本發(fā)明涉及一種提高琴葉風(fēng)吹楠DNA提取質(zhì)量的方法，特別是適用于琴葉風(fēng)吹楠DNA提取的方法。屬生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

DNA的提取是滿(mǎn)足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的最重要、最基本的操作，提取高質(zhì)量的DNA對(duì)于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)非常重要。目前，提取DNA的材料為植物各部分組織，但多用幼嫩組織(嫩葉、嫩莖等)，而對(duì)于一些高大樹(shù)種，采集嫩葉相當(dāng)困難；提取方法有CTAB法、SDS法、高鹽低pH法以及試劑盒法等，不同物種根據(jù)實(shí)際情況(內(nèi)含物、組織結(jié)構(gòu)差異等)，在以上幾種方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，以便提取得到高質(zhì)量的DNA^[1-8]。

琴葉風(fēng)吹楠(Horsfieldia pandurifolia)科屬：肉豆蔻科風(fēng)吹楠屬，倒卵狀長(zhǎng)圓形至提琴形，長(zhǎng)16一34厘米，寬6－9.5厘米，先端短漸尖至突尖，基部楔形至寬楔形，兩面無(wú)毛，側(cè)脈9一22對(duì)；葉柄粗壯，長(zhǎng)2.2一3厘米?；▎涡裕菩弁?，圓錐花序腋生，分枝稀疏，長(zhǎng)12一15(一30)厘米，花序軸紫紅色；花小，直徑約2毫米，花被裂片通常個(gè)雄蕊10，合生成球形。果序圓錐狀，長(zhǎng)10一18厘米，通常著果1一3；果卵狀橢圓形，基部下延成柄，長(zhǎng)3－4.5厘米，外面光滑，成熟時(shí)2瓣裂，假種皮鮮紅色，先端微撕裂狀；種子1，頂端具突尖，種皮硬殼質(zhì)。產(chǎn)地：云南。通常為生長(zhǎng)在熱帶雨林溝谷的上層樹(shù)種，成年樹(shù)株高可達(dá)20-30m，采集新鮮葉片非常困難。

至今，很少有琴葉風(fēng)吹楠，甚至肉豆蔻科的關(guān)于分子生物學(xué)研究的報(bào)道，特別是提取琴葉風(fēng)吹楠植物DNA方面更是沒(méi)見(jiàn)報(bào)道，de Wilde^[9]和吳裕^[10]等人分別用分子證據(jù)發(fā)表了關(guān)于風(fēng)吹楠屬、琴葉風(fēng)吹楠分類(lèi)學(xué)問(wèn)題的文章，但文中也沒(méi)有提到關(guān)于肉豆蔻科及琴葉風(fēng)吹楠DNA提取的方法。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于為了克服以上困難，本發(fā)明提供了一種適用于琴葉風(fēng)吹楠采樣及DNA的提取方法，其目的在于解決琴葉風(fēng)吹楠采樣困難，CTAB法、QIAGEN試劑盒法提取不到滿(mǎn)足于分子實(shí)驗(yàn)所需的DNA等問(wèn)題。

本發(fā)明提供一種適用于琴葉風(fēng)吹楠DNA提取的方法，包括選擇的樣品為琴葉風(fēng)吹楠樹(shù)皮，提取的方法為QIAGEN試劑盒改良法，即在QIAGEN試劑盒Buffer AP1提取液中加入1％的PVP(以下簡(jiǎn)稱(chēng)1％PVP-AP1提取液)，在試劑盒提取步驟中的水浴時(shí)間由10min延長(zhǎng)至20min。

所述的樹(shù)皮樣品為嫩枝樹(shù)皮，如果樹(shù)太高不能采到嫩枝，則用刀將主干樹(shù)皮外層干枯木栓層刮除，取新鮮木栓層進(jìn)行硅膠干燥；

所述的1％PVP-AP1提取液配方為：在100ml Buffer AP1提取液中加入1gPVP；

所述的水浴時(shí)間為液氮研磨后加入1％PVP-AP1提取液后，65℃水浴20min；

在以上所述中，優(yōu)選的，如果能采到嫩枝，則要嫩樹(shù)皮；

本發(fā)明野外采樣時(shí)，帶上變色硅膠用于干燥樣品。采樣時(shí)能采到嫩枝則將嫩樹(shù)皮剝離進(jìn)行硅膠干燥，如果樹(shù)太高不能采到嫩枝，則用刀將主干樹(shù)皮外層干枯木栓層刮除，取新鮮木栓層進(jìn)行硅膠干燥。干燥好的樣品用于后續(xù)DNA的提取。

本發(fā)明琴葉風(fēng)吹楠DNA提取的方法具體步驟如下：

1)準(zhǔn)備1％PVP-AP1提取液；

2)將50-70mg硅膠干燥樣品進(jìn)行液氮研磨后，加入400μl 1％PVP-AP1提取液和4μl RNase A，渦旋后65℃水浴20min，中間顛倒混勻2-3次；

3)水浴結(jié)束后加入130μl Buffer P3，混勻后，冰浴5min；

4)14000rpm，離心5min；

5)轉(zhuǎn)移溶液至QIAshredder收集管，14000rpm，離心2min；

6)將收集管中的液體轉(zhuǎn)入一新的離心管，加入1.5倍體積的AW1，槍打勻；

7)轉(zhuǎn)移6中的液體650μl至2ml收集柱，大于8000rpm，離心1min，(如果6中樣品還有剩余，可重復(fù)此步驟)

8)將收集柱轉(zhuǎn)入一新的2ml收集管，加入500μl AW2，大于8000rpm，離心1min，棄收集管中的液體；

9)加入500μl AW2，大于12000rpm，離心2min；

10)將吸附柱放入一新的1.5ml離心管；

11)加入100μl Buffer AE，室溫放置5min-10min，大于8000rpm，離心1min；

12)將吸附柱重新放入一新的1.5ml離心管，重復(fù)步驟11。

本發(fā)明還提供1％PVP-AP1提取液的配制方法，為：在100ml Buffer AP1提取液中加入1gPVP。

本發(fā)明通過(guò)選擇硅膠干燥樹(shù)皮為材料，解決野外采集琴葉風(fēng)吹楠新鮮葉片困難、且用新鮮葉片和落葉提取的DNA得率低、質(zhì)量差的難題；用QIAGEN試劑盒改良法替代了傳統(tǒng)的CTAB提取DNA的方法，解決了琴葉風(fēng)吹楠用CTAB法和QIAGEN試劑盒原來(lái)的方法提取不到滿(mǎn)足于實(shí)驗(yàn)要求的DNA難題，通過(guò)在QIAGEN試劑盒Buffer AP1中加入1％的PVP作為多酚絡(luò)合劑和抗氧化劑，使琴葉風(fēng)吹楠中的多酚不被分離到提取液，延長(zhǎng)水浴時(shí)間使細(xì)胞盡可能多的破壁，細(xì)胞內(nèi)大部分核酸滲出。通過(guò)材料選擇和提取方法改良可以提高所得DNA的質(zhì)量。

本發(fā)明有益效果：可操作的采樣方式簡(jiǎn)便、快速和高質(zhì)量提取琴葉風(fēng)吹楠DNA的方法，對(duì)于需要進(jìn)行琴葉風(fēng)吹楠分子生物學(xué)研究的研究者而言，顯得非常重要。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3提取琴葉風(fēng)吹楠葉片、樹(shù)皮的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。

圖2為實(shí)施例4的電泳圖譜。

圖3為實(shí)施例4的峰圖。

圖4為實(shí)施例4的原始數(shù)據(jù)。

圖5為實(shí)施例4的0/1數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方法

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明將琴葉風(fēng)吹楠的葉片材料換為琴葉風(fēng)吹楠的樹(shù)皮材料進(jìn)行DNA提取，提取方法為QIAGEN試劑盒改良法，即在AP1中加入1％PVP(以下稱(chēng)1％PVP-AP1)，水浴時(shí)間由10min延長(zhǎng)至20min，所述琴葉風(fēng)吹楠的樹(shù)皮材料為野外采樣時(shí)能采到嫩枝，則將嫩樹(shù)皮剝離進(jìn)行硅膠干燥。如果琴葉風(fēng)吹楠樹(shù)太高不能采到嫩枝，則可用刀將琴葉風(fēng)吹楠主干樹(shù)皮外層干枯木栓層刮除，取新鮮木栓層進(jìn)行硅膠干燥；所述的AP1中加入1％PVP為：100ml AP1中加入1gPVP。

發(fā)明人曾分別采用CTAB法、QIAGEN試劑盒法提取琴葉風(fēng)吹楠老樹(shù)皮、嫩樹(shù)皮、老葉、嫩葉的DNA進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，但由于得到的琴葉風(fēng)吹楠DNA得率低、質(zhì)量差，不能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要。為了將琴葉風(fēng)吹楠的分子生物學(xué)研究繼續(xù)進(jìn)行，首先需要解決的問(wèn)題是如何得到高質(zhì)量的DNA，這也是本發(fā)明產(chǎn)生原因。

實(shí)施例1 QIAGEN試劑盒改良法提取琴葉風(fēng)吹楠嫩葉、嫩樹(shù)皮、老葉、老樹(shù)皮DNA

改良方法為：在QIANGEN試劑盒的Buffer AP1提取液中加入1gPVP。水浴時(shí)間延長(zhǎng)至20min。具體步驟如下：

1)準(zhǔn)備1％PVP-AP1提取液；

2)將50-70mg硅膠干燥樣品進(jìn)行液氮研磨后，加入400μl 1％PVP-AP1提取液和4μl RNase A，渦旋后65℃水浴20min，中間顛倒混勻2-3次；

3)水浴結(jié)束后加入130μl Buffer P3，混勻后，冰浴5min；

4)14000rpm，離心5min；

5)轉(zhuǎn)移溶液至QIAshredder收集管，14000rpm，離心2min；

6)將收集管中的液體轉(zhuǎn)入一根新離心管，加入1.5倍體積的AW1，槍打勻；

7)轉(zhuǎn)移步驟6中的液體650μl至2ml收集柱，大于8000rpm，離心1min，(如果步驟6中樣品還有剩余，可重復(fù)此步驟)

8)將收集柱轉(zhuǎn)入一根新的2ml收集管，加入500μl AW2，大于8000rpm，離心1min，棄收集管中的液體；

9)加入500μl AW2，大于12000rpm，離心2min；

10)將吸附柱放入一根新的1.5ml離心管；

11)再加入100μl Buffer AE，室溫放置5min-10min，大于8000rpm，離心1min；

12)將吸附柱重新放入一根新的1.5ml離心管，重復(fù)步驟11。

本發(fā)明通過(guò)選擇琴葉風(fēng)吹楠樹(shù)皮為材料，解決野外采集嫩葉困難及用老樹(shù)葉提取不到適用于實(shí)驗(yàn)要求的DNA的難題，用QIAGEN試劑盒替代了傳統(tǒng)的CTAB提取DNA的方法，解決了琴葉風(fēng)吹楠用CTAB法提取不到滿(mǎn)足于實(shí)驗(yàn)要求的DNA難題，通過(guò)在QIAGEN試劑盒Buffer AP1中加入1％的PVP作為多酚絡(luò)合劑和抗氧化劑，使琴葉風(fēng)吹楠中的多酚不被分離到提取液提取琴葉風(fēng)吹楠DNA改變步驟及藥品，延長(zhǎng)水浴時(shí)間使細(xì)胞盡可能多的破壁，細(xì)胞內(nèi)大部分核酸滲出。

實(shí)施例2 QIAGEN試劑盒提取琴葉風(fēng)吹楠嫩葉、嫩樹(shù)皮、老葉、老樹(shù)皮DNA

2)將50-70mg硅膠干燥樣品進(jìn)行液氮研磨后，加入400μl Buffer AP1提取液和4μl RNase A，渦旋后65℃水浴10min，中間顛倒混勻2-3次；

3)水浴結(jié)束后加入130μl Buffer P3，混勻后，冰浴5min；

4)14000rpm，離心5min；

5)轉(zhuǎn)移溶液至QIAshredder收集管，14000rpm，離心2min；

6)將收集管中的液體轉(zhuǎn)入一根新的離心管，加入1.5倍體積的AW1，槍打勻；

7)轉(zhuǎn)移步驟6中的液體650μl至2ml收集柱，大于8000rpm，離心1min，(如果步驟6中樣品還有剩余，可重復(fù)此步驟)

8)將收集柱轉(zhuǎn)入一根新的2ml收集管，加入500μl AW2，大于8000rpm，離心1min，棄收集管中的液體；

9)加入500μl AW2，大于12000rpm，離心2min；

10)將吸附柱放入一根新的1.5ml離心管；

11)加入100μl Buffer AE，室溫放置5min-10min，大于8000rpm，離心1min；

12)將吸附柱重新放入一根新的1.5ml離心管，重復(fù)步驟11。

實(shí)施例3 CTAB法提取琴葉風(fēng)吹楠嫩葉、嫩樹(shù)皮、老葉、老樹(shù)皮DNA

1)將水浴鍋調(diào)至65℃；

2)用1.5ml的離心管編號(hào)后加入1ml的(2×CTAB+β-巰基乙醇)于65℃的水浴鍋中預(yù)熱；

3)取研缽，取適量的嫩葉、嫩樹(shù)皮、老葉、老樹(shù)皮分別加入液氮研磨，將研磨后的粉末轉(zhuǎn)入事先預(yù)熱好的裝有CTAB提取液的離心管中，于65℃水浴中溫浴2h左右，期間隔段時(shí)間上下顛倒搖動(dòng)；

4)10000r/min離心10min；

5)取上清液于一根干凈的離心管，加入等體積的24：1的氯仿：異戊醇，搖勻，10000r/min離心10min；

6)重復(fù)步驟5三次，直至中間析出的雜質(zhì)層很??；

7)取上清液加入300μl的5M的Nacl與600μl預(yù)冷的異丙醇，搖勻后置于4℃冰箱靜置過(guò)夜(此步應(yīng)先加入Nacl后加入異丙醇)；

8)10000r/min離心10min，棄上清液，沉淀即為DNA；

9)加76％乙醇200μl輕搖，使沉淀脫離管壁，靜置5min后，8000r/min離心5min；

10)重復(fù)步驟9一次；

11)棄上清液，加入無(wú)水乙醇200μl，8000r/min離心5min；

12)棄乙醇，晾干后加入TE溶解DNA。

實(shí)施例4 應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例1的方法，以琴葉風(fēng)吹楠硅膠干燥嫩樹(shù)皮、老樹(shù)皮為材料，用QIAGEN試劑盒改良法提取琴葉風(fēng)吹楠DNA，用于AFLP分析，AFLP分析在北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行，具體步驟如下：

1)QIAGEN試劑盒改良法提取琴葉風(fēng)吹楠DNA；

2)限制性酶切及連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

將以上體系混勻離心數(shù)秒37℃保溫5h,8℃保溫4h，4℃過(guò)夜。

3)預(yù)擴(kuò)增，體系如下：

離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增

4)選擇性擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物1:20稀釋后作為選擴(kuò)模板。

按以下體系混勻后，離心數(shù)秒。

按下列參數(shù)設(shè)置PCR循環(huán)

第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94℃30S，65℃30S，72℃80S

以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃，擴(kuò)增12循環(huán)。

接著按下列參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增

5)選擇性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如下圖2、圖3、圖4和圖5：

6)從原始數(shù)據(jù)(圖4)到0/1數(shù)據(jù)(圖5)的統(tǒng)計(jì)

鼎國(guó)公司提供了ABI377測(cè)序儀電泳檢測(cè)后的片段大小，即原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)是通過(guò)GENESCAN軟件進(jìn)分析，軟件每2個(gè)堿基讀一次數(shù)，Marker片段范圍為70-500bp，這樣在70-500bp之間一共讀取216個(gè)數(shù)，由于不可避免的誤差，在所設(shè)置的片段Bin Range范圍內(nèi)的片段，認(rèn)為是同一條帶，例如：在71.5-73.5之間，c1、c2擴(kuò)增條帶大小分別為73.00835和71.9044，這樣的誤差范圍在我們的誤差允許范圍認(rèn)為是同一條帶。

在原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，有帶的地方替換為1，無(wú)帶的地方替換為0，這樣構(gòu)成了01數(shù)據(jù)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選擇琴葉風(fēng)吹楠硅膠干燥嫩樹(shù)皮、老樹(shù)皮用QIAGEN試劑盒改良法提取的琴葉風(fēng)吹楠DNA完全可以用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。