匹魯卡品、環(huán)丙甲羥二羥嗎啡酮、甲巰基咪唑、米非司酮、酮苯丙酸及其藥學(xué)可接受的鹽。所述化合物結(jié)合或分開服用，同時(shí)或按次序服用。

本發(fā)明涉及用于治療神經(jīng)退行性疾病，優(yōu)選CMT，更優(yōu)選CMT-1的組合物，所述組合物包含PPP1R15A抑制劑，選自：通式(I)或(II)的化合物、胍那芐和eIF2α抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，還包含至少一種市售的化合物及其鹽。所述組合物中化合物的劑量不應(yīng)超過用于長期維持治療或在3期臨床試驗(yàn)中證明是安全的通常規(guī)定的劑量范圍；所述組合物中化合物最優(yōu)選的劑量應(yīng)是用于長期維持治療的通常規(guī)定的劑量的1％到10％。

因此，本發(fā)明涉及用于治療CMT，優(yōu)選CMT-1，更優(yōu)選CMT-1A，更優(yōu)選CMT-1B、CMT-1E和CMT-1X的組合物，所述組合物包含PPP1R15A抑制劑，選自：通式(I)或(II)的化合物、胍那芐和eIF2α抑制劑(salubrinal)或其藥學(xué)上可接受的鹽；還包含增加PMP22蛋白質(zhì)表達(dá)的化合物，選自D-山梨醇、巴氯芬、匹魯卡品、環(huán)丙甲羥二羥嗎啡酮、甲巰基咪唑、米非司酮、酮苯丙酸及其藥學(xué)可接受的鹽。

在其他實(shí)施例中，脫髓鞘疾病選自包含腦白質(zhì)營養(yǎng)不良在內(nèi)的許多疾病。腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的例子包括但不限于：腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD)、亞歷山大病、海綿狀腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥、克拉伯病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(MLD)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PMD)、兒童共濟(jì)失調(diào)伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘化低下(也稱為白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病)、CAMFAK綜合征、雷夫敘姆病、科克因綜合癥、科納普V綜合征(Ver der Knapp Syndrome)、趙葦格氏癥、格林-巴利綜合征(GBS)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病(MMN)和進(jìn)行性核上性神經(jīng)麻痹、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病(PML)、腦脊髓炎、腦橋中央髓鞘溶解癥(CPM)、抗-MAG疾病等。戈夫等(《神經(jīng)元》，2002年，36卷，585596頁)證明未折疊的蛋白質(zhì)響應(yīng)在PMD內(nèi)被激活，并且表明這個(gè)途徑是復(fù)制PLP1基因。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，優(yōu)選地，用于治療佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PMD)。

肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)稱為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病和路格里克氏病?，F(xiàn)在已經(jīng)充分意識(shí)到蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊在家族性和偶發(fā)性ALS上都起著核心作用(Matus等，2013年，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》，ID674751 http：//dx.doi.org/10.1155/2013/674751)。Saxena等(《自然神經(jīng)科學(xué)》，2009年，12卷，627-636頁)證明了eIF2α抑制劑能延長運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病轉(zhuǎn)基因小鼠模型G93A-SOD1的壽命。最近，Jiang等(《神經(jīng)元》，2014年)證明在ALS病例的SOD1 G93A小鼠模型中，胍那芐能延遲疾病癥狀的發(fā)作、延長壽命、改善運(yùn)動(dòng)能力并減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失。不受體輪的約束，可預(yù)測本發(fā)明的化合物，即胍那芐衍生物PPP1R15A抑制劑將改善具有G93A SOD1突變的ALS的疾病臨床表現(xiàn)。因此，通式(I)和(II)的化合物可用于治療家族性和偶發(fā)性ALS。

Seipin蛋白病變的例子包括但不限于賽二氏先天性脂質(zhì)營養(yǎng)不良2型(Berardinelli-Seipcongenital lipodystrophy，BSCL2)相關(guān)運(yùn)動(dòng)疾病、先天性全身脂肪營養(yǎng)不良(CGL)、Silver綜合征、遠(yuǎn)端型遺傳性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病V型(dHMN-V))。人工培養(yǎng)的細(xì)胞中seipin蛋白突變體的表達(dá)，能激活未折疊蛋白響應(yīng)(UPR)通路，并誘發(fā)ER應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(伊托和鈴木，2009年，《大腦》，132卷，87-15頁)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療seipin蛋白病變(seipinopathy)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，其中提及的脫髓鞘疾病是多發(fā)性硬化癥及相關(guān)疾病，例如，謝耳德氏病。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療多發(fā)性硬化癥。

囊胞性纖維癥(CF)

Norez等(2008年，《歐洲藥理學(xué)雜志》，592卷，33-40頁)證明胍那芐能激活囊性纖維化氣道上皮細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺依賴的氯電流。不受理論的約束，可以預(yù)料本發(fā)明的化合物，即胍那芐衍生物PPP1R15A抑制劑，會(huì)改善囊性纖維化疾病的表現(xiàn)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療囊胞性纖維癥。

視網(wǎng)膜病變

最近出版的文章提供了UPR參與視網(wǎng)膜變性的發(fā)展過程的證據(jù)：遺傳性視網(wǎng)膜色素變性，例如：視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙和視網(wǎng)膜色素變性、黃斑變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜脫離、糖尿病視網(wǎng)膜病變和青光眼(審查：Gorbatyuk和Gorbatyuk，2013年-視網(wǎng)膜變性：專注于未折疊的蛋白反應(yīng)，《分子視覺》，19卷，1985-1998頁)。新證據(jù)支持ER應(yīng)激在視網(wǎng)膜凋亡和細(xì)胞死亡中的作用(Jing等，《實(shí)驗(yàn)糖尿病研究》，2012年，2012卷，589589頁)。

視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙是源自光感受器中初級(jí)纖毛的缺陷的一組罕見的遺傳疾病，因此，包括色素性視網(wǎng)膜炎。有報(bào)道稱由于蛋白質(zhì)的累積，這種缺陷在光感受器的內(nèi)部誘導(dǎo)ER應(yīng)激，反過來誘導(dǎo)UPR(WO2013/124484)。在視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙中視網(wǎng)膜退化是最常見的特征，可以在任意一種獨(dú)立的視網(wǎng)膜色素變性疾病中被觀察到，例如：雷伯氏先天性黑內(nèi)障或X-連鎖視網(wǎng)膜色素變性，或者在綜合癥狀中被觀察到，如：巴德-畢德氏癥候群(BBS)、阿爾斯特倫綜合癥(ALMS)或亞瑟綜合征。視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙選自：巴德-畢德氏綜合征、Senior-Loken綜合征、朱伯特綜合癥、Salidono-Mainzer綜合癥、Sensenbrenner綜合癥、Jeune綜合癥、Meckel-Gruber綜合征、阿爾斯特倫綜合癥(ALMS)和MORM綜合征，由纖毛基因突變引起的雷伯氏(Leber’S)先天性黑內(nèi)障，由RPGR基因突變引起的X-連鎖視網(wǎng)膜色素變性。

視網(wǎng)膜色素變性是一種遺傳性的退行性眼病，其導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害并常常失明。這是遺傳決定的失明的最常見的原因?；颊邔⒔?jīng)歷下列一種或多種癥狀：夜盲、管狀視(無周邊視覺)、周邊視覺(無中央視覺)、網(wǎng)格視覺、厭惡眩光、從黑暗到光明(或反過來)環(huán)境的緩慢調(diào)節(jié)；視覺模糊；顏色分離能力弱；和極度疲勞。色素性視網(wǎng)膜炎(RP)是由視紫紅質(zhì)基因中超過100種突變引起的(Dryja等人，1991年，《美國國立科學(xué)院院刊》，88卷，9370-9374頁)。視紫紅質(zhì)是G蛋白偶聯(lián)受體，其在桿狀細(xì)胞光感受器中轉(zhuǎn)導(dǎo)光，并由348個(gè)氨基酸的跨膜蛋白視之間的共價(jià)配合物組成，共價(jià)連接到11-順式視黃醛(Palczewski，2006年，《生物化學(xué)年評(píng)》，75卷，743-767頁)。RP導(dǎo)致的視紫紅質(zhì)基因突變主要是錯(cuò)義突變，遍布于蛋白質(zhì)(Dryja等人，1991年)，與ALS導(dǎo)致的SOD1突變類似(Valentine等人，2005年，《生物化學(xué)年評(píng)》，74卷，563-593頁)。RP導(dǎo)致的視紫紅質(zhì)基因突變已經(jīng)在不同的系統(tǒng)中進(jìn)行了研究，并且是由哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)的異源表達(dá)引起的，在轉(zhuǎn)基因小鼠和果蠅中是一致的(格里茨悠等人，2011年，《分子醫(yī)學(xué)動(dòng)態(tài)》，17卷，442-451頁)。最普遍的RP導(dǎo)致的視紫紅質(zhì)基因突變不能折疊，不結(jié)合11-順-視黃醛，不能到達(dá)細(xì)胞表面，而是保留在ER中(Griciuc等人，2011年，《分子醫(yī)學(xué)動(dòng)態(tài)》17卷，442-451頁)。視紫紅質(zhì)突變體的錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致ER應(yīng)激和桿狀細(xì)胞的死亡(Griciuc等人，2011年)。這強(qiáng)烈地表明PPP1R15A抑制劑，如胍那芐，有利地對(duì)腎上腺素α2A受體沒有活性，如本發(fā)明的化合物，將改善RP。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療視網(wǎng)膜疾病，更優(yōu)選地，用于治療視網(wǎng)膜變性，例如視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、視網(wǎng)膜病變、光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜脫離、糖尿病視網(wǎng)膜病變和青光眼。

根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用于治療視網(wǎng)膜色素變性綜合征/或非綜合征性視網(wǎng)膜色素變性。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用于治療雷伯氏先天性黑內(nèi)障。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用于治療巴爾得-別德爾(Bardet-Biedl)綜合征。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用于治療阿爾斯特倫綜合癥。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用于治療亞瑟綜合征。

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是美國65歲以上的人群中法定盲的主要原因。Shen等人(2011年，胍那芐對(duì)AMD大鼠模型和兔脈絡(luò)膜血的影響-5卷，27-31頁)表明胍那芐顯著地保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)免受NaIO3誘導(dǎo)的變性，在激光誘導(dǎo)的大鼠AMD模型中抑制脈絡(luò)膜新生血管(CNV)的發(fā)展，并且在體內(nèi)明顯增加脈絡(luò)膜血流量。本發(fā)明的胍那芐衍生物像胍那芐一樣是PPP1R15A抑制劑，但是其有利地對(duì)腎上腺素α2A受體沒有活性，可用于治療視網(wǎng)膜或黃斑變性。

在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療色素性視網(wǎng)膜炎。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療雷伯氏(Leber’s)先天性黑內(nèi)障。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療巴爾得-別德爾(Bardet-Bied1)綜合征。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療阿爾斯特倫綜合征。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療亞瑟(Husher)綜合征。

在優(yōu)選實(shí)施例中，通式(I)的化合物與增加BIP蛋白表達(dá)和/或活性的化合物例如：丙戊酸或其衍生物、曲古抑菌素A、鋰、1-(3，4-二羥基-苯基)-2-硫氰酸根-乙酮和塞那肽-4，聯(lián)合使用，用于治療視網(wǎng)膜病變，更優(yōu)選地，用于治療遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病，例如：視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜脫離、糖尿病視網(wǎng)膜病變和青光眼。因此，本發(fā)明涉及一種組合物，所述組合物包含通式(I)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽，和增加BIP蛋白表達(dá)和/或活性的化合物，優(yōu)選丙戊酸，用于治療多種遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病，例如：視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜脫離、糖尿病視網(wǎng)膜病變和青光眼。

在優(yōu)選地實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物與基因治療載體聯(lián)合使用，用于治療多種遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病，例如：視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜脫離、糖尿病視網(wǎng)膜病變和青光眼?；蛑委熭d體的非限制性例子包括：慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)載體(AAVs)；對(duì)眼部基因治療來說，這些載體在提供對(duì)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞感興趣的基因方面是有效的。可以預(yù)測，在突變的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的遺傳性視網(wǎng)膜色素變性的眼部基因治療中，在基因治療載體表達(dá)正常蛋白質(zhì)的同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中仍會(huì)存在蛋白質(zhì)的累積。仍然需要使用PPP1R15A抑制劑減少細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)累積/載荷，優(yōu)選地減少ER內(nèi)的蛋白質(zhì)累積/載荷。本發(fā)明還涉及包含PPP1R15A抑制劑與眼部基因治療結(jié)合的組合物，所述PPP1R15A抑制劑選自通式(I)或(II)的化合物、胍那芐和eIF2α抑制劑，或其其藥學(xué)可接受的鹽。

溶酶體貯積癥；

溶酶體貯積癥是由于溶酶體功能的缺陷引起的約50種罕見的遺傳性代謝疾病。溶酶體功能障礙通常是缺乏脂肪、糖蛋白或所謂的黏多糖代謝所需的單一酶的結(jié)果?？梢员煌ㄊ?I)或(II)描述的PPP1R15A抑制劑治療的溶酶體貯積癥在此包括但不限于：活化劑缺失/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、α-甘露糖苷病、天冬氨酰葡萄糖胺尿癥、膽固醇酯沉積病、胱氨酸病、溶酶體儲(chǔ)積癥(Danondisease)、法布里病、法勃氏病、尼曼-匹克病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、戈謝病(I、II、III型)、GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病(嬰兒、嬰兒晚期/青少年、成人/慢性)、I-細(xì)胞胞疾病、嬰幼兒唾液酸貯積病(Infantile free sialic acid storage disease)/ISSD、少年己糖苷酶缺乏癥、克拉伯病(小兒發(fā)病，晚期發(fā)作)、溶酶體酸性脂酶缺乏癥(早期發(fā)作/晚期發(fā)作)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、黏多醣癥(例如：粘脂質(zhì)累積病III型/粘脂質(zhì)累積病IIIA型、粘脂質(zhì)累積病I型(MPS I)賀勒氏癥、MPS I施艾氏癥、MPS I賀勒-施艾氏綜合癥、MPS II亨特氏綜合癥、沙費(fèi)利波綜合征A型(MPS IIIA)、沙費(fèi)利波綜合征B型(MPS IIIB)、沙費(fèi)利波綜合征C型(MPS IIIC)、沙費(fèi)利波綜合征D型(MPS IIID)、莫爾奎A型/MPS IVA、莫爾奎B型/MPS IVB、MPS IX透明質(zhì)酸酶缺乏癥、MPS VI拉米氏癥、MPS VII斯賴綜合征、粘多糖病I(mucopolylipidosis I)/涎酸酵素缺乏癥、粘脂沉積癥IIIC、粘脂沉積癥IV(多發(fā)性硫酸脂酶缺乏癥、尼曼-皮克病(A、B、C型)、CLN6疾病(非典型小兒晚期、晚發(fā)性變異和青少年早期)、巴斯特魯普氏綜合征/青少年NCL/CLN3疾病、嬰兒晚期芬蘭變異CLN5(FinnishVariant late infantile CLN5)、Jansky-Bielschosky疾病/、嬰兒晚期CLN2/TPP1疾病、庫夫斯病/成人型NCL/CLN4疾病、北方癲癇型/嬰兒晚期CLN8變異、嬰兒型/嬰兒CLN1/PPT疾病、β-甘露糖苷病、龐貝氏癥/糖原貯積病II型、致密成骨不全癥、山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥(成人期發(fā)病、嬰兒期發(fā)病，青少年期發(fā)病)、Schindler疾病、Sall疾病、唾液酸貯積癥、黑蒙性癡呆/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病以及沃爾曼(Wolman)病。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療溶酶體貯積癥，溶酶體貯積癥是由于缺乏用于代謝脂肪、糖蛋白或所謂的黏多糖所需的至少一種單一酶的結(jié)果，其中，所述酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是錯(cuò)誤折疊的。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，溶酶體貯積癥是戈謝病。

淀粉樣變?。?/p>

淀粉樣變病是非特定術(shù)語，許多不同的疾病統(tǒng)稱為淀粉樣變性。淀粉樣蛋白是二級(jí)結(jié)構(gòu)改變的蛋白，引起蛋白質(zhì)以特定形式折疊，即β-折疊結(jié)構(gòu)。當(dāng)正常溶解的蛋白質(zhì)折疊形成淀粉樣蛋白時(shí)，變得不可溶，在器官或組織中沉積和累積，破壞器官或組織的正常功能。根據(jù)淀粉樣蛋白在哪個(gè)器官和器官的那個(gè)部分累積，不同類型的淀粉樣變性具有不同的信號(hào)和癥狀。淀粉樣變病的例子包括但不限于：AL、AH和ALH淀粉樣變病(淀粉樣蛋白分別來源于輕型、重型和重鏈和輕鏈抗體)、AA淀粉樣變病(淀粉樣蛋白來源于血清A蛋白)，ATTR淀粉樣變病(淀粉樣蛋白來源于甲狀腺素運(yùn)載蛋白transthyrethin)、原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性、繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變、老年全身性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病1、遺傳性腦淀粉樣血管病、透析相關(guān)性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病III型、芬蘭遺傳系統(tǒng)性淀粉樣變(Finnish hereditary systemic amyloidosis)、心房淀粉樣變(atrial amyloidosis)、遺傳性非神經(jīng)病系統(tǒng)性淀粉樣變、注射-局限性淀粉樣變(injection-localized amyloidosis)，和遺傳性腎淀粉樣變和阿爾茨海默病等。

根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，淀粉樣蛋白是β淀粉樣蛋白(Aβ或Abeta)，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽，用于治療阿爾茨海默病。

根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施例，所述淀粉樣蛋白是HLA-B27(科爾伯特等，2009年，《朊病毒》，3(1)卷，15-16頁)，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽，用于治療脊柱-關(guān)節(jié)病，更優(yōu)選地，強(qiáng)直性脊椎炎。

癌癥

癌細(xì)胞具有高代謝需求，它們的增殖依賴于有效的蛋白質(zhì)合成。翻譯起始在控制蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)、分化、增殖和惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用。增加翻譯起始有助于癌癥發(fā)生，相反地，減少翻譯起始可以降低腫瘤的生長(Donze等人，1995年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，14卷，3828-3834頁；Pervin等人，2008年，《腫瘤研究》，68卷，4862-4874頁；Chen等人，2011年，《自然化學(xué)生物》，7卷，610-616頁)。不希望受理論束縛，我們相信抑制PPP1R15A可以選擇性地減少腫瘤細(xì)胞中的翻譯，從而減少腫瘤生長。可以用本文公開的通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑治療的癌癥類型的例子包括但不限于惡性上皮腫瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這些癌癥的更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸道癌、胰腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌(breast cancer)、乳腺癌(mammary cancer)、結(jié)腸癌(colon cancer)、直腸癌(colorectal cancer)、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer)、腎癌(renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、骨肉瘤、胃癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺髓樣癌和頭頸癌。

炎癥

PPP1R15A代表一種控制炎癥的有前景的靶點(diǎn)，其通過限制導(dǎo)致致病條件的炎癥性因子和其他分泌分子介質(zhì)的釋放來控制炎癥。在此描述的能通過通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑治療的，與炎癥相關(guān)的疾病或癥狀的非限制性例子包括但不限于：肺部感染相關(guān)或非感染性炎癥性疾病(例如：敗血癥、肺部感染、呼吸窘迫綜合征、支氣管肺發(fā)育不良等)；其他器官的感染相關(guān)或非感染性炎癥性疾病，例如：結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎癥性腸病、糖尿病性腎病、出血性休克、脊柱-關(guān)節(jié)病、胰腺炎、炎癥誘導(dǎo)的癌癥(例如，結(jié)腸炎或炎癥性腸病患者的癌癥發(fā)展)等等。

這些致病性炎癥的例子包括：自身免疫性疾病、遺傳性疾病、慢性疾病和傳染性疾病，例如過敏癥、哮喘、細(xì)胞介質(zhì)癥，包括移植物抗宿主疾病(GVHD)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、敗血癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)(參見WO2011/061340)。優(yōu)選地，感染性疾病選自流感病毒感染、天花病毒感染、皰疹病毒感染、嚴(yán)重急性呼吸道癥候群(SARS)、基孔肯雅病毒感染、西尼羅河病毒感染、登革熱病毒感染、日本腦炎病毒感染，黃熱病病毒感染，和丙型肝炎病毒感染。

優(yōu)選地，自身免疫性疾病選自：干燥綜合癥、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、皰疹樣皮炎、白癜風(fēng)、蕈樣真菌病、過敏性接觸皮炎、特異性皮炎、扁平苔癬、急性苔癬痘疹樣糠疹(PLEVA)、關(guān)節(jié)炎和抗磷脂綜合征。

根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽，用于治療下列疾?。航Y(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎癥性腸病、胰腺炎和敗血癥。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療胰腺炎。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療敗血癥。

根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)可接受的鹽用于治療選脊柱-關(guān)節(jié)病，更優(yōu)選地，強(qiáng)直性脊椎炎。

代謝/心血管疾病，例如，肥胖癥(adiposity)、高血脂、家族性高膽固醇血癥、肥胖癥(obesity)、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心臟病、心肌缺血性疾病、中風(fēng)、心肌梗塞、經(jīng)主動(dòng)脈縮窄(trans-aortic constriction)和糖尿病劑相關(guān)疾病包括高血糖、葡萄糖耐量降低、高胰島素血癥(前驅(qū)糖尿病)、胰島素過敏癥I和II型糖尿病、胰島素抵抗力和沃爾科特-拉里森綜合征等。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療前驅(qū)糖尿病或糖尿病，更優(yōu)選2型前驅(qū)糖尿病或2型糖尿病。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療以下疾病，選自：高血糖癥、葡萄糖耐量降低、高胰島素血癥(前驅(qū)糖尿病)、胰島素過敏癥I和II型糖尿病、胰島素抵抗力和沃爾科特-拉里森綜合征等。實(shí)際上，胰腺中分泌胰島素的β細(xì)胞具有重要的和嚴(yán)格調(diào)節(jié)的生物合成負(fù)荷，包括胰島素分泌。因此，這些細(xì)胞非常需要維持ER內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(Back和Kaufman，2012年，《生物化學(xué)年評(píng)》，81卷，767-793頁)。由于脂肪、肌肉和肝臟中的胰島素抵抗和/或胰腺β-細(xì)胞的胰島素分泌受損，2型糖尿病表現(xiàn)為血糖水平升高。結(jié)果，β細(xì)胞群增加并且它們的功能也增強(qiáng)。最終，β細(xì)胞的負(fù)擔(dān)過高，導(dǎo)致其功能逐漸下降，并導(dǎo)致死亡。越來越多的證據(jù)表明，β-細(xì)胞的死亡是由ER應(yīng)激引起的(Back和Kaufman，2012年，《生物化學(xué)年評(píng)》，81卷，767-793頁)。重要的是，Chop缺失改善了多種糖尿病模型中的β細(xì)胞的功能(Song等人，2008年，《臨床研究雜志》，118卷，3378-3389頁)。不希望受理論束縛，我們相信PPP1R15A-PP1的抑制劑將改善2型糖尿病中的β細(xì)胞的功能，這是因?yàn)樵贓R應(yīng)激期間，PPP1R15A-PP1的抑制會(huì)降低促凋亡蛋白CHOP的水平(Tsaytler等人，2011年，《科學(xué)》。

在另一個(gè)實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療下列疾病：高血壓、心臟病、心肌缺血性疾病、中風(fēng)、心肌梗塞、經(jīng)主動(dòng)脈縮窄(trans-aortic constriction)或血管性中風(fēng)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療心肌缺血。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于治療動(dòng)脈粥樣硬化癥。

骨質(zhì)疏松癥

Yokota等(《BMC肌肉骨骼失調(diào)(BMC Musculoskeletal disorders)》，2013年，14卷，197頁)以及He等(Cellular Signaling，2013年，25卷，552-560頁)證明eIF2α抑制劑(Boyce等，2005年)在小鼠模型中，有效地阻止骨質(zhì)疏松癥并刺激骨形成。但是，eIF2α抑制劑是有毒的，不能用于治療人類患者。相反地，通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑被預(yù)測是安全的，能用于治療骨質(zhì)疏松癥。通式(I)或(II)的化合物用于治療骨質(zhì)疏松癥。

中央神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷

Ohri等(《疾病神經(jīng)生物學(xué)》，2013年，58卷，29-37頁)證明eIF2α抑制劑顯著提高后肢運(yùn)動(dòng)，伴隨著白質(zhì)的改善和少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的減少，從而改善脊髓損傷后的功能恢復(fù)。因此，本發(fā)明通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑被預(yù)測是安全的，在創(chuàng)傷性脊髓損傷后，對(duì)減少少突膠質(zhì)細(xì)胞的損失是有用的，可以用于脊髓損傷的預(yù)防和/或治療。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于脊髓損傷的預(yù)防和/或治療。

局部缺血、腦缺血、睡眠呼吸暫停

本發(fā)明提供使用本發(fā)明通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑來預(yù)防和/或治療由于壞死或凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞損傷或死亡引起的組織損傷。神經(jīng)組織損傷的例子包括局部缺血和再灌注損傷，例如：腦缺血性中風(fēng)和頭部創(chuàng)傷。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通式(I)或(II)的化合物用于預(yù)防和/或治療腦缺血，例如腦缺血性中風(fēng)和頭部創(chuàng)傷。

衰老

衰老與細(xì)胞、組織和器官的退化有關(guān)，導(dǎo)致疾病，例如癌癥、心血管衰竭、肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和神經(jīng)退行性疾病，以及大多數(shù)測試的生理性能的下降。

在生物學(xué)中，衰老是老化的狀態(tài)或過程。細(xì)胞衰老是獨(dú)立的細(xì)胞在培養(yǎng)基中表現(xiàn)出有限的列分能力(即倫納德·海福里克于1961年發(fā)現(xiàn)的海弗利克極限)，然而生物體衰老是生物體的老化。生物體衰老的特征在于對(duì)應(yīng)激的響應(yīng)能力下降，穩(wěn)態(tài)失衡的增加和疾病風(fēng)險(xiǎn)的增加；具體來說，UPR隨年齡減少(奈杜等，2008年，《神經(jīng)科學(xué)》，28卷，6539-48頁)。因此，通過eIF2α磷酸酶的抑制劑延長UPR的有利響應(yīng)會(huì)改善與年齡相關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑被預(yù)測是安全的，可以用于預(yù)防和/或治療與細(xì)胞的壽命或增值能力有關(guān)的疾病或技能失調(diào)，以及預(yù)防和/或治療動(dòng)物尤其是人類的由細(xì)胞衰老引起或加重的疾病或疾病情況。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明還涉及通式(I)或(II)的化合物，其用于治療和/或預(yù)防選自下列的疾病，Tau蛋白病變，選自：阿爾茨海默氏病、進(jìn)行性核上性麻痹、皮質(zhì)基底核退化癥、額顳葉退化癥或額顳癡呆(FTD)(皮克氏病)；共核蛋白病，選自：帕金森氏病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)衰弱、多系統(tǒng)萎縮；多聚谷氨酰胺和多聚丙氨酸疾病，選自：亨廷頓氏病、脊延髓肌肉萎縮(或肯尼迪病)、丘腦底核萎縮、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)1型、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)2型、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(或馬查多-約瑟夫病)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)6型、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)7型和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)17型、眼咽型肌肉萎縮；脫髓鞘疾病例如：腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、腓骨肌萎縮癥和多發(fā)性硬化癥、囊胞性纖維癥、seipin蛋白病變、溶酶體儲(chǔ)存障礙、淀粉樣變病、炎癥、代謝紊亂癥和心血管疾病，選自：肥胖癥(adiposity)、高脂血癥、家族性高膽固醇血癥、肥胖(obesity)、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心臟病、心肌缺血性疾病、中風(fēng)、心肌梗塞、經(jīng)主動(dòng)脈縮窄(trans-aortic constriction)、血管性中風(fēng)；骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)、神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、局部缺血、骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)、視網(wǎng)膜疾病，如色素性視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、青光眼、黃斑變性和衰老。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述疾病更具體地選自多發(fā)性硬化；腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，優(yōu)選地，佩利措伊斯-梅茨巴赫??；脫髓鞘疾病，例如腓骨肌萎縮癥，優(yōu)選CMT-1A；心血管疾病，例如：高血壓、心臟病、心肌缺血性疾病、中風(fēng)、心肌梗塞、經(jīng)主動(dòng)脈縮窄(trans-aortic constriction)；結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎癥性腸病、胰腺炎、敗血癥；淀粉樣變病，例如：阿爾茨海默氏病和強(qiáng)直性脊椎炎；前驅(qū)糖尿病和糖尿病，例如2型糖尿病。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明還涉及通式(I)或(II)的化合物與增加BIP蛋白的表達(dá)和/或活性的化合物聯(lián)合使用，用于治療下列視網(wǎng)膜疾?。哼z傳性視網(wǎng)膜變性，例如：視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、視網(wǎng)膜纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜脫離、糖尿病視網(wǎng)膜病變和青光眼。

藥物組合物

根據(jù)本發(fā)明的用途，在此描述的化合物或其生理上可接受的鹽、酯類或其他生理上可接受的功能性衍生物，可以作為藥物配方使用，所述藥物配方包括所述化合物或其生理上可接受的鹽、酯類或其他生理上可接受的功能性衍生物，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，還可選地包含其他治療和/或預(yù)防性成分。所述載體必須與配方的其他成分兼容并且對(duì)其接受者是無害的。在人類醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)中，所述藥物組合物能用于人類和動(dòng)物。

在此描述的用于不同形式的藥物組合物的合適的賦形劑的例子可以參見Wade和PJ Weller編輯的“藥用輔料手冊(cè)”，第二版，(1994)。

用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑在醫(yī)藥領(lǐng)域是眾所周知的，例如，參見麥克出版有限公司出版的《雷氏藥學(xué)大全》中的描述(A.R.Gennaro編輯，1985)。

合適的載體的例子包括：乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露醇、山梨醇等。合適的稀釋劑的例子包括：乙醇、甘油和水。

根據(jù)預(yù)定服用方式和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐可以選擇藥物載體、賦形劑或稀釋劑。除了載體、賦形劑或稀釋劑之外，藥物組合物還可包括合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、涂布劑、溶解劑、緩沖劑、調(diào)味劑、表面活性劑、增稠劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等，以及能夠使藥物配方與接受者的血液等壓的成分。

合適的粘合劑的例子包括：淀粉、明膠和天然糖，例如：葡萄糖、無水乳糖、自由流動(dòng)的乳糖、β-乳糖、玉米甜味劑以及天然或合成膠，例如：阿拉伯樹膠、黃芪膠或藻酸鈉、羰甲基纖維素和聚乙二醇。

合適的潤滑劑的例子包括：油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等。

藥物組合物中還可以包含防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和調(diào)味劑。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化劑和懸浮劑。

藥物配方劑型包括適合用于口服、局部(包括皮膚、口腔、眼睛和舌下腺)、直腸或腸胃外(包括皮下的、皮內(nèi)的、肌肉的和靜脈內(nèi)的)、鼻子、眼內(nèi)和肺部給藥，例如，通過吸入藥劑。如果合適的話，藥物配方可以離散劑量單元的形式存在，通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何一種方法制備。所有的方法都包括將活性化合物與液體載體或分離好的固體載體以及液固兩種載體結(jié)合的步驟，如果需要的話，成型并生成成理想的藥物制劑形式。

載體是固體的適合口服的藥劑配方，最優(yōu)選的存在形式是單位劑量配方，例如：丸劑、膠囊劑或片劑，每種形式包含預(yù)定量的活性化合物。片劑可通過壓縮或成型制成，可任選使用一種或多種助劑。壓制片劑可通過在壓縮機(jī)器中壓縮自由流動(dòng)形式例如粉末或顆粒狀的活性化合物來制備，任選地，所述活性化合物與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、脫模劑、表面活性劑或分散劑混合。模制片劑可使用惰性液體稀釋劑通過對(duì)活性化合物成型來制備。片劑可選地是包覆的和不包覆的，如果是不包覆的，可選地，是刻痕的。膠囊是通過將活性化合物單獨(dú)或與一種或多種助劑混合，填充到膠囊殼，然后以常規(guī)方式密封而制備。扁囊劑與膠囊類似，其中，活性化合物與任何一種助劑一起密封進(jìn)米紙藥袋中?；钚曰衔镆部梢耘渲瞥煞稚㈩w粒，例如，服用前可以懸浮在水中，或?yàn)⒃谑澄锷?。顆粒制劑例如可以包裝在小袋里。

適合口服的制劑中載體是液體的，可以溶液，或水溶液或非水溶液中的懸浮液，或水包油乳液形式存在。

適合口服的制劑中包括控釋劑型，例如，對(duì)于片劑，其中活性化合物配制在合適的釋放-控制基質(zhì)中，或用合適的釋放-控制膜包覆。這種制劑可能特別方便預(yù)防性使用。

載體是固體的適合直腸給藥的藥劑配方，最優(yōu)選的存在形式是單位劑量栓劑。合適的載體包括可可脂和其他本領(lǐng)域重用的其他材料。所述栓劑可方便地通過將活性化合物和軟化或熔化載體混合，隨后在磨具中冷卻、成型形成。

適合腸胃外給藥的藥劑配方包括無菌溶液或在水或含油的介質(zhì)中的活性化合物的懸浮液。

本發(fā)明的藥劑配方適合用于眼部給藥，尤其適合用于眼內(nèi)、眼局部或眼周給藥，更優(yōu)選地，適合用于眼局部或眼周給藥。

注射制劑可適用于彈丸注射或持續(xù)輸注。這樣的制劑方便地以單位劑量和多劑量的容器中存在，引入藥劑配方后密封，直到需要時(shí)使用?？蛇x地，活性化合物可以粉末形式存在，在使用之前與合適的介質(zhì)，例如無菌的無熱源的水一起構(gòu)成藥劑配方。

活性化合物也可配制為藥性持久作用的制劑，通過肌肉注射或皮下注射，例如，皮下或肌肉注射給藥。藥性持久的制劑可包括，例如，合適的聚合物或疏水材料，或離子交換樹脂。這些藥性持久的作用的制劑特別方便預(yù)防性使用。

適合通過口腔前庭肺部給藥的藥劑配方是這樣形式的微粒，其包含活性化合物，并且根據(jù)需求具有0.5-7微米的直徑，在接受者的支氣管樹中釋放。作為一種可能性，這種制劑是細(xì)粉末的形式，可以很方便地裝于可刺破的膠囊中，例如適合用于吸入裝置的明膠，或者制成自推進(jìn)配方，其包括活性化合物、合適的液體或氣體推進(jìn)劑，以及可選地其他成分，例如表面活性劑話/或固體稀釋劑。合適的液體推進(jìn)劑包括丙烷和含氯氟烴，合適的氣體推進(jìn)劑包括二氧化碳。也可以采用自推進(jìn)制劑，其中活性化合物以溶液或懸浮液的液滴的形式分配。

這種自推進(jìn)制劑類似于本領(lǐng)域已知的制劑，可通過已知的步驟制備。適當(dāng)?shù)?，可以將它們裝于容器中，該容器具有手動(dòng)操作或自動(dòng)運(yùn)行的閥，具有所需的噴霧特性；有利地，所述閥是儀表類型的，每次操作傳送固定的體積，例如25-100微升。

作為另一種可能，活性化合物可以是溶液或懸浮液的形式，用于霧化器或氣霧器，從而采用加速氣流或超聲攪拌產(chǎn)生跟細(xì)小的滴霧便于被吸入。

適合鼻腔黏膜給藥的制劑包括通常類似于上文描述的肺部給藥的制劑。在配藥時(shí)，這種制劑應(yīng)當(dāng)根據(jù)要求具有10-200微米范圍的粒徑，從而使其保留在鼻腔中；視實(shí)際情況，這可以通過使用具有合適顆粒尺寸的粉末或選擇合適的閥來實(shí)現(xiàn)。其他合適的制劑包括粒徑范圍在20-500微米的粗粉，當(dāng)容器舉近到鼻子時(shí)，通過鼻腔通道從容器中快速吸入粉末來給藥，其他合適的制劑還包括滴鼻液，其包含0.2to 5％w/v的活性化合物，分散于在水或油溶液或懸浮液。

藥學(xué)上可接受的載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，包括但不限于0.1M，優(yōu)選0.05M的磷酸鹽緩沖劑，或0.8％的鹽水。此外，這些藥學(xué)上可接受的載體可以是水溶液或非水溶液、懸浮液和乳液。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇和植物油，例如：橄欖油和注射有機(jī)酯，例如油酸乙酯。水溶性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。注射用藥物的介質(zhì)包括氯化鈉溶液、格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或固定油。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如，抗菌劑、抗氧劑、螯合劑、惰性氣體等。

可以提供適合局部給藥的制劑，例如凝膠、乳霜或油膏。這些制劑例如可用于創(chuàng)傷或潰瘍，直接涂在創(chuàng)傷或潰瘍表面，或者在支持介質(zhì)上進(jìn)行，例如繃帶、紗布、網(wǎng)狀織物或別的用于覆蓋被治療的地方的載體。

也可以提供液體或粉末制劑，直接噴涂或?yàn)⒃诖委煹奈恢?，例如?chuàng)傷或潰瘍?？蛇x地，可以用藥物制劑噴灑或噴撒載體，例如繃帶、紗布、網(wǎng)狀織物等，再將其覆蓋到待治療的地方。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種上文描述的藥物組合物或獸藥組合物的制備方法，所述方法包括將活性化合物與載體結(jié)合，例如，通過混合的方式。

通常，通過將活性成分與液體載體或分離好的固體載體以及液固兩種載體進(jìn)行均勻、密切地混合，來制備制劑，必要的話再成型成產(chǎn)品。本發(fā)明延伸到制備藥物組合物的方法，包括使通式(I)的化合物與醫(yī)學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)混合或結(jié)合。

鹽類

本發(fā)明的化合物可以鹽的形式存在，尤其是以藥學(xué)上和獸醫(yī)學(xué)上可接受的鹽的形式存在。

本發(fā)明化合物的藥學(xué)上和獸醫(yī)學(xué)上可接受的鹽包括合適的酸添加劑或堿鹽。合適的藥學(xué)上可接受的鹽的綜述可參見：Berge等，美國藥學(xué)雜志，66卷，1-19頁(1977)。鹽例如為與強(qiáng)無機(jī)酸如礦物酸形成的，例如，與氫鹵酸形成的鹽：鹽酸鹽、氫溴酸鹽和氫碘酸鹽，與硫酸、磷酸形成的鹽：硫酸鹽、酸式硫酸鹽、半硫酸鹽、硫氰酸鹽、過硫酸鹽，和與磺酸形成的鹽；所述鹽還可以是與強(qiáng)有機(jī)羧酸形成的鹽，這樣的酸例如1-4個(gè)碳原子的取代或未取代(例如，通過鹵素)的烷基羧酸，例如乙酸；與飽和或不飽和的二元羧酸形成的鹽，這樣的酸例如：草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、反丁烯二酸、鄰苯二甲酸或間苯二甲酸；與羥基羧酸形成的鹽，這樣的酸例如：抗壞血酸、乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；與胺基酸形成的鹽，這樣的酸例如：天冬氨酸或谷氨酸；與苯甲酸形成的鹽；或與有機(jī)磺酸形成的鹽，這樣的酸例如取代或未可取代(例如，通過鹵素)的(C₁-C₄)-烷基-或芳基-磺酸，例如甲烷-或?qū)妆?磺酸。藥學(xué)上和獸醫(yī)學(xué)上不可接受的鹽作為中間體仍是有價(jià)值的。

優(yōu)選的鹽例如包括：乙酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、泛酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、丁酸鹽鹽、雙葡萄糖酸鹽、環(huán)戊酸鹽、葡庚糖酸鹽、磷酸甘油鹽、草酸酯鹽、庚酸酯鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、煙酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、三甲基乙酸鹽、丙酸酯、酒石酸鹽、乳糖酸鹽、特戊酸鹽(pivolate)、樟腦酸鹽、十一酸和琥珀酸、有機(jī)磺酸，例如：甲磺酸酯、乙磺酸酯、2-羥基乙磺酸鹽、樟腦磺酸鹽、2-萘基磺酸鹽、苯基磺酸鹽、對(duì)氯苯基磺酸鹽和對(duì)甲苯基磺酸鹽；和無機(jī)酸，例如：鹽酸鹽、氫溴酸鹽，氫碘酸、硫酸鹽、酸式硫酸鹽、半硫酸鹽、硫氰酸鹽、過硫酸鹽、磷酸和磺酸。根據(jù)優(yōu)選地實(shí)施例，所述鹽是醋酸鹽。

對(duì)映異構(gòu)體/互變異構(gòu)體

上文討論的本發(fā)明的各個(gè)方面中，在合適的情況下，本發(fā)明包括本發(fā)明的化合物的所有對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體和互變異構(gòu)體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將識(shí)別具有光學(xué)特性(一個(gè)或多個(gè)手性碳原子)和/或互變異構(gòu)的特性的化合物。相應(yīng)的對(duì)映異構(gòu)體和/或互變異構(gòu)體可通過本領(lǐng)域已知的方法分離/制備。對(duì)映異構(gòu)體的特征在于其手性中心的絕對(duì)構(gòu)型，并通過Cahn，Ingold和Prelog的R和S次序規(guī)則來描述。這些規(guī)定在本領(lǐng)域是眾所周知的(例如，參見‘高等有機(jī)化學(xué)’，第三版，March，J，約翰·威利父子出版公司，紐約，1985年)。

因此，通式(I)或(II)的化合物也包括下面通式的互變異構(gòu)體：

作為說明性的示例，化合物2的互變異構(gòu)體是：

本發(fā)明的含有手性中心的化合物可用作外消旋的混合物，即富集對(duì)映體的混合物，或者，采用已知的技術(shù)分離外消旋混合物，從而單獨(dú)使用每種對(duì)映體。

立體立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體

本發(fā)明的一些化合物可能存在立體異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體，例如，其具有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱和/或幾何中心，所以可能以兩個(gè)或多個(gè)立體異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體，例如E/Z(Entgegen/Zusammen)同分異構(gòu)體的形式存在。本發(fā)明考慮了這些抑制劑的所有單獨(dú)的異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體，及其混合物的用途。權(quán)利要求中的術(shù)語包括這些異構(gòu)體形式，前提是所述異構(gòu)體形式保持合適的功能活性(盡管不一定相同的程度)。

因此，通式(I)或(II)的化合物還包括其E和/或Z型異構(gòu)體形式：

本發(fā)明還包括藥劑的所有合適的同位素變體或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明藥劑的的同位素變體或其藥學(xué)上可接受的鹽，定義為這樣的物質(zhì)：該物質(zhì)中的一個(gè)原子被具有相同原子序數(shù)但不同原子質(zhì)量的原子取代，該原子質(zhì)量與自然界通常發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量不同。能被包含在本發(fā)明的藥劑或其藥學(xué)上可接受的鹽中的同位素的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如，分別是：²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²p、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。本發(fā)明的藥劑或其藥學(xué)上可接受的鹽的一些同位素，例如，那些放射性同位素，例如：³H和¹⁴C被包含在所述藥劑或其藥學(xué)上可接受的鹽中，在藥物和/或基質(zhì)組織分布研究中是有用的。特別優(yōu)選的同位素是氚，即³H，和碳-14，即¹⁴C，因?yàn)槠湟子谥苽?，并且可被檢測。此外，同位素替代物例如氘，即²H，可能提供一定的治療優(yōu)勢，因?yàn)槠渚哂懈鼜?qiáng)的代謝穩(wěn)定性，例如，體內(nèi)半衰期增大或劑量要求減少，因此在某些情況下可能是更優(yōu)選的。例如，本發(fā)明包括通式(I)的化合物中任何一個(gè)氫原子已被氘原子取代的化合物。本發(fā)明的藥劑及其藥學(xué)上可接受的鹽的同位素改變，通?？梢酝ㄟ^使用合適的試劑的適當(dāng)?shù)耐凰馗淖兊某Ｒ?guī)的步驟制備。

藥物前體

本發(fā)明還包括以藥物前體形式存在的本發(fā)明的化合物，例如，根據(jù)通式(I)在體內(nèi)釋放母體藥物的共價(jià)鍵化合物。這些藥物前體通常是本發(fā)明的化合物中一個(gè)或多個(gè)合適的基團(tuán)被修飾，且被人或哺乳動(dòng)物對(duì)象服用后這種修飾可能逆轉(zhuǎn)。所述逆轉(zhuǎn)通過自然存在于這些對(duì)象的酶來完成，盡管為了在體內(nèi)完成這種逆轉(zhuǎn)，也可能有另一種藥劑與這種藥物前體一起被服用。這些修飾體的例子包括酯類(例如，上文描述的任何一種酯類)，其中，所述逆轉(zhuǎn)可能是酯酶等完成的。其他類似的系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

溶劑化物

本發(fā)明還包括本發(fā)明的化合物的溶劑化物形式。權(quán)利要求中的術(shù)語包括這些溶劑化物形式。

多晶型物

本發(fā)明還涉及以其不同結(jié)晶形式、多晶形式和含水形式存在的本發(fā)明的化合物。眾所周知，在醫(yī)藥行業(yè)內(nèi)，以這些形式的任何一種形式存在的化合物可通過稍微改變提純方法來分離，或通過改變這些化合物的合成過程中使用的溶劑的分離形式。

給藥

本發(fā)明的藥物組合物可用于直腸、鼻部、支氣管內(nèi)、局部(包括口腔、舌下腺和眼部給藥)、陰道或腸胃外(包括皮下的、肌肉的、靜脈內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)和皮內(nèi)的)、腹膜內(nèi)或鞘內(nèi)給藥。優(yōu)選的制劑是口服制劑。制劑可方便地以單位劑量形式存在，即以離散部分的形式存在，包含單位劑量或多個(gè)單位劑量或部分單位劑量。舉例來看，制劑可以藥片和緩釋膠囊的形式存在，并可通過制藥領(lǐng)域的任何一種已知方法來制備。

本發(fā)明的用于口服的制劑可以離散單元的形式存在，例如：膠囊劑、凝膠劑(gellules)、滴劑、扁囊劑、丸劑或片劑，各自包含預(yù)定量的活性成分；也可以是粉末或顆粒；也可以是溶液、乳劑或懸浮液，其中活性成分在水溶或非水溶液體中；也可以是水包油乳液或油包水乳液；也可以是大丸藥等。優(yōu)選地，這些組合物每劑量包含活性成分1-250mg，更優(yōu)選10-100mg，甚至更優(yōu)選1-100mg。

用于口服的制劑(例如片劑和膠囊)，術(shù)語“可接受的載體”包括介質(zhì)，例如普通的賦形劑，例如粘合劑，例如：糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃芪膠、聚乙烯吡咯烷酮(聚維酮)、甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙甲纖維素、蔗糖和淀粉；還包括填料和載體，例如：玉米淀粉、明膠、乳糖、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露醇、磷酸氫鈣、氯化鈉和褐藻酸；以及潤滑劑，例如：硬脂酸鎂、硬脂酸鈉和其他金屬硬脂酸、硬脂酸甘油硬脂酸、硅油、滑石蠟、油和硅膠。也可以使用調(diào)味劑，例如薄荷油、冬青油、櫻桃香料等?？赡苄枰砑又珓┮允顾巹┬问饺菀鬃R(shí)別。片劑也可以通過本領(lǐng)域已知的方法包覆。

片劑可通過壓制或模制來制備，可選地，使用一種或多種助劑。壓制片劑可通過在合適的壓縮機(jī)器中壓縮自由流動(dòng)形式例如粉末或顆粒狀的活性成分來制備，所述活性成分可選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合。模印片劑可在合適的機(jī)器中制備，使用惰性液體稀釋劑潤濕粉末化合物得到混合物，然后對(duì)混合物進(jìn)行塑造。片劑可選地是包覆的或刻痕的，以便制成的片劑能提供活性成分的緩慢的或可控的釋放。

其他適合口服的制劑包括錠劑，其包括活性成分和調(diào)味基質(zhì)，通常是蔗糖和阿拉伯膠，或黃芪膠；糖果錠劑，包括活性成分和惰性基質(zhì)，例如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠；以及漱口劑，包含活性成分和合適的液體載體。

其他給藥形式包括溶液或乳液，可被靜脈注射、動(dòng)脈注射、鞘內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、眼內(nèi)注射、局部注射、眼周注射或肌內(nèi)注射，由無菌或消毒溶液制備。

本發(fā)明的藥物組合物也可以是栓劑、陰道藥栓、懸浮液、乳液、洗劑、藥膏、乳膏、凝膠、噴霧劑、溶液或撒布粉的形式。

經(jīng)皮給藥的替代方式是使用皮膚貼劑。例如，活性成分可加入到由聚乙二醇或液體石蠟的乳液組成的乳膏中?；钚猿煞忠部梢?-10％重量百分比的濃度加入藥膏，所述藥膏包括白蠟或白色軟石蠟基質(zhì)，以及可能需要的穩(wěn)定劑和防腐劑。

劑量

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明組合物的合適劑量給目標(biāo)對(duì)象服用，這不需要過度的實(shí)驗(yàn)。通常，醫(yī)生會(huì)確定對(duì)一個(gè)病人來說最合適的實(shí)際劑量，這要依據(jù)很多因素，包括使用的具體化合物的活性、代謝穩(wěn)定性和化合物起作用時(shí)間的長短、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、給藥的形式和時(shí)間、分泌速率、聯(lián)合給藥、特定狀況的嚴(yán)重程度以及個(gè)體正在接受的治療。這里公開的劑量是一般情況的示例。當(dāng)然也可以有個(gè)例，需要使用更高或更低的劑量范圍，這些在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

根據(jù)本發(fā)明，可針對(duì)某個(gè)特定的癥狀或疾病服用有效量的通式(I)的化合物。當(dāng)然，還可以根據(jù)化合物給藥的方式進(jìn)一步改變給藥劑量。例如，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)急性治療的“有效量”，通式(I)的化合物優(yōu)選腸胃外給藥。對(duì)于加入到5％葡萄糖的水或生理鹽水中的化合物，或使用合適賦形劑的類似制劑，靜脈輸注是最有效的，盡管肌肉注射也是有用的。通常，腸胃外劑量大約是0.01-100mg/kg；優(yōu)選0.1-20mg/kg之間，以保持藥物在血漿中的濃度保持在有效濃度的方式?；衔锩刻炜煞靡坏剿拇?，以達(dá)到每日總劑量大約為0.4-400mg/kg/天的水平。通過比較活性成分的血中濃度以及達(dá)到治療效果所要求的濃度，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明化合物治療上有效的的精確用量，和這些化合物的最佳服用途徑。

本發(fā)明的化合物也可以被病人口服，藥物的服用濃度以實(shí)現(xiàn)本文所公開的一種或多種治療作用為準(zhǔn)。通常，包含所述化合物的藥物組合物的口服劑量大約為0.1-50mg/kg之間，以與病人的癥狀符合的方式服用。優(yōu)選地，口服劑量大約是0.1-20mg/kg。

根據(jù)本發(fā)明服用本發(fā)明的化合物時(shí)，未出現(xiàn)不可接受的毒理學(xué)效應(yīng)。本發(fā)明的化合物可能具有良好的生物利用度，可通過幾種生物檢測之一來確定給定藥理作用所需要的化合物的濃度。

聯(lián)合用藥

在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的一種或多種化合物與一種或多種其他活性劑聯(lián)合服用，所述其他活性劑例如市售的現(xiàn)有藥物。在這樣的實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物可以連續(xù)、同時(shí)或依次與一種或多種其他活性劑服用。

通常，藥物結(jié)合使用時(shí)更有效。具體來說，為了避免主要毒性、作用機(jī)制及抗性機(jī)理的疊加，聯(lián)合治療是可取的。此外，以其最大耐受劑量和劑量之間最小時(shí)間間隔內(nèi)服用大多數(shù)藥物也是可取的。聯(lián)合用藥的主要優(yōu)勢在于通過生物化學(xué)相互作用可能促進(jìn)附加的或可能的協(xié)同作用，也可以減少耐藥性的出現(xiàn)。

通過研究測試的化合物和在特定疾病的治療中已知有價(jià)值的或猜想有價(jià)值的藥劑的抑制活性，可以得出有益的組合。這個(gè)過程也可用于確定藥劑的服用順序，即之前、同時(shí)或之后服用。這種順序安排可能是這里確定的所有活性藥劑的特征。

根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，包括：通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，和增加BiP蛋白表達(dá)和/或活性的化合物，以及藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑(參見WO2013/124484)。優(yōu)選地，增加BiP蛋白表達(dá)和/或活性的化合物選自：丙戊酸或其衍生物、曲古抑菌素A、鋰、1-(3，4-二羥基-苯基)-2-硫氰酸根-乙酮和塞那肽-4。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，BiP蛋白是丙戊酸或其衍生物，例如2-烯-丙戊酸。

根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，包括：通式(I)或(II)的PPP1R15A抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽、增加BiP蛋白表達(dá)和/或活性的化合物和藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑，用于治療與PPP1R15A通路有關(guān)和與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊應(yīng)激有關(guān)的疾病，尤其是與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的疾病。優(yōu)選地，所述疾病選自：囊胞性纖維癥、溶酶體貯積癥、淀粉樣變病、癌癥、炎癥、代謝紊亂、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、局部缺血、視網(wǎng)膜疾病、seipin蛋白病變(seipinopathies)、Tau蛋白病變、共核蛋白病、多聚谷氨酰胺和多聚丙氨酸疾病和神經(jīng)退行性疾病，優(yōu)選阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏病、恰克-馬利-杜斯氏癥(Charcot-Marie-Tooth)、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和多發(fā)性硬化癥。

試驗(yàn)

本發(fā)明的另一方面涉及上文描述的化合物在試驗(yàn)中用于進(jìn)一步識(shí)別能夠抑制PPP1R15A-PP1的候選化合物。優(yōu)選地，所述試驗(yàn)是競爭性結(jié)合試驗(yàn)。

更優(yōu)選地，所述競爭結(jié)合試驗(yàn)包括將本發(fā)明的化合物與PPP1R15A-PP1和候選化合物接觸，檢測本發(fā)明的化合物與PPP1R15A-PP1之間相互作用的任何變化。

優(yōu)選地，候選化合物通過本發(fā)明的化合物的常規(guī)SAR修飾而產(chǎn)生。這里使用的術(shù)語“常規(guī)SAR修飾”指的是在本領(lǐng)域已知的通過化學(xué)衍生的方式改變給定化合物的標(biāo)準(zhǔn)方法。

因此，一方面，被識(shí)別出的化合物可以作為開發(fā)其他化合物的模型(例如，模板)。這種試驗(yàn)中所使用的化合物可游離在溶液中、附著在固體支持物上、生于細(xì)胞表面或位于細(xì)胞內(nèi)。可以測定活性的消失或所述化合物和被測試的藥劑之間的結(jié)合復(fù)合物的形成。

本發(fā)明的試驗(yàn)可以是篩選，涉及測試大量藥劑。一方面，本發(fā)明的試驗(yàn)方法是高物料流通量篩選。

本發(fā)明還考慮使用競爭藥物篩選試驗(yàn)，其中，能夠與化合物結(jié)合的中和抗體，與用于結(jié)合到化合物的測試化合物進(jìn)行特異性競爭。

另一種篩選技術(shù)提供高通量篩選(HTS)，篩選具有合適結(jié)合力的藥劑，基于在WO 84/03564中詳細(xì)描述的方法。

預(yù)計(jì)本發(fā)明的試驗(yàn)方法適合測試化合物的小范圍和大范圍篩選，也適合定量分析。

優(yōu)選地，競爭結(jié)合試驗(yàn)包括在存在已知PPP1R15A-PP1基質(zhì)的條件下，將本發(fā)明的化合物與PPP1R15A-PP1接觸，檢測所述PPP1R15A-PP1與所述已知基質(zhì)之間相互作用的任何變化。

本發(fā)明的另一方面提供檢測配體與PPP1R15A-PP1結(jié)合的方法，所述方法包括以下步驟：

(i)在存在已知基質(zhì)的條件下，將配體與PPP1R15A-PP1接觸；

(ii)檢測PPP1R15A-PP1與所述已知基質(zhì)之間相互作用的任何變化。

其中，所述配體是本發(fā)明的一種化合物。

本發(fā)明的一方面涉及一種方法，包括以下步驟：

(a)執(zhí)行上文描述的試驗(yàn)方法；

(b)識(shí)別能夠與配體結(jié)合域結(jié)合的一種或多種配體，以及

(c)制備一些所述一個(gè)或多個(gè)配體。

本發(fā)明的另一方面提供一種方法，包括以下步驟：

(a)執(zhí)行上文描述的試驗(yàn)方法；

(b)識(shí)別能夠與配體結(jié)合域結(jié)合的一種或多種配體，以及

(c)制備含有所述一種或多種配體的藥物組合物。

本發(fā)明的另一方面提供一種方法，包括以下步驟：

(a)執(zhí)行上文描述的試驗(yàn)方法；

(b)識(shí)別能夠與配體結(jié)合域結(jié)合的一種或多種配體；

(c)修飾所述能夠與配體結(jié)合域結(jié)合的一種或多種配體；

(d)執(zhí)行上文描述的試驗(yàn)方法；

(e)可選地，制備含有所述一種或多種配體的藥物組合物。

本發(fā)明還涉及通過上文描述的方法識(shí)別的配體。

本發(fā)明的另一方面還涉及一種藥物組合物，包括通過上文描述的方法識(shí)別的配體。

本發(fā)明的另一方面還涉及上文描述的的方法識(shí)別的配體在制備藥物組合物中的用途，該藥物組合物用于治療如上文定義的與錯(cuò)誤折疊和/或未折疊蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的的疾病。

上述方法可用于篩選能夠作為PPP1R15A-PP1的抑制劑使用的配體。

通式(I)的化合物作為實(shí)驗(yàn)室工具和治療藥劑都是有用的。在實(shí)驗(yàn)室，本發(fā)明的一些化合物可以用于確認(rèn)已知的或新發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)在疾病狀態(tài)的建立或發(fā)展中是否起到關(guān)鍵或至少明顯的生物化學(xué)功能，這一過程通常被稱為‘靶標(biāo)確認(rèn)’。

本發(fā)明進(jìn)一步參照下列附圖來描述，其中：

圖1示出了本發(fā)明的化合物12保護(hù)Hela細(xì)胞免于ER應(yīng)激的劑量依賴保護(hù)，其中ER應(yīng)激是Hela細(xì)胞暴露于衣霉素6小時(shí)來誘導(dǎo)的。

圖2示出了本發(fā)明的化合物11、12和17對(duì)γ干擾素?fù)p傷的大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的劑量依賴保護(hù)。

圖3示出了通過本發(fā)明的化合物5、12和17對(duì)魚藤酮損傷的大鼠原代中腦神經(jīng)元的劑量依賴保護(hù)。

圖4示出了通過本發(fā)明的化合物2對(duì)β-淀粉樣蛋白1-42損傷的大鼠原代皮層神經(jīng)元的劑量依賴保護(hù)。

圖5示出了化合物12和17分別為5μM和10μM時(shí)，預(yù)防人類293T細(xì)胞中T181P突變的DM20蛋白積累的能力。

圖6示出了化合物16預(yù)防細(xì)胞死亡的能力，其中該細(xì)胞死亡是與Min6細(xì)胞中Min6細(xì)胞中表達(dá)的容易錯(cuò)誤折疊的胰島素Akita的累積有關(guān)的細(xì)胞死亡。

圖7示出了化合物12、16和17在不同濃度時(shí)，預(yù)防與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的Min6胰島素瘤細(xì)胞死亡的能力，其中該錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)是通過暴露于衣霉素6小時(shí)誘導(dǎo)的。

圖8示出了化合物11、12、16和17在不同濃度時(shí)，預(yù)防與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積有關(guān)的INS1胰島素瘤細(xì)胞死亡的能力，其中該錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)是通過暴露于衣霉素6小時(shí)誘導(dǎo)的。

圖9示出了化合物6、10、11、12、15、16和17(濃度為25μM)，對(duì)于使用聚肌胞苷酸(poly I：C)進(jìn)行脂轉(zhuǎn)染的鼠胚胎成纖維細(xì)胞，防止其產(chǎn)生1型干擾素的能力。

圖10示出了化合物10保護(hù)新生大鼠心肌細(xì)胞免于缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的能力。該圖示出了通過FACS分析測定的凋亡細(xì)胞的百分比。在化合物2(n＝3)不存在(0μM)或以指定濃度存在的情況下，心肌細(xì)胞暴露于低氧(0.3％O₂)條件36h。

本發(fā)明參照下列非限制性實(shí)施例來進(jìn)一步描述。

實(shí)施例

1-方法和材料

1.1-根據(jù)本發(fā)明的化合物的制備

反應(yīng)物和商業(yè)化合物是從Acros Organics和Sigma-Aldrich公司購買的。根據(jù)本發(fā)明的化合物可按照下面的通用反應(yīng)過程制備：

化合物1和2：2-(2-氯芐基)-N′-(3-甲基丁氧基)氨基胍甲酸鹽(化合物1)和2-(2-氯芐基)-(3-甲基丁氧基)氨基胍(化合物2)的制備

2-(3-甲基丁氧基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-1)

在室溫下將三乙胺(49.58g)逐滴添加到攪拌的N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(40g)和1-溴-3-甲基丁烷(37.4g)的DMF(600ml)溶液中。反應(yīng)混合物在70℃下攪拌18小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻至室溫。將混合物減壓濃縮，所得濾渣懸浮于冷水(1000ml)中。所得懸浮液充分?jǐn)嚢枰欢螘r(shí)間，并在減壓下過濾得到固體。進(jìn)一步用脫鹽水(200m1)和己烷(100m1)洗滌固體。將所得固體在減壓下干燥，得到粗物質(zhì)，將其通過使用硅膠柱色譜法純化。所需產(chǎn)物在約2％甲醇的二氯甲烷中洗脫。蒸發(fā)純產(chǎn)品組分，得到50.0g(3-甲基丁氧基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-1)(產(chǎn)率：87.4％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)0.93(d，6H)，1.57(q，2H)，1.82(m，1H)，4.16(t，2H)，7.86(s，4H)；LC-MS：m/z＝234.25(M+H)。

1-(氨基氧基)-3-甲基丁烷鹽酸鹽(I-2)

在室溫下，將水合肼(12.8g)滴加到攪拌的2-(3-甲基丁氧基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(45g)的甲醇(600ml)溶液中。反應(yīng)混合物在相同溫度下攪拌24小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物，除去不溶性副產(chǎn)物，將所得濾液在減壓下濃縮，得到粗產(chǎn)物，通過使用硅膠柱色譜提純。所需的產(chǎn)物在約1％甲醇的二氯甲烷中洗脫。蒸發(fā)純產(chǎn)品組分，得到所需的游離堿中間體，用4M HCl的1，4-二惡烷溶液將其轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽，得到3.3g 1-(氨基氧基)-3-甲基丁烷鹽酸鹽。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)0.89(d，6H)，1.46(q，2H)，1.65(m，1H)，4.01(t，2H)，10.84(s，3H)。

N′-(3-甲基丁氧基)氨基胍(I-3)

在室溫條件下，將2N NaOH溶液(3.6ml)逐滴加入到攪拌的1-(氨基-氧基)-3-甲基丁烷鹽酸鹽(1.2g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(2.02g)的水(3.6ml)溶液中，攪拌48小時(shí)。然后，減壓濃縮反應(yīng)混合物，濾渣與甲醇(5ml)共沸。將所得濾渣懸浮于乙醇(10ml)中，過濾除去不溶的無機(jī)鹽。濾液直接用于下一步反應(yīng)，無需任何進(jìn)一步處理。通過LCMS分析證實(shí)N′-(3-甲基丁氧基)氨基胍。LC-MS：m/z＝161.5(M+H)。

2-(2-氯芐基)-N′-(3-甲基丁氧基)氨基胍甲酸鹽(化合物1)

在室溫條件下，向含有N′-(3-甲基丁氧基)氨基胍的濾液中逐滴加入2-氯苯甲醛(1.81g)，攪拌2小時(shí)。然后，減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣使用0.1％HCOOH/水/MeCN，通過制備型高效液相色譜進(jìn)一步提純，得到0.27g 2-(2-氯芐基)-N′-(3-甲基丁氧基)氨基胍甲酸鹽(產(chǎn)率：13.1％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)0.88(d，6H)，1.48(q，2H)，1.68(m，1H)，3.75(t，2H)，7.32(m，2H)，7.44(m，2H)，8，10(m，1H)，8.14(m，1H)，8.25(m，1H)，11.80(s broad，2H).LC-MS：m/z＝282.88(M+H)。

2-(2-氯芐基)-N′-(3-甲基丁氧基)氨基胍(化合物2)

將2-(2-氯芐基)-N′-(3-甲基丁氧基)氨基胍甲酸鹽(220mg)溶于水中，并用飽和NaHCO₃溶液堿化。用二氯甲烷萃取上述堿性水溶液，并用水洗滌有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，減壓蒸發(fā)，得到180mg無色的2-(2-氯芐基)-N′-(3-甲基丁氧基)氨基胍游離堿(產(chǎn)率：95％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)0.89(d，6H)，1.49(q，2H)，1.69(m，1H)，3.75(t，2H)，5.73(s寬峰，2H)，7.30(m，2H)，7.44(m，1H)，8，11(m，lH)，8.15(m，1H)，10.48(s寬峰，1H).LC-MS：m/z＝282.82(M+H)。

化合物3：制備2-(2-氯亞芐基)-N′-[2-(甲基磺?；?乙氧基]氨基胍

2-[2-(甲硫基)乙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-4)

在室溫條件下，將2-氯乙基甲基硫醚(10.1g)逐滴加入到攪拌的N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(12.5g)、碘化鉀(2.5g)和碳酸鉀(21.1g)的DMF(150ml)溶液中，反應(yīng)混合物在80℃條件下攪拌18小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并傾倒入500ml冷水中。然后，在減壓條件下過濾所得的固體。將所得固體減壓干燥，得到9.7g 2-[2-(甲硫基)乙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-4)(產(chǎn)率：52.8％)，并且不經(jīng)任何進(jìn)一步處理就用于下一反應(yīng)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)2.16(s，3H)，2.84(t，2H)，4.29(t，2H)，7.87(s，4H).LC-MS：m/z＝238.4(M+H)。

2-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-5)

在室溫條件下，將m-CPBA(11g)分批加入到攪拌的2-[2-(甲基硫烷基)乙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(9.6g)的二氯甲烷溶液中，并在室溫下攪拌6小時(shí)。在減壓濃縮粗產(chǎn)物，將所得濾渣懸浮于飽和NaHCO₃溶液(100m1)中，并攪拌30分鐘。減壓條件下過濾，所得固體水(50ml)洗，減壓干燥，得到9.0g 2-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(產(chǎn)率：82.6％)，并且不經(jīng)任何進(jìn)一步處理就用于下一反應(yīng)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)3.15(s，3H)，3.66(t，2H)，4.54(t，2H)，7.88(s，4H).LC-MS：m/z＝270.3(M+H)。

1-(氨氧基)-2-(甲基磺?；?乙烷鹽酸鹽(I-6)

將85％甲基肼(2.0g)逐滴加入到2-[2-(甲基磺?；?乙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(9.0g)的二氯甲烷(100ml)溶液的攪拌的懸浮液中，攪拌6小時(shí)。然后在減壓條件下，過濾反應(yīng)混合物，除去不溶的副產(chǎn)物。將所得濾液在較低溫度下減壓濃縮。濾渣懸浮于1N HCl(100ml)中，用乙酸乙酯(3×250ml)萃取。所得的含有所需產(chǎn)物的水溶液在減壓條件下濃縮，得到白色固體，進(jìn)一步用乙醚研磨并減壓干燥，得到4.0g 1-氨氧基)-2-(甲基磺?；?乙烷鹽酸鹽(產(chǎn)率：68.3％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)3.04(s，3H)，3.60(t，2H)，4.38(t，2H)，10.09(s broad，2H).LC-MS：m/z＝270.3(M+H)。

N′-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]氨基胍(I-7)

在室溫條件下，將2N NaOH溶液(4.28ml)逐滴加入到攪拌的1-(氨基氧基)-2-(甲基磺?；?乙烷鹽酸鹽(1.5g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(1.99g)的水溶液中，攪拌48小時(shí)。然后，減壓濃縮反應(yīng)混合物，濾渣與甲醇(5m1)共沸。所得反應(yīng)物懸浮于乙醇(10ml)中，過濾除去不溶的無機(jī)鹽。所得含有N′-[2-(甲基磺?；?乙氧基]氨基胍的濾液直接用于下一反應(yīng)，無需任何進(jìn)一步處理。

2-(2-氯亞芐基)-N′-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]氨基胍(化合物3)

在室溫條件下，將2-氯苯甲醛(1.32g)逐滴加入到含有N′-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]氨基胍的濾液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣使用0.1％NH₃/水/MeCN，通過制備型高效液相色譜進(jìn)一步提純，得到20mg 2-(2-氯亞芐基)-N′-[2-(甲基磺?；?乙氧基]氨基胍(2步嚴(yán)率：0.7％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)3.03(s，3H)，3.45(m，2H)，4.12(m，2H)，6.11(s，2H)，7.40(m，2H)，7.44(m，1H)，8.15(m，1H)，8.26(s寬峰，1H)，10.48(s，1H).LC-MS：m/z＝318.83(M+H)。

化合物4：2-(2-氯亞芐基)-N′-[3-(甲基磺?；?丙氧基]氨基胍

2-[3-(甲基硫烷基)丙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-8)

在氮?dú)夥諊校瑢⑴嫉人岫惐?77.92ml)逐滴加入到攪拌的N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(36.8g)、3-(甲基硫烷基)-1-丙醇(30g)和三苯基膦(37.1g)的無水THF溶液中。反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，然后使其升溫至室溫并攪拌18小時(shí)。然后，在減壓條件下濃縮反應(yīng)混合物，得到粗產(chǎn)物，通過使用硅膠的柱色譜法提純。所需產(chǎn)物在4％乙酸乙酯的己烷溶液中洗脫。蒸發(fā)純產(chǎn)物組分，得到30g 2-[3-(甲基硫烷基)丙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(產(chǎn)率：42.2％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.94(q，2H)，2.07(s，3H)，2.67(t，2H)，4.23(t，2H)，7.87(s，4H).LC-MS：m/z＝252.4(M+H)。

2-[3-(基磺?；?丙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-9)

在室內(nèi)溫度條件下，將m-CPBA(61.89g)分批加入到攪拌的2-[3-(甲基硫烷基)丙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(30.0g)的二氯甲烷(550ml)。混合物在室溫下攪拌5小時(shí)。然后，減壓濃縮反應(yīng)混合物，得到粗產(chǎn)物，懸浮于飽和NaHCO₃溶液(250ml)中，充分?jǐn)嚢?0分鐘。在減壓條件下，過濾，所得固體水(100ml)洗。減壓干燥，得到22g 2-[3-(基磺?；?丙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(產(chǎn)率：65％)。¹H-NMR(CDCl3)：δ(ppm)2.32(m，2H)，3.00(s，3H)，3.50(t，2H)，4.39(t，2H)，7.83(m，4H).LC-MS：m/z＝283.9(M+H)。

1-(氨氧基)-3-(甲基磺?；?丙烷鹽酸鹽(I-10)

在室內(nèi)溫度條件下，將85％甲基肼(4.2g)逐滴加入到2-[3-(甲基磺?；?丙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(20g)的二氯甲烷(300ml)溶液的攪拌懸浮液中，攪拌6小時(shí)。然后，在減壓條件下過濾，除去不溶性副產(chǎn)物。所得濾液在低溫下減壓濃縮。濾渣懸浮于1N HCl(200ml)中，用乙酸乙酯(3×500ml)萃取，除去不需要的雜質(zhì)。減壓濃縮所得水溶液，得到白色固體，進(jìn)一步用乙醚研磨，減壓干燥，得到8.0g 1-(氨氧基)-3-(甲基磺?；?丙烷鹽酸鹽(產(chǎn)率：59.8％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)2.04(m，2H)，3.02(s，3H)，3.19(t，2H)，4.12(t，2H)，11.06(s broad，3H)。

N′-[3-(甲基磺?；?丙氧基]氨基胍(I-11)

在室溫條件下，將2N NaOH溶液(5.28ml)逐滴加入到攪拌的1-(氨基氧基)-3-(甲基磺酰基)丙烷鹽酸鹽(2.0g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(2.46g)的水(6.0ml)溶液中，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。通過LCMS分析證實(shí)生成了N′-[3-(甲基磺?；?丙氧基]氨基胍。然后，減壓濃縮反應(yīng)混合物，濾渣與甲醇(5m1)共沸。所得反應(yīng)物懸浮于乙醇(15ml)中，過濾除去不溶的無機(jī)鹽。所得濾液直接用于下一反應(yīng)，無需任何進(jìn)一步處理。LC-MS：m/z＝210.8(M+H)。

2-(2-氯亞芐基)-N′-[3-(甲基磺?；?丙氧基]氨基胍(化合物4)

在室溫條件下，將2-氯苯甲醛(1.62g)逐滴加入到含有N′-[2-(甲基磺酰基)丙氧基]氨基胍的濾液?；旌衔镌谙嗤瑴囟认聰嚢?小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣使用0.1％NH₃/水/MeCN，通過制備型高效液相色譜進(jìn)一步提純。提純后，所得物質(zhì)在飽和NaHCO₃溶液中攪拌，減壓過濾得固體，水洗并干燥，得到0.14g純的2-(2-氯亞芐基)-N′-[3-(甲基磺?；?丙氧基]氨基胍(2步產(chǎn)率：4％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)2.01(m，2H)，2.98(s，3H)，3.24(t，2H)，3.82(t，2H)，5.90(s，2H)，7.31(m，2H)，7.43(d，1H)，8.13(m，2H)，10.48(s，1H).LC-MS：m/z＝333.5(M+H)。

化合物5：2-(2-氯亞芐基)-N′-(丙-2-烯-1-基氧基)肼甲亞氨酰胺

N′-(丙-2-烯-1-基氧基)氨基胍(I-12)

在室溫條件下，將2N NaOH溶液(6.8ml)逐滴加入到攪拌的將O-烯丙基羥胺鹽酸鹽(1.5g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(3.22g)的水(4.2ml)溶液中，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌48小時(shí)。通過LCMS分析證實(shí)生成了中間體I-12：N′-(丙-2-烯-1-基氧基)氨基胍。然后，減壓濃縮反應(yīng)混合物，濾渣與甲醇(5ml)共沸。所得反應(yīng)物懸浮于乙醇(10ml)中，過濾除去不溶的無機(jī)鹽。所得濾液直接用于下一反應(yīng)，無需任何進(jìn)一步處理。LC-MS：m/z＝130.6(M+H)。

2-(2-氯亞芐基)-N′-(丙-2-烯-1-基氧基)氨基胍(化合物5)

在室溫條件下，向含有N′-(丙-2-烯-1-基氧基)氨基胍的濾液中逐滴加入2-氯苯甲醛(1.9g)，攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣使用0.1％HCOOH/水/MeCN，通過制備型高效液相色譜進(jìn)一步提純，得到0.25g 2-(2-氯亞芐基)-N′-(丙-2-烯-1-基氧基)氨基胍(2步產(chǎn)率：6.1％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)3.17(s，1H)，4.23(m，2H)，5.82(s broad，2H)，5.98(m，1H)，7.37(m，2H)，8.15(m，3H).LC-MS：m/z＝252.8(M+H)。

化合物6：2-(2-氯亞芐基)-N′-(2-羥基乙氧基)肼甲亞氨酰胺

2-(2-羥基乙氧基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-13)

在室溫條件下，將2-溴丙醇(13.26ml)逐滴加入到攪拌的N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(10.0g)和乙酸鈉(25.14g)的DMF(50ml)溶液中。反應(yīng)混合物在80℃下攪拌1.5小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，傾倒入500ml冷水中，產(chǎn)物用乙酸乙酯(2×400ml)萃取。合并所得有機(jī)層，在真空下蒸餾。將濾渣在冷水中攪拌，并在真空下過濾得到固體。減壓干燥所得固體，得到6.0g 2-(2-羥基乙氧基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(產(chǎn)率：47.3％)，其不經(jīng)任何進(jìn)一步處理就用于下一反應(yīng)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)3.70(q，2H)，4.18(t，2H)，4.83(t，1H)，7.87(s，4H).LC-MS：m/z＝208.34(M+H)。

2-(氨基氧基)乙醇鹽酸鹽(I-14)

在室溫條件下，將85％甲基肼(1.25g)逐滴加入到攪拌的2-(2-羥基乙氧基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(6.0g)的二氯甲烷(25ml)溶液中，攪拌2小時(shí)。然后，在減壓條件下過濾反應(yīng)混合物，除去不溶性副產(chǎn)物。在減壓條件下在較低溫度下濃縮濾液。濾渣懸浮于2N HCl的乙酸乙酯(20ml)中，并在較低溫度下減壓濃縮。所得固體用二氯甲烷(2×15ml)研磨，減壓干燥，得到2.8g 2-(氨基氧基)乙醇鹽酸鹽(產(chǎn)率：85.5％，單鹽酸鹽)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)3.61(m，2H)，4.04(t，2H)，4.73(m，1H)，11.02(s寬峰，2H)。

N′-(2-羥基乙氧基)氨基胍(I-15)

在室溫條件下，將2N NaOH溶液(10.6ml)逐滴加入到攪拌的2-(氨基氧基)乙醇鹽酸鹽(2.4g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(4.98g)的水(8.4ml)溶液中，攪拌24小時(shí)。通過LCMS分析證實(shí)生成了N′-(2-羥基乙氧基)肼甲亞氨酰胺。減壓濃縮混合物，所得濾渣與甲醇(15ml)共沸。所得反應(yīng)物懸浮于乙醇(10ml)中，過濾除去不溶的無機(jī)鹽。含有N′-(2-羥基乙氧基)氨基胍的濾液直接用于下一反應(yīng)，無需任何進(jìn)一步處理。LC-MS：m/z＝134.6(M+H)。

2-(2-氯亞芐基)-N′-(2-羥基乙氧基)氨基胍(化合物6)

在室溫條件下，向含有N′-(2-羥基乙氧基)氨基胍的濾液中逐滴滴加2-氯苯甲醛(3.28g)，攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣使用0.1％NH₃/水/MeCN，通過制備型高效液相色譜進(jìn)一步提純，得到0.24g 2-(2-氯亞芐基)-N′-(2-羥基乙氧基)氨基胍(2步產(chǎn)率：4.4％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)3.68(m，2H)，3.97(m，2H)，5.82(s寬峰，2H)，5.07(m，1H)，7.50(m，2H)，7.55(m，1H)，8.34(m，1H)8.47(s，1H)，8.67(s，1H)，11.78(m，1H)，12.09(m，1H).LC-MS：m/z＝256.73(M+H)。

化合物7：2-(2-氯亞芐基)-N′-(2-氯乙氧基)肼甲亞氨酰胺鹽酸鹽

在0℃條件下，將SOCl₂(0.26ml)逐滴滴加到攪拌的2-(2-氯亞芐基)-N′(2-羥基乙氧基)肼甲亞氨酰胺鹽酸鹽(0.22g)的二氯甲烷(10ml)溶液中。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。然后，減壓濃縮將反應(yīng)混合物。所得濾渣用正戊烷(2×5ml)研磨，減壓干燥，得到0.26g 2-(2-氯亞芐基)-N′-(2-氯乙氧基)肼甲亞氨酰胺鹽酸鹽(產(chǎn)率：99.5％)。LC-MS：m/z＝274.8(M+H)。

化合物8：2-(2-氯亞芐基)-N′-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]肼甲亞氨酰胺

將吡咯烷(0.23g)加入到攪拌的2-(2-氯亞芐基)-N′-(2-氯乙氧基)肼甲亞氨酰胺鹽酸鹽(0.27g)、三乙胺(0.35g)和碘化鈉(10ml)的THF(10ml)溶液中。所得混合物在50℃下攪拌24小時(shí)。然后，反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，將粗產(chǎn)物倒入50ml冷水中。產(chǎn)物用乙酸乙酯(2×50ml)萃取。然后，合并有機(jī)層，并真空蒸餾，所得濾渣使用0.1％NH₃/水/MeCN通過制備型高效液相色譜進(jìn)一步提純，得到14mg 2-(2-氯亞芐基)-N′-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]肼甲亞氨酰胺(產(chǎn)率：5.3％)。¹H-NMR(MeOD)：δ(ppm)1.91(m，4H)，2.75(m，4H)，2.88(t，2H)，3.97(t，2H)，7.32(m，2H)，7.41(m，1H)，8.07(m，1H)，8.32(s，1H).LC-MS：m/z＝310.33(M+H)。

化合物10：2-(2-氯亞芐基)-N′-乙氧基氨基胍

N′-(2-乙氧基)氨基胍(I-16)

在室溫條件下，將1N NaOH溶液(5.12ml)逐滴滴加到攪拌的乙氧基胺鹽酸鹽(0.5g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(1.19g)的水(5.0ml)溶液中，攪拌48小時(shí)。通過LCMS分析證實(shí)生成了N′-(2-乙氧基)氨基胍。減壓濃縮混合物，將所得濾渣溶于乙醇(15ml)中。過濾除去不溶性固體。將濾液濃縮，并將N′-(2-乙氧基)氨基胍直接用于下一反應(yīng)，無需任何進(jìn)一步處理。LC-MS：m/z＝118.8(M+H)。

2-(2-氯亞芐基)-N′-乙氧基氨基胍(化合物10)

在室溫條件下，將2-氯苯甲醛(0.717g)逐滴滴加到在N′-(2-乙氧基)氨基胍的乙醇(10ml)和乙酸鈉(0.42g)溶液中，并在90℃下攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣進(jìn)一步經(jīng)過色譜提純，得到21.4mg 2-(2-氯亞芐基)-N′-乙氧基氨基胍(2步產(chǎn)率：1.7％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.18(t，3H)，3.77(q，2H)，5.77(s寬峰，2H)，7.31(m，2H)，7.43(m，1H)，8.11(m，1H)，8.15(s，1H)，10.45(s寬峰，1H).LC-MS：m/z＝240.9(M+H)。

化合物11：2-(2，6-二氯亞芐基)-N-乙氧基氨基胍

在室溫條件下，將2，6-二氯苯甲醛(0.896g)逐滴滴加到1當(dāng)量的N′-(2-乙氧基)氨基胍(I-16)的乙醇(10ml)和乙酸鈉(0.42g)溶液中，在90℃下攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣進(jìn)一步經(jīng)過色譜提純，得到57mg 2-(2，6-二氯亞芐基)-N-乙氧基氨基胍(2步產(chǎn)率：4.1％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.77(t，3H)，3.78(q，2H)，5.48(s寬峰，2H)，7.33(t，1H)，7.52(m，2H)，8.04(s，1H)，8.16(m，1H).LC-MS：m/z＝277.1(M+H)。

化合物12：2-(2-氯亞芐基)-N-丙氧基氨基胍

N′-丙氧基氨基胍(I-17)

在室溫條件下，將2N NaOH溶液(1.23ml)逐滴滴加到O-丙基羥胺鹽酸鹽(0.28g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(0.58g)的水(2.0ml)溶液中，攪拌24小時(shí)。通過LCMS分析證實(shí)生成了N′-丙氧基氨基胍。減壓濃縮混合物，所得濾渣溶于乙醇(15ml)中。過濾除去不溶性固體。濾液濃縮，N′-丙氧基氨基胍不進(jìn)行任何進(jìn)一步處理，直接用于下一反應(yīng)。LC-MS：m/z＝132.9(M+H)。

2-(2-氯亞芐基)-N-丙氧基氨基胍(化合物12)

將2-氯苯甲醛(0.35g)逐滴滴加到N′-(2-丙氧基)氨基胍的乙醇(10ml)溶液中，室溫下攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣進(jìn)一步經(jīng)過色譜提純，得到25mg 2-(2-氯亞芐基)-N-丙氧基氨基胍(2步產(chǎn)率：3.9％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)0.88(t，3H)，1.58(m，2H)，3.66(t，2H)，5.75(s寬峰，1H)，7.29(m，2H)，7.41(m，1H)，8.10(m，2H)，10.45(s寬峰，2H).LC-MS：m/z＝255.1(M+H)。

化合物13：2-(2-氯亞芐基)-N-(2-乙氧基乙氧基)氨基胍

2-(2-乙氧基乙氧基)-1，3-二甲叉基-2，3-二氫-1H-異吲哚(I-18)

將N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(4.0g)和1-溴-2-乙氧基乙烷(11.25g)溶于DMF(40.0ml)中，在室溫下向該溶液中加入CH₃COONa(10.0g)。反應(yīng)混合物在70℃下攪拌12小時(shí)。冷卻至室溫，倒入水中，然后用乙酸乙酯萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)層，通過硅膠柱色譜法提純。用0-30％乙酸乙酯的己烷溶液洗脫所需產(chǎn)物。蒸發(fā)純產(chǎn)物組分，得到4.8g 2-(2-乙氧基乙氧基)-1，3-二甲叉基-2，3-二氫-1H-異吲哚(I-18)(產(chǎn)率：83.3％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)0.98(t，3H)，3.39(q，2H)，3.73(t，2H)，4.27(t，2H)，7.87(s，4H).LC-MS：m/z＝236.2(M+H)。

1-(氨氧基)-2-乙氧基乙烷鹽酸鹽(I-19)

在室溫條件下，將水合肼(1.32g)逐滴滴加到攪拌的2-(2-乙氧基乙氧基)-1，3-二甲叉基-2，3-二氫-1H-異吲哚(4.8g)的甲醇(10ml)溶液中，攪拌30分鐘。然后，減壓過濾反應(yīng)混合物，除去不溶性副產(chǎn)物。在較低溫度下在減壓濃縮濾液，并且研磨醚，過濾除去不溶物。然后，向?yàn)V液中逐滴滴加4N HCl的二惡烷(10.2ml)溶液，過濾收集沉淀的鹽，干燥，得到2.0g 1-(氨氧基)-2-乙氧基乙烷鹽酸鹽(產(chǎn)率：69.4％，單鹽酸鹽)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.11(t，3H)，3.44(q，2H)，3.59(m，2H)，4.14(m，2H)，11.02(s寬峰，2H).LC-MS：m/z＝106.1(M+H)。

N′-(2-乙氧基乙氧基)氨基胍(I-20)

在室溫條件下，將1N NaOH溶液(4.23ml)逐滴滴加到1-(氨基氧基)-2-乙氧基乙烷鹽酸鹽(0.6g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(0.99g)的水(2.1ml)溶液中，攪拌48小時(shí)。通過LCMS分析證實(shí)生成了N′-(2-乙氧基乙氧基)氨基胍。減壓濃縮混合物，所得濾渣溶于乙醇(10ml)中。過濾除去不溶性固體。濾液濃縮，N′-(2-乙氧基乙氧基)氨基胍不進(jìn)行任何進(jìn)一步處理，直接用于下一反應(yīng)。LC-MS：m/z＝163.0(M+H)。

2-(2-氯苯亞甲基)-N-(2-乙氧基乙氧基)氨基胍(化合物13)

將2-氯苯甲醛(0.59g)逐滴滴加到N′-(2-乙氧基乙氧基)氨基胍的在乙醇(5ml)溶液中，室溫下攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣經(jīng)色譜法進(jìn)一步提純，得到19mg 2-(2-氯苯亞甲基)-N-(2-乙氧基乙氧基)氨基胍(2步產(chǎn)率：1.8％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.24(t，3H)，3.48(q，2H)，3.56(m，2H)，3.83(m，2H)，5.80(s寬峰，1H)，7.43(m，1H)，8.12(m，1H)，8.17(s，1H)，10.50(s寬峰，2H).LC-MS：m/z＝285.0(M+H)。

化合物14：2-(2-氯亞芐基)-N′-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]氨基胍

2-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-21)

在室溫條件下，將三乙胺(12.13g)逐滴滴加到攪拌的N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(9.85g)和1-溴-3-甲基丁烯(9.0g)的DMF(30ml)溶液中。反應(yīng)混合物在70℃下攪拌2小時(shí)。冷卻至室溫。減壓濃縮混合物，所得濾渣懸浮于冷水中。所得懸浮液充分?jǐn)嚢枰欢螘r(shí)間，減壓過濾，得固體。所得固體進(jìn)一步用脫鹽水(200ml)和己烷(100ml)洗滌。減壓條件下干燥，得到粗產(chǎn)物，使用硅膠柱色譜提純，得到9.0g 2-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(產(chǎn)率：64.5％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.70(d，6H)，4.63(m，2H)，5.45(m，1H)，7.87(s，4H).LC-MS：m/z＝232.1(M+H)。

1-(氨氧基)-3-甲基丁-2-烯鹽酸鹽(I-22)

將水合肼(2.52g)逐滴滴加到攪拌的2-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(9.0g)的甲醇(120ml)溶液中。反應(yīng)混合物在相同溫度下攪拌30分鐘。過濾以除去不溶性副產(chǎn)物，減壓濃縮所得濾液，得到粗產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱色譜提純。粗產(chǎn)物用乙醚研磨，過濾除去不溶物。濾液用4M HCl的二惡烷(19ml)溶液處理，過濾地沉淀，收集并真空干燥，得到2.9g 1-(氨氧基)-3-甲基丁-2-烯鹽酸鹽(產(chǎn)率：73.6％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.70(s，3H)，1.75(s，3H)，1.65(m，1H)，4.50(d，2H)，5.30(t，1H)，10.89(s，3H)。

N′-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]氨基胍(I-23)

將1NNaOH溶液(3.63ml)逐滴滴加到攪拌的1-(氨基氧基)-3-甲基丁-2-烯鹽酸鹽(0.5g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(0.85g)的水(3ml)溶液中，攪拌48小時(shí)。然后，減壓濃縮反應(yīng)混合物。所得濾渣懸浮于乙醇(15ml)中，過濾除去不溶的無機(jī)鹽。濾液濃縮并直接用于下一反應(yīng)，無需任何進(jìn)一步處理。LC-MS：m/z＝159.15(M+H)。

2-(2-氯亞芐基)-N′-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]氨基胍(化合物14)

在室溫條件下，將2-氯苯甲醛(0.5g)逐滴滴加到N′-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]氨基胍的乙醇(3ml)溶液中，90℃下攪拌2小時(shí)C。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得濾渣進(jìn)一步通過色譜法提純，得到139mg 2-(2-氯亞芐基)-N′-[(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基]氨基胍(2步產(chǎn)率：13.5％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.64(s，3H)，1.71(s，3H)，3.17(s，1H)，4.25(d，2H)，5.39(t，1H)，5.75(s寬峰，2H)，7.32(m，1H)，7.43(m，1H)，8.10(m，1H)，8.15(m，1H)，8.17(s寬峰，1H).LC-MS：m/z＝281.2(M+H)。

化合物15：2-(2-氯亞芐基)-N-[2-(乙基硫烷基)乙氧基]氨基胍

2-溴乙基乙基硫醚(I-24)

在0℃下，將PBr₃(10ml)逐滴滴加到2-(乙基硫烷基)乙醇的二氯甲烷(100ml)溶液中，攪拌2小時(shí)。然后，反應(yīng)混合物升溫至室溫后，攪拌16小時(shí)。反應(yīng)混合物在0℃下冷卻，加入10ml水。然后，用飽和Na₂CO₃溶液(至Ph7)中和反應(yīng)混合物，用二氯甲烷(3×250ml)萃取。分離有機(jī)層，合并，干燥(Na₂SO₄)，濃縮，得到13.0g 2-溴乙基乙基硫醚(產(chǎn)率：72.7％)。¹H-NMR(CDCl3)：δ(ppm)1.30(t，3H)，2.62(q，2H)，2.97(m，2H)，3.50(m，2H)。

2-[2-(乙基硫烷基)乙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-25)

將N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(3.9g)和2-溴乙基乙基硫醚(12.1g)溶于DMF(40.0ml)中，在室溫下，將CH₃COONa(9.7g)分批加入上述溶液中。反應(yīng)混合物在70℃下攪拌2小時(shí)。冷卻至室溫，倒入冷水中，然后用乙酸乙酯萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)層，使用硅膠柱色譜提純。得到6.0g 2-[2-(乙基硫烷基)乙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(I-25)(產(chǎn)率：98％)。¹H-NMR(CDCl3)：δ(ppm)1.29(t，3H)，2.63(q，2H)，2.94(t，2H)，4.36(t，2H)，7.77(m，2H)，7.86(m，2H)。

1-(氨氧基)-2-(乙基硫烷基)乙烷鹽酸鹽(I-26)

在室溫條件下，將水合肼(0.25g)逐滴滴加到攪拌的2-[2-(乙基硫烷基)乙氧基]-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(1.0g)的甲醇溶液中。反應(yīng)混合物在相同溫度下攪拌30分鐘。過濾除去不溶性副產(chǎn)物，減壓濃縮所得濾液，然后溶解于DCM中，過濾除去不溶物。減壓濃縮所得濾液，然后將粗產(chǎn)物用乙醚研磨，過濾除去不溶物。濾液用4M HCl的二惡烷(2ml)溶液逐滴處理。然后蒸發(fā)除去溶劑，殘余物用乙醚研磨，得到454mg 1-(氨氧基)-2-(乙基硫烷基)乙烷鹽酸鹽(產(chǎn)率：72.5％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.18(s，3H)，2.53(m，2H)，2.79(t，2H)，4.16(t，2H)，11.14(s寬峰，3H)。

N′-[2-(乙基硫烷基)乙氧基]氨基胍(I-27)

在室溫條件下，將1N NaOH溶液(2.88ml)逐滴滴加到1-(氨基氧基)-2-(乙基硫烷基)乙烷鹽酸鹽(0.5g)和s-甲基異氨基硫脲氫碘酸鹽(0.7g)的水(5ml)溶液中，攪拌48小時(shí)。減壓濃縮混合物，所得濾渣溶于乙醇(15ml)中。過濾除去不溶性固體。濾液濃縮，N′-[2-(乙基硫烷基)乙氧基]氨基胍不進(jìn)行任何進(jìn)一步處理，直接用于下一反應(yīng)。

2-(2-氯亞芐基)-N-[2-(乙基硫烷基)乙氧基]氨基胍(化合物15)

將2-氯苯甲醛(0.4g)逐滴滴加到N′-[2-(乙基硫烷基)乙氧基]氨基胍的乙醇(5ml)溶液中，室溫下攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得殘余物通過色譜法進(jìn)一步提純，得到15mg 2-(2-氯亞芐基)-N-[2-(乙基硫烷基)乙氧基]氨基胍(2步收率：1.5％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.90(t，3H)，2.54(q，2H)，2.75(t，2H)，3.85(t，2H)，5.84(s寬峰，2H)，7.30(m，2H)，7.44(m，1H)，8.12(m，1H)，8.16(s，1H)，10.50(s寬峰，1H).LC-MS：m/z＝301.9(M+H)。

化合物16：2-[(3-氯吡啶-4-基)亞甲基]-N-乙氧基氨基胍

在室溫條件下，將3-氯異煙醛(0.72g)逐滴滴加到1當(dāng)量的N′-(2-乙氧基)氨基胍(I-16)的乙醇(5ml)和乙酸鈉(0.42g)溶液中，在80℃攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得殘余物通過色譜進(jìn)一步提純，得到184mg 2-[(3-氯吡啶-4-基)亞甲基]-N-乙氧基氨基胍(2步產(chǎn)率：15％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.19(t，3H)，3.79(q，2H)，5.96(s寬峰，2H)，8.05(s，1H)，8.11(d，1H)，8.41(s，1H)，10.89(s寬峰，1H).LC-MS：m/z＝242.0(M+H)。

化合物17：2-(2-氯-6-氟亞芐基)-N-乙氧基氨基胍

在室溫條件下，將2-氯-6-氟苯甲醛(0.81g)逐滴滴加到1當(dāng)量N′-(2-乙氧基)氨基胍(I-16)的乙醇(5ml)和乙酸鈉(0.42g)溶液中，在80℃下攪拌2小時(shí)。減壓濃縮反應(yīng)混合物，所得殘余物進(jìn)一步通過色譜提純，得到215mg 2-(2-氯-6-氟亞芐基)-N-乙氧基氨基胍(2步產(chǎn)率：17.2％)。¹H-NMR(DMSO-d6)：δ(ppm)1.17(m，3H)，3.78(q，2H)，5.48(s broad，2H)，7.30(m，3H)，8.01(s，1H)，10.54(s寬峰，1H).LC-MS：m/z＝258.9(M+H)。

化合物18：N′-丁氧基-2-(2-氯亞芐基)氨基胍

化合物18的制備方法與化合物12相同，由2-氯苯甲醛和N′-(2-丁氧基)氨基胍反應(yīng)制得。

化合物19：2-(2-氯-6-氟亞芐基)-N′-丙氧基氨基胍

化合物19的制備方法與化合物17相同，由2-氯-6-氟苯甲醛和N′-(2-丙氧基)肼甲脒(I-17)反應(yīng)，得到2-(2-氯-6-氟亞芐基)-N′-丙氧基氨基胍。LC-MS：m/z＝273.0(M+H)。

化合物20：2-(2-氯-6-氟亞芐基)-N′-丁氧基氨基胍

化合物20的制備方法與化合物17相同，由2-氯-6-氟苯甲醛和N′-(2-丁氧基)氨基胍制備。

化合物21：2-(2，6-二氯亞芐基)-N-丙氧基氨基胍

化合物21的制備方法與化合物11相同，由2，6-二氯苯甲醛和N′-(2-丙氧基)氨基胍(I-17)反應(yīng)，得到2-(2，6-二氯亞芐基)-N-丙氧基氨基胍。LC-MS：m/z＝290.9(M+H)。

化合物22：2-(2，6-二氯苯亞甲基)-N-丁氧基氨基胍

化合物22的制備方法與化合物17相同，由2，6-二氯苯甲醛和N′-(2-丁氧基)氨基胍反應(yīng)制得。

化合物23：2-[(3-氯吡啶-4-基)亞甲基]-N-丙氧基氨基胍

化合物23的制備方法與化合物16相同，由3-氯異煙醛和N′-(2-丙氧基)肼甲脒(I-17)反應(yīng)，制得2-(2-氯-6-氟亞芐基)-N′-丙氧基氨基胍。LC-MS：m/z＝255.9(M+H)。

根據(jù)本發(fā)明選擇的化合物列于下表中：

在下面的一些實(shí)驗(yàn)中，也可使用這些化合物的鹽。

1.2-哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

在伊格爾極限必需培養(yǎng)基(EMEM)中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，該培養(yǎng)基中添加了谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、青霉素和鏈霉素(Lonza公司)，還包含10％胎牛血清(FBS)(瓊脂糖)。

在杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(EMEM)中培養(yǎng)293T細(xì)胞，該培養(yǎng)基中添加了青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺(Lonza公司)和10％胎牛血清(FBS)(瓊脂糖)。

在EMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)Min6細(xì)胞，該培養(yǎng)基中添加了青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、50μM β-巰基乙醇和15％胎牛血清(FBS)(瓊脂糖)。

在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)INS1細(xì)胞，該培養(yǎng)基中添加了青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、丙酮酸鈉(Lonza公司)、50μM β-巰基乙醇和10％胎牛血清(FBS)(瓊脂糖)。每個(gè)細(xì)胞系都維持在37℃，5％CO₂氣氛中。

PLP1、DM20和胰島素的人開放閱讀框(ORF)序列是從美國生命技術(shù)公司(英杰公司)獲得的(分別是IOH41689、IOH5252和IOH7334)。通過 LR Clonase^TM II酶混合物(英杰公司)構(gòu)建克隆到pDEST26表達(dá)質(zhì)粒(英杰公司)。ORF突變是使用定點(diǎn)突變?cè)噭┖?QuikChange LightningSite-Directed Mutagenesis Kit)(Stratagene公司)(對(duì)PLP1和DM20ORFs來說是T181P突變，對(duì)胰島素ORF來說是Akita(C96Y)突變)。

使用4D細(xì)胞核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Amaxa^TM 4D-Nucleofector^TM System)(Lonza公司)，或通過使用脂質(zhì)體(美國生命技術(shù)公司)轉(zhuǎn)染，來實(shí)施哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)。

1.3-免于ER應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用

Tsaytler等(《科學(xué)》，2011年)對(duì)該試驗(yàn)進(jìn)行了描述。

在37℃，5％CO₂氣氛中，在伊格爾極限必需培養(yǎng)基(EMEM)中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，該培養(yǎng)基中添加了谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、青霉素和鏈霉素(Lonza公司)，還包含10％胎牛血清(FBS)。治療前一天，將細(xì)胞以17,000細(xì)胞/mL的濃度鋪于96孔板。通過添加5μg/mL的衣霉素(西格瑪-奧德里奇公司)和PPP1R15A抑制劑(0.5-10μM)產(chǎn)生ER應(yīng)激。6h后介質(zhì)更換新鮮的介質(zhì)，并通過添加PPP1R15A抑制劑(0.5-10μM)維持細(xì)胞保護(hù)作用。衣霉素治療48h或72h后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Sigma公司)，按照供應(yīng)商的建議，測定WST-8到甲瓚的減少來評(píng)估細(xì)胞存活率。

ER應(yīng)激之后，通過與參考化合物胍那芐(Tsaytler等，《科學(xué)》，2011年)相比較來測定針對(duì)ER應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用：

-‘-’無細(xì)胞保護(hù)作用；

-‘+’低于胍那芐的細(xì)胞保護(hù)作用；

-‘++’與胍那芐的細(xì)胞保護(hù)作用相似；

-‘+++’高于胍那芐的細(xì)胞保護(hù)作用。

表1總結(jié)了本發(fā)明的不同化合物與胍那芐相比在產(chǎn)生應(yīng)激之后對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用的結(jié)果，其中應(yīng)激是通過暴露于衣霉素6h誘導(dǎo)產(chǎn)生的。

1.4-非應(yīng)激細(xì)胞中翻譯速度的評(píng)估

每個(gè)實(shí)驗(yàn)之前24h，HeLa細(xì)胞(100,000細(xì)胞/ml)鋪于6孔板，然后不處理，或用化合物(50μM)治療2.5h、5h和9h。添加化合物30分鐘前，培養(yǎng)基替換為無蛋氨酸DMEM培養(yǎng)基(英杰公司)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)前一小時(shí)，將50μM的 AHA(L型疊氮高丙氨酸L-azidohomoalanine)(英杰公司)添加到培養(yǎng)基中，從而標(biāo)記新合成的蛋白質(zhì)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束時(shí)，用冰PBS洗細(xì)胞，并通過胰蛋白酶分解劑(Lonza公司)得到蛋白質(zhì)，然后細(xì)胞溶解于50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液中，該緩沖液中含有1％SDS(Sigma公司)、蛋白酶個(gè)磷酸酶抑制劑(Sigma公司)。使用蛋白質(zhì)反應(yīng)緩沖試劑盒(英杰公司)將蛋白質(zhì)樣品耦合到炔生物素(英杰公司)。樣品在70℃條件下變性10分鐘，在ECL4-20％預(yù)制凝膠(通用電氣醫(yī)療集團(tuán))上分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(通用電氣醫(yī)療集團(tuán))。使用鏈霉親和素-HRP(Gentex公司)檢測耦合到 AHA的炔生物素，其中 AHA插入到新和成的蛋白質(zhì)。蛋白印跡試劑ECL Prime(通用電氣醫(yī)療集團(tuán))孵化來完成顯示，使用Fusion Solo 3S(凝膠成像儀)通過化學(xué)發(fā)光來讀取結(jié)果。

1.5-應(yīng)激細(xì)胞中翻譯速度的評(píng)估

除了衣霉素(5μg/ml)與化合物一起添加之外，處理方法與非應(yīng)激細(xì)胞中翻譯的測定是一樣的。

1.6-對(duì)腎上腺素α2A受體的GPCR功能測定(CellKey檢測方法)

在內(nèi)部表達(dá)人類α2A受體的CHO細(xì)胞上評(píng)估化合物的激動(dòng)劑活性，并使用CellKey檢測方法，通過測定其對(duì)阻抗調(diào)制的影響來測定其活性。

細(xì)胞接種到96孔板，6x10⁴細(xì)胞/孔，在HBSS緩沖液(英杰公司)+具有0.1％BSA的20mM HEPES(英杰公司)中，開始實(shí)驗(yàn)前，允許在28℃條件下平衡60min。將板放置到系統(tǒng)中在28℃的溫度下測量。使用綜合流體系統(tǒng)將溶液同時(shí)添加到所有的96孔：HBSS(基礎(chǔ)對(duì)照組)，100nM參考激動(dòng)劑(刺激對(duì)照組)，參考激動(dòng)劑(EC50測定)或供試化合物。添加配體10分鐘后檢測生物電阻抗。標(biāo)準(zhǔn)的參考激動(dòng)劑是腎上腺素，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中其在幾個(gè)不同濃度下測試，得到濃度響應(yīng)曲線，從該曲線圖計(jì)算其EC₅₀值。

使用Hill軟件分析供試化合物的劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)，對(duì)平均重復(fù)值產(chǎn)生的濃度響應(yīng)曲線進(jìn)行非線性回歸分析，使用Hill方程曲線擬合。結(jié)果列在表1中，EC_s0＞33.3μM的化合物被認(rèn)為不具有顯著的α-2腎上腺素活性。

1.7-體外多發(fā)性硬化疾病模型：與神經(jīng)元共培養(yǎng)的干擾素-γ損傷的大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞

與神經(jīng)元共培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

神經(jīng)元/OPC的培養(yǎng)是按照楊等(2005年，《神經(jīng)科學(xué)方法雜志》，149卷，1期，50-56頁)之前描述的方法進(jìn)行，具有改進(jìn)。簡單來說，移除17天大的大鼠胚胎(Wistar，Janvier實(shí)驗(yàn)室)的全腦(不帶小腦)。在37℃條件下，用胰蛋白酶-EDTA(PanBiotech公司)溶液處理全腦20min，其中胰蛋白酶-EDTA溶液的最終濃度為0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA。添加杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和4.5g/L的葡萄糖來終止解離，其中DMEM中含有II級(jí)DNAse I(最終濃度為0.5mg/ml；Pan Biotech公司，批次：h140508)和10％胎牛血清(FCS；英杰公司，批號(hào)：41Q7218K)。通過10ml移液管的尖端吹吸3次以機(jī)械分離細(xì)胞。然后將細(xì)胞在4℃下以515g離心10分鐘。棄去上清液，將濾餅重懸于特定的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組成如下：神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基(英杰公司，批號(hào)：1636133)、2％B27補(bǔ)充液(英杰公司，批號(hào)：1660670)、2mmol/LL-谷氨酰胺(Pan Biotech公司)、2％PS溶液、1％FCS和10ng/ml血小板衍生生長因子(PDGF-AA，批號(hào)：H131205)。將細(xì)胞以20000細(xì)胞/孔的密度接種在預(yù)涂覆了PLL(BD康寧公司，批號(hào)：6614022)和昆布氨酸(Sigma公司，批號(hào)：083M4034V)的96孔板中，在37℃，空氣(95％)-CO₂(5％)的氣氛中，將板保持在加濕培養(yǎng)箱中。每2天用新鮮的培養(yǎng)基更換一半培養(yǎng)基。在第18天，在干擾素-γ(70U/ml，48H，R&D系統(tǒng)，批號(hào)：AAL2214081)施用前預(yù)培養(yǎng)供試化合物1小時(shí)。

供試化合物和干擾素-γ暴露

在培養(yǎng)的第18天，將供試化合物(4種濃度)溶于培養(yǎng)基中，然后在施用干擾素-γ(70U/ml，48H)前，用與神經(jīng)元共培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)。供試化合物培養(yǎng)孵化1小時(shí)后，在供試化合物存在的情況下，以70U/ml速度添加干擾素-γ，48H。然后，用冷乙醇(95％，Sigma公司，批號(hào)：SZBD3080V)和乙酸(5％，Sigma公司，批號(hào)：SZBD1760V)溶液在-20℃下將細(xì)胞固定5分鐘。用0.1％皂苷(Sigma公司，批號(hào)：BCBJ8417V)透化后，在室溫下，使用小鼠產(chǎn)生的單克隆抗O4抗體(Sigma公司，批號(hào)：SLBF5997V)培養(yǎng)細(xì)胞2小時(shí)，其中該抗體以1/1000稀釋于含有1％FCS，0.1％皂苷的PBS(PAN公司，批號(hào)：8410813)中。在室溫下，該抗體用以1/400稀釋于含有1％FCS，0.1％皂苷的PBS中的Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG(Invitrogen，批號(hào)：1664729)處理1小時(shí)來顯示結(jié)果。

O4細(xì)胞總數(shù)的分析

對(duì)于每種條件，使用20x放大倍數(shù)的ImageXpress(分子器件)，每孔取30張照片。在相同的條件下拍攝所有圖像。使用自定義模塊編輯器(分子器件)自動(dòng)進(jìn)行O4細(xì)胞總數(shù)的分析。數(shù)據(jù)以控制條件的百分比表示(無中毒，無γ-干擾素＝100％)，從而表示γ-干擾素?fù)p傷。所有的值都表示為平均值+/-SEM(標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值)(每種條件n＝6孔)。

1.8-體外帕金森氏病模型：魚藤酮損傷原代中腦大鼠神經(jīng)元

中腦多巴胺能神經(jīng)元的培養(yǎng)

大鼠多巴胺能神經(jīng)元是按照Schinelli等人(1988年，《神經(jīng)化學(xué)期刊》，50卷，1900-1907頁)和Visanji等人(2008年，《美國實(shí)驗(yàn)生物學(xué)聯(lián)合會(huì)會(huì)刊》，22卷，7期，2488-2497頁)所述方法培養(yǎng)。簡單來說，在顯微鏡下切下從15日齡大鼠胚胎(Janvier實(shí)驗(yàn)室，法國)獲得的中腦。除去胚胎中腦并置于含有2％青霉素-鏈霉素(PS，Pan Biotech公司，批號(hào)：1451013)和1％牛血清白蛋白(BSA，Pan Biotech公司，批次：h140603)的冰冷的萊博維茨媒介(L15，Pan Biotech公司，批次：9310614)。中腦彎曲的腹側(cè)部分，即發(fā)育中的大腦中富含多巴胺能神經(jīng)元的區(qū)域，用于細(xì)胞制備。

在37℃下，通過胰蛋白酶作用20min(胰蛋白酶0.05％，EDTA 0.02％，PanBiotech公司，批號(hào)：5890314)解離中腦。添加含有II級(jí)DNAse I(0.1mg/ml，PanBiotech公司，批號(hào)：H140508)和10％胎牛血清(FCS，Gibco公司，批號(hào)：41Q7218K)的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEMPanBiotech公司，批號(hào)：1300714)來終止解離。然后通過10ml移液管進(jìn)行3次吹吸使細(xì)胞機(jī)械分離。然后在+4℃下，將細(xì)胞在L15培養(yǎng)基中的BSA層(3.5％)上以180×g離心10min。棄去上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于特定的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由以下成分組成：神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(英杰公司，批號(hào)：1636133)，添加有B27(2％，英杰公司，批號(hào)：1660670)，L-谷氨酰胺(2mM，PanBiotech公司，批號(hào)：8150713)、2％的PS溶液、10ng/ml腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF，PanBiotech公司，批號(hào)：H140108)和1ng/ml膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF，Pan Biotech公司，批號(hào)：H130917)。使用臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)在諾伊博爾式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)存活細(xì)胞。將細(xì)胞以40000細(xì)胞/孔的密度接種在用聚-L-賴氨酸(Coming Biocoat，批號(hào)：6614022)預(yù)涂的96孔板中，在37℃，5％CO₂/95％空氣氣氛中，保持在潮濕的培養(yǎng)箱中。每2天用新鮮的培養(yǎng)基更換一半培養(yǎng)基。

在培養(yǎng)的第6天，除去培養(yǎng)基并加入新鮮的培養(yǎng)基，在對(duì)照培養(yǎng)基中，不用或用魚藤酮(Sigma公司，批號(hào)：021M2227V)以10nM稀釋，每個(gè)條件評(píng)估3個(gè)孔。供試化合物溶于培養(yǎng)基中，然后在施用魚藤酮前用中腦神經(jīng)元預(yù)培養(yǎng)1h。

中毒24小時(shí)后，在室溫下，pH＝7.3的條件下，用含有4％多聚甲醛(Sigma公司，批號(hào)：SLBF7274V)的PBS(Pan Biotech，Batch：4831114)溶液固定細(xì)胞20min。將細(xì)胞在PBS中再次洗滌兩次，然后透化，并用含有0.1％皂苷(Sigma公司，批號(hào)：BCBJ8417V)和1％FCS的PBS溶液阻斷非特異性位點(diǎn)15分鐘。然后，用小鼠中產(chǎn)生的單克隆抗酪氨酸羥化酶抗體(TH，Sigma公司，批號(hào)：101M4796)在室溫下培養(yǎng)細(xì)胞2h，其中該抗體以1/10000稀釋于含有1％FCS，0.1％皂苷的PBS溶液中。在室溫下，該抗體用以1/800稀釋于含有1％FCS，0.1％皂苷的PBS中的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(Invitrogen，批號(hào)：1664729)處理1h來顯示結(jié)果。

TH陽性神經(jīng)元總數(shù)的分析

用ImageXpress(美國分子器件)自動(dòng)檢測標(biāo)記的培養(yǎng)物。對(duì)于每種條件，從3個(gè)孔中分析每孔20個(gè)自動(dòng)域(代表孔總表面的大約80％)。使用自定義模塊編輯器(美國分子器件)自動(dòng)分析TH神經(jīng)元的總數(shù)。數(shù)據(jù)以控制條件的百分比表示(無中毒，無魚藤酮＝100％)，從而表示魚藤酮損傷。每個(gè)培養(yǎng)物的所有值都表示為平均值+/-SEM(標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值)(每種條件n＝3孔)。

1.9-體外阿爾茨海默病模型：β-淀粉樣蛋白1-42損傷的原代皮層大鼠神經(jīng)元

大鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)

大鼠皮層神經(jīng)元是按照Singer等人(1999年，《神經(jīng)科學(xué)期刊》，19卷，2455-2463頁)和Callizot等人(2013年，《神經(jīng)科學(xué)研究雜志》，91卷，706-716頁)所述方法培養(yǎng)。

懷孕的雌鼠(Wistar，Janvier實(shí)驗(yàn)室)在妊娠第15天通過頸椎脫臼被殺死。收集胎兒并立即置于含有2％青霉素(10,000U/ml)、鏈霉素(10mg/1ml)溶液(PS；Pan Biotech公司，批號(hào)：1451013)和1％牛血清白蛋白(BSA；Pan Biotech公司，批次：h140603)的冰冷的L15萊博維茨培養(yǎng)基(Pan Biotech公司，批號(hào)：9310614)中。在37℃下，用胰蛋白酶-EDTA(Pan Biotech公司，批號(hào)：5890314)溶液處理皮質(zhì)20min，最終濃度為0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA。通過添加杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和4.5g/升的葡萄糖(Pan Biotech公司，批號(hào)：1300714)來終止解離，其中DMEM含有II級(jí)DNAse I(最終濃度為0.5mg/ml；Pan Biotech公司，批號(hào)：h140508)和10％胎牛血清(FCS；英杰公司，批次：41Q7218K)。通過10ml移液管的尖端吹吸3次以機(jī)械分離細(xì)胞。然后在4℃下將細(xì)胞以515g離心10min。棄去上清液，將濾餅重懸于特定的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基組成如下：具有2％B27補(bǔ)充液(英杰公司，批號(hào)：1660670)的神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基(英杰公司，批號(hào)：1636133)、2mmol/L的L-谷氨酰胺(Pan Biotech公司，批量：8150713)、2％的PS溶液和10ng/ml腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF；Pan Biotech公司，批號(hào)：H140108)。使用臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)在諾伊博爾式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)存活細(xì)胞。將細(xì)胞以30000細(xì)胞/孔的密度接種在用聚-L-賴氨酸(Corning Biocoat，批號(hào)：6614022)預(yù)涂的96孔板中，在37℃，空氣(95％)-(5％)CO₂氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換一次培養(yǎng)基。在培養(yǎng)11天后，用A-β溶液(見下文)使皮質(zhì)神經(jīng)元中毒。

供試化合物和β-淀粉樣蛋白1-42暴露

按照Callizot等人2013年描述的方法制備β-淀粉樣蛋白1-42。簡單來說，將β-淀粉樣蛋白1-42肽(巴亨公司，批號(hào)：1014012)溶于上述特定的培養(yǎng)基中，不含血清，初始濃度為40μ mol/L。在37℃下，在黑暗條件下攪拌該溶液3天，并在培養(yǎng)基中適當(dāng)稀釋至所用濃度后立即使用。

將供試化合物溶解在培養(yǎng)基中，然后在施用β-淀粉樣蛋白1-42前，用原代皮層神經(jīng)元預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)。在藥物存在的條件下，將β-淀粉樣蛋白1-42制劑加入在對(duì)照培養(yǎng)基，稀釋至最終濃度為20μM(包括大約2μM的有毒低聚物，通過WB測量)。中毒24小時(shí)后，用冷的乙醇(95％，Sigma公司，批號(hào)：SZBD3080V)和乙酸(5％，Sigma公司，批號(hào)：SZBD1760V)溶液，在-20℃下將細(xì)胞固定5分鐘。用0.1％皂苷(Sigma公司，批號(hào)：BCBJ8417V)透化后，使用小鼠單克隆抗體抗微管相關(guān)蛋白2(MAP-2；Sigma公司，批號(hào)：063M4802)培養(yǎng)細(xì)胞2h，其中該抗體蛋白2以1/400稀釋于含有1％胎牛血清(Invitrogen公司，批號(hào)：41Q7218K)和0.1％的皂苷的PBS(Pan biotech公司，批號(hào)：4831114)中。在室溫下，該抗體用1/400稀釋于含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的PBS中的AlexaFluor 488山羊抗小鼠IgG(分子探針公司，批號(hào)：1572559)中處理1h來顯示結(jié)果。

神經(jīng)元總數(shù)的分析

用ImageXpress(美國分子器件)，以×20放大率自動(dòng)檢查標(biāo)記的培養(yǎng)物。對(duì)于每種條件，從3個(gè)孔中分析每孔30個(gè)自動(dòng)域(代表孔總表面的大約80％)。使用自定義模塊編輯器(美國分子器件)自動(dòng)分析神經(jīng)元的總數(shù)。數(shù)據(jù)以控制條件的百分比表示(無中毒，無β-淀粉樣蛋白1-42＝100％)，從而表示β-淀粉樣蛋白1-42損傷。所有的值都表示為平均值+/-SEM(標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值)(每個(gè)培養(yǎng)的每種條件n＝3孔)。

1.10-腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(PMD)的體外模型：在人細(xì)胞系中突變PLP1和DM20的過度表達(dá)

轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞以300,000細(xì)胞/mL的濃度接種到板上，根據(jù)制造商的方法，使用脂質(zhì)體2000，用PLP1和DM20突變體構(gòu)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞用分子處理或不處理。作為對(duì)照，用天然形式的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48h后，得到細(xì)胞溶解產(chǎn)物。通過蛋白質(zhì)印跡法評(píng)估蛋白質(zhì)積累。

1.11-2型糖尿病的體外模型：Min6和INS1細(xì)胞系

針對(duì)ER應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)

在治療前一天將細(xì)胞接種在96孔板中，Min6細(xì)胞系的密度為0.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL，INS1細(xì)胞系的密度為0.4×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL。

通過添加2.5μg/mL的衣霉素(西格瑪奧德里奇集團(tuán))和磷酸酶抑制劑引發(fā)ER應(yīng)激。

6小時(shí)后用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，通過加入磷酸酶抑制劑維持細(xì)胞保護(hù)作用。

在衣霉素處理72小時(shí)后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Sigma公司)按照供應(yīng)商的建議方法，測量WST-8到甲臌中的減少來評(píng)估細(xì)胞存活率。

保護(hù)細(xì)胞免于容易出現(xiàn)胰島素^Akita錯(cuò)誤折疊的積累

用胰島素^Akita突變結(jié)構(gòu)核轉(zhuǎn)染Min6細(xì)胞，并以300,000個(gè)細(xì)胞/mL的濃度接種在96孔板中，24小時(shí)后，細(xì)胞用分子處理或不處理。作為對(duì)照，用非相關(guān)質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染細(xì)胞。6天后，加入選擇劑(G418)。

處理9天后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Sigma公司)按照供應(yīng)商的建議方法，測量WST-8到甲臌中的減少來評(píng)估細(xì)胞存活率。

1.12-體外炎癥/感染疾病模型：聚I：C誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)方案

用聚I：C對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，并用兩種濃度的本發(fā)明化合物(25μM)處理6小時(shí)。培養(yǎng)6小時(shí)后，通過免疫印跡法(西方墨點(diǎn)法)監(jiān)測eIF2α磷酸化(eIF2a-P)和PPP1R15A(GADD34)的表達(dá)，同時(shí)通過ELISA在培養(yǎng)物的上清液中定量檢測I型β-干擾素(IFN)的產(chǎn)生。對(duì)照組(nt)和聚I：C/DMSO分別是陰性和陽性對(duì)照。

聚I：C(聚肌苷酸：聚胞苷酸或聚肌苷酸-聚胞苷酸鈉鹽)是用于模擬病毒感染的免疫刺激劑。在結(jié)構(gòu)上，聚I：C類似于雙鏈RNA，已知的是聚I：C與toll樣受體3相互作用，該受體為B細(xì)胞和樹突細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中表達(dá)的。

細(xì)胞培養(yǎng)

MEFs培養(yǎng)在DMEM、10％FCS(胎牛血清，Perbio公司)、100單位/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素、2mM谷氨酰胺、1×MEM非必需氨基酸和50μM 2-巰基乙醇中。用10μg/ml聚I：C(InvivoGen公司)和脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑(英杰公司)處理MEFs，處理時(shí)間依照指示。

免疫印跡

細(xì)胞溶解于1％的曲通X-100、50mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸、10mM NaCl、2.5mM MgCl₂、2mMEDTA、10％的甘油并補(bǔ)充有完全微型蛋白酶抑制劑混合物片劑(瑞士羅氏)。使用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce公司)進(jìn)行蛋白定量測定。在免疫印跡和化學(xué)發(fā)光檢測(化學(xué)發(fā)光底物，Pierce)之前，將25-50μg的曲通X-100可溶性材料裝載在2％-12％梯度或8％的SDS-PAGE。識(shí)別GADD34(C-19)的兔多克隆抗體來自圣克魯斯生物技術(shù)，抗eIF2α[pS⁵²]來自英杰公司。

酶聯(lián)免疫吸附檢測(Elisa)

使用鼠標(biāo)干擾素β酶聯(lián)免疫試劑盒(PBL干擾素源)，根據(jù)制造商的說明書，進(jìn)行培養(yǎng)上清液中IFN-β的定量測定。

1.13-在培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

細(xì)胞培養(yǎng)

從1日齡Sprague Dawley大鼠(法國維耶)的心室獲得新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)。大鼠安樂死，并切除其心臟。心臟切成小塊(1-2mm³)，并使用新生大鼠心離解試劑盒和gentleMACS^TM分離器(MiltenyiBiotec公司，德國)進(jìn)行酶降解。解離后，過濾(70μm)勻漿物，得到單細(xì)胞懸浮液。分離的細(xì)胞被離心收集，并重新懸浮于含有10％馬血清(HS)，5％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/鏈霉素的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)。通過預(yù)涂肌細(xì)胞90min來豐富培養(yǎng)基，從而消耗非心肌細(xì)胞的數(shù)量。非附著的細(xì)胞以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度接種到6-或96-孔板。在37℃條件下，95％空氣/5％CO₂的氛圍中，培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。然后，在正?；虻脱?N₂/CO₂，95％/5％，0.3％O₂)的培養(yǎng)室中培養(yǎng)前30分，用含有1％FBS和不同濃度的測試化合物的新鮮的DMEM培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。

用供試化合物治療

純化的新生大鼠心肌細(xì)胞以10⁶細(xì)胞/2mL的濃度接種在96孔板中用于流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)。

24小時(shí)后，在0.1％的DMSO的培養(yǎng)基中用不同濃度的供試化合物處理心肌細(xì)胞。用培養(yǎng)基(0.1％DMSO)處理陽性對(duì)照細(xì)胞。治療開始三十分鐘后，將細(xì)胞在低氧培養(yǎng)室(N₂/CO₂，95％/5％；的最終測得O₂：0.3％)下培養(yǎng)36小時(shí)。

陰性對(duì)照細(xì)胞在含氧量正常的條件下，在37℃下，用培養(yǎng)基(1％FBS，0.1％DMSO)培養(yǎng)同樣的時(shí)間。

凋亡細(xì)胞測量

在治療期結(jié)束時(shí)，使用流式細(xì)胞儀測量凋亡細(xì)胞的數(shù)量。使用德國美天妮的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并再懸浮于結(jié)合緩沖液中。根據(jù)制造商的說明，添加FITC-膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠。在室溫下混合物在黑暗中培養(yǎng)15分鐘，然后通過FACS掃描流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光。

2-結(jié)果

2.1-細(xì)胞保護(hù)作用和化合物選擇性

使用本發(fā)明的所選擇化合物進(jìn)行的不同試驗(yàn)的結(jié)果下表1中示出。

例如，圖1代表暴露于衣霉素中引起的應(yīng)激后化合物1的細(xì)胞保護(hù)作用。

表1：

2.2-多發(fā)性硬化癥

圖2示出了本發(fā)明化合物11、12和17對(duì)干擾素-γ損傷的大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的劑量依賴性保護(hù)。

這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的這些化合物是很有前途的有效治療多發(fā)性硬化癥的化合物。

2.3-帕金森氏癥(PD)

圖3示出了本發(fā)明的化合物5、11和12對(duì)魚藤酮損傷的大鼠原代神經(jīng)元的劑量依賴性保護(hù)。

這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的這些化合物是很有前途的有效治療共核蛋白病的化合物，尤其是治療帕金森氏病。

2.4-阿爾茨海默氏病(AD)和淀粉樣變性

圖4示出了本發(fā)明的化合物12對(duì)β-淀粉樣蛋白1-42損傷的大鼠原代皮層神經(jīng)元的劑量依賴性保護(hù)。

這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的這些化合物是很有前途的有效治療淀粉樣變性的化合物，尤其是治療阿爾茨海默氏病。

2.5-腦白質(zhì)營養(yǎng)不良：佩利措伊斯-梅茨巴赫病(PMD)

已經(jīng)有報(bào)道稱PLP1和DM20蛋白質(zhì)中T181P和L223P突變會(huì)引起佩利措伊斯-梅茨巴赫病的嚴(yán)重表型(Strautnieks等，1992年，《美國人類遺傳學(xué)雜志》，51卷，4期，871-878頁；Gow和Lazzarini等，1996年，《自然遺傳》，13卷，4期，422-428頁)。

本發(fā)明的化合物12和17(5μM)能夠預(yù)防在人293T細(xì)胞中表達(dá)的T181P突變DM20蛋白的積累(圖5)。

這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的化合物，尤其是化合物12和17，是很有前途的有效治療脫髓鞘疾病的化合物，如治療腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，尤其是治療PMD。

2.6-2型糖尿病

圖6表示用本發(fā)明化合物16治療Min6細(xì)胞中帶有Akita突變的前胰島素原的過度表達(dá)的結(jié)果。

不同濃度的化合物12、16和17能預(yù)防與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)累積有關(guān)的Min6胰島瘤細(xì)胞死亡(圖7)，其中錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)累積是通過暴露于衣霉素6小時(shí)誘導(dǎo)的。

不同濃度的化合物11、12、16和17能預(yù)防與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)累積有關(guān)的INS1胰島瘤細(xì)胞死亡(圖8)，其中錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)累積是由暴露于衣霉素6小時(shí)誘導(dǎo)的。

這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的化合物是很有前途的有效治療前驅(qū)糖尿病和糖尿病的化合物，優(yōu)選治療2型前驅(qū)糖尿病和2型糖尿病。

2.7-與感染相關(guān)或非感染性炎性狀況

MEFs對(duì)聚I：C的正常響應(yīng)的特征在于PPP1R15A表達(dá)、PKR活化介導(dǎo)的eIF2α-P的增加(在時(shí)間上是可變的，與PPP1R15A表達(dá)水平相關(guān))，以及I型干擾素的產(chǎn)生(范圍500-700pg/ml)。敲除PPP1R15A-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞不能響應(yīng)聚I：C產(chǎn)生這種細(xì)胞因子。

本發(fā)明的化合物抑制PPP1R15A的效力是通過測量eIF2α的磷酸化作用的增加和PPP1R15A表達(dá)的減少來評(píng)估的，由于其自身的藥物抑制PPP1R15A的表達(dá)減少，導(dǎo)致一般蛋白質(zhì)合成的抑制作用和I型干擾素產(chǎn)生。

評(píng)估發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物在25μM時(shí)能有效增加eIF2α的磷酸化作用，減少PPP1R15A的表達(dá)，并防止I型干擾素的產(chǎn)生。例如，圖9表示化合物6、10、11、12、15、16和17(25μM)預(yù)防聚I：C脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的鼠胚胎成纖維細(xì)胞生成I型IFN的能力。

這些數(shù)據(jù)表示本發(fā)明的化合物對(duì)于有效治療與感染相關(guān)或非感染性炎性狀況是很有前途的。

2.8-心肌缺血

本發(fā)明的化合物10保護(hù)培養(yǎng)的新生鼠心肌細(xì)胞使其不會(huì)出現(xiàn)因缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖10)。這些數(shù)據(jù)表示本發(fā)明的化合物對(duì)于有效治療局部缺血是很有前途的，尤其是治療心肌缺血。

本發(fā)明的各種修改和變化在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行描述，應(yīng)該理解本發(fā)明要求保護(hù)的范圍不能過于局限于這些具體實(shí)施例。實(shí)際上，用于實(shí)施本發(fā)明的所述方式的各種修改對(duì)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。