本發(fā)明涉及微生物技術領域，更具體地，涉及一種產γ-氨基丁酸的戊糖乳桿菌。
背景技術：
γ-氨基丁酸（GABA）有許多重要的生理功能，如抗焦慮、降血壓、降血糖、改善睡眠、修復皮膚（抑制炎癥，刺激表皮細胞再生）、調節(jié)激素等。現(xiàn)階段隨著對GABA生理和藥理功能的不斷研究和開發(fā)，已經作為一種新型的功能性因子應用于食品和藥品等行業(yè)中。
在早期，富集生產γ-氨基丁酸主要以化學合成、植物富集和通過大腸桿菌發(fā)酵為主，但存在著安全性差，成本高，環(huán)境污染嚴重，富集含量低和食用安全性等問題，所以尋找可利用的食用級安全性菌株在微生物法富集γ-氨基丁酸方面具有潛在的意義和價值。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷，提供一種產γ-氨基丁酸的戊糖乳桿菌。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的：
一種產γ-氨基丁酸的戊糖乳桿菌SS6，所述戊糖乳桿菌SS6保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址是廣東省微生物研究所（廣州市先烈中路中路100號大院59號樓5樓），保藏日期為2016年10月13日，保藏編號為GDMCC No：60086。
本發(fā)明戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）SS6的16s rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示，通過16S rDNA序列比對分析，與序列號為JN415155.1的戊糖乳桿菌PIS23菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似性為99%，通過結合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結果確定戊糖乳桿菌SS6屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），為戊糖乳桿菌亞種（Lactobacillus pentosus）。
所述戊糖乳桿菌SS6為革蘭氏陽性菌，桿狀，無鞭毛，無菌膜，無莢膜；長1.5～3.0μm，寬0.7～0.8μm，菌落呈圓形，顏色為乳白色，表面光滑不透明，邊緣整齊。
戊糖乳桿菌SS6為厭氧菌，接觸酶試驗呈陰性，氧化酶試驗呈陰性，明膠液化試驗呈陰性，硫化氫試驗呈陰性，吲哚試驗呈陰性，酪素水解試驗呈陰性，精氨酸產氨試驗呈陰性，脲酶試驗呈陰性，七葉苷水解試驗呈陽性。
戊糖乳桿菌SS6可在MRS培養(yǎng)基上生長，其最適生長溫度為35℃，最適生長環(huán)境的pH值為5.8～6.5。
本發(fā)明所述戊糖乳桿菌SS6能發(fā)酵桑葉粉轉化生產γ-氨基丁酸，試驗結果表明添加戊糖乳桿菌SS6對桑葉粉進行發(fā)酵的γ-氨基丁酸產量是空白桑葉粉對照組的387.5%，為開發(fā)富含γ-氨基丁酸的食品提供依據。
本發(fā)明還提供含有所述戊糖乳桿菌SS6的微生物制劑。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明提供了一種產γ-氨基丁酸的戊糖乳桿菌SS6，所述戊糖乳桿菌SS6保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址是廣東省微生物研究所（廣州市先烈中路中路100號大院59號樓5樓），保藏日期為2016年10月13日，保藏編號為GDMCC No：60086；戊糖乳桿菌SS6發(fā)酵產γ-氨基丁酸的產量達3.09mg/mL，具有較高的產γ-氨基丁酸的能力，為開發(fā)新型的富含γ氨基丁酸的食品提供了基礎。
附圖說明
圖1為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）SS6和相近菌株的16s rDNA序列進行同源性比對構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實施方式
下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
乳酸菌分離培養(yǎng)基（1000mL）由10g酵母膏、10g牛肉膏、10g蛋白胨、5g葡萄糖、1ml吐溫-80、20g碳酸鈣、200g西紅柿汁、0.1g溴甲酚綠、15g瓊脂粉和余量的蒸餾水組成，調節(jié)pH至5.8～6.5，于121℃高壓滅菌30min。
MRS培養(yǎng)基（1000mL）由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸氫二銨[(NH4)2HC6H5O7]、20g葡萄糖、1mL吐溫-80、5g乙酸鈉（CH3COONa-3H2O）、2g磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、0.58g硫酸鎂（MgSO4.7H2O）、0.25g硫酸鎂（MnSO4·H2O）、15g瓊脂粉和余量的蒸餾水組成，調節(jié)pH至5.8～6.5，于121℃高壓滅菌30min。
MRS液體培養(yǎng)基（1000mL）由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸氫二銨[(NH4)2HC6H5O7]、20g葡萄糖、1mL吐溫-80、5g乙酸鈉（CH3COONa-3H2O）、2g磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、0.58g硫酸鎂（MgSO4.7H2O）、0.25g硫酸鎂（MnSO4·H2O）和余量的蒸餾水組成，調節(jié)pH至5.8～6.5，于121℃高壓滅菌30min。
發(fā)酵培養(yǎng)基TYG（1000mL）由5g酵母提取物、5g胰蛋白胨、10g葡萄糖、5g丁二酸鈉、20mg L-Glu和余量的蒸餾水組成，調節(jié)pH至5.8～6.5，于121℃高壓滅菌30min。
實施例1 菌株的分離、篩選與鑒定
菌株分離：選取健康生長桑樹上的成熟桑葚果實，于無菌超凈臺內用無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分，切成1cm小片段置于研砵研磨出汁，吸取100μL果汁于MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，待液體培養(yǎng)基變得渾濁按梯度稀釋法稀釋菌液，吸取稀釋度為10-5和10-6的菌體稀釋液100μL于乳酸菌分離培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3d，待乳酸菌分離培養(yǎng)基中長出菌落（出現(xiàn)圓形乳白或黃色菌落），周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步確定為菌株SS6，挑取變色圈最大的菌落于MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。
對篩選得到的菌株SS6進行分子鑒定，委托生工生物工程(上海)股份有限公司對篩選得到的SS6的16S rDNA進行測序。
菌株SS6的16S rDNA序列長度為1472bp，其序列如SEQ ID NO：1所示，將測序結果與GenBank中的16S rDNA序列進行同源性比對，然后用軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖1所示），以確定菌株的種屬關系。同源性分析結果表明，該序列與序列號為JN415155.1的戊糖乳桿菌PIS23菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似性為99%，通過委托廣東省微生物分析檢測中心結合菌體形態(tài)、生長條件、生理生化鑒定結果確定菌株SS6屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）亞種，因此稱為戊糖乳桿菌SS6。
菌株菌落形態(tài)鑒定：戊糖乳桿菌SS6為革蘭氏陽性菌，桿狀，無鞭毛，無莢膜；在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為乳白色，表面光滑不透明，邊緣整齊。
參照《伯杰細菌鑒定手冊》第九版和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠主編 科學出版社）對戊糖乳桿菌SS6進行生理生化鑒定：戊糖乳桿菌SS6為厭氧菌，接觸酶試驗呈陰性，氧化酶試驗呈陰性，明膠液化試驗呈陰性，硫化氫試驗呈陰性，吲哚試驗呈陰性，酪素水解試驗呈陰性，精氨酸產氨試驗呈陰性，脲酶試驗呈陰性，七葉苷水解試驗呈陽性，結果見表1。
以幼齡斜面培養(yǎng)物穿刺接種于休和利夫森二氏（半固體）培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)72h后觀察。如指示劑變黃，表示產酸，為陽性；不變或變藍（紫）則為陰性，結果如表2。
戊糖乳桿菌SS6可在MRS培養(yǎng)基上生長，其最適生長溫度為35℃，最適生長環(huán)境的pH值為5.8～6.5。
戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）SS6，保藏在廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），保藏地址是廣東省微生物研究所，廣州市先烈中路中路100號大院59號樓5樓，保藏日期為2016年10月13日，保藏編號為GDMCC No：60086。
實施例2 菌株的培養(yǎng)
1、戊糖乳桿菌SS6的活化：在超凈工作臺中無菌操作，用接種環(huán)挑取戊糖乳桿菌SS6，在平板培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）上用接種環(huán)劃線，在30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2d。
2、戊糖乳桿菌SS6發(fā)酵樣品的制備：將分離得到的戊糖乳桿菌SS6接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基TYG中，30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2d，將發(fā)酵混合物沸水浴10min，以10000r/min離心10min，取上層液體即得發(fā)酵液。
3、γ-氨基丁酸標準曲線的繪制：分別取1.0mL蒸餾水、濃度為1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的γ-氨基丁酸的標準樣品溶液，加入120μL 1mol/L LaCL3溶液，混勻震蕩反應15min，12 000 r/min離心5 min，取上清0.5 mL于1.5mL離心管中，加入300 μL 1mol/L的KOH，振蕩反應5 min，12 000 r/min離心5 min。分別取上清液600 μL置于15mL具塞試管中，加pH 10.0的碳酸鹽緩沖液400 μL，60%的重蒸酚200 μL，混勻后再加入1mL 7.5% NaClO溶液，充分混勻。靜置3 min，于沸水浴中加熱10 min，后置冰浴中10 min，待溶液出現(xiàn)藍綠色后，加入4.0 mL 60%乙醇溶液，以0號管為對照，于645 nm波長處測吸光值。以吸光值為縱坐標，GABA濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。
4、取1mL待測戊糖乳桿菌SS6的發(fā)酵液，按上述步驟加入試劑后測定波長645nm處的吸光值，作3個重復，根據標準曲線計算樣品γ-氨基丁酸的含量。
試驗結果表明：戊糖乳桿菌SS6發(fā)酵產γ-氨基丁酸的產量達3.09mg/mL，具有較高的產γ-氨基丁酸的能力，為開發(fā)新型的富含γ氨基丁酸的食品提供了依據。
SEQUENCE LISTING
<110> 華南農業(yè)大學
<120> 一種產γ-氨基丁酸的戊糖乳桿菌
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1472
<212> DNA
<213> 戊糖乳桿菌SS6的16S rDNA序列
<400> 1
cccgtggcgg gctgccctat acatgcaagt cgaacgaact ctggtattga ttggtgcttg 60
catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 120
agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 180
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tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc 840
cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 900
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc 1020
cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact 1140
ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg 1260
agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac 1320
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac 1440
cttttaggaa ccagccgcta agtgacagat gg 1472