本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其是涉及CYP101酶重組載體及構建方法、CYP101酶高效表達純化方法。
背景技術：
細胞色素P450(cytochrome P450，簡稱CYP450)為一類亞鐵血紅素—硫醇鹽蛋白的超家族，廣泛存在于自然界多種生物體內，它參與內源性物質和包括藥物、環(huán)境化合物在內的外源性物質的代謝。其參與過程大致可以分成三方面：體內激素物質的合成，外源物質代謝及脂肪酸分解。它們最初由Garfinkel和Klingenberg在1958年從哺乳動物的肝臟微粒體中被發(fā)現(xiàn)，由于此類蛋白在還原狀態(tài)下能與CO結合，結合后可以在波長為450nm處檢測到明顯吸收峰，因此被命名為細胞色素P450酶。分子生物學技術被應用到對細胞色素P450的研究中，使用細菌載體來表達CYP450成為廣泛使用的技術方法。CYP450基因的克隆、序列分析、多底物催化反應類型成為研究熱點。
CYP101(cytochrome P450 101)，又名P450cam，來自于惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)，它是研究細胞色素P450的模式蛋白之一。細胞色素氧化酶CYP101，其基因序列全長1245bp，序列如SEQ ID NO.1所示，編碼415個氨基酸。它催化單萜D-樟腦5-外-羥基化作用，隨后樟腦降解為乙酸和異丁酸以提供代謝所需。細菌的細胞色素P450中，CYP101酶是對結構和功能研究最廣泛的模型之一，P450的研究是目前國際研究的熱點，不同領域的科學家正在從不同的角度來揭示其本質。而CYP101作為研究細胞色素P450結構和功能的模式蛋白之一，因此，表達出具有高效穩(wěn)定和高純度的CYP101酶是后續(xù)研究的關鍵。
傳統(tǒng)的純化方法，為了獲得高純度的酶，往往用到三種以上的純化方法，純化時間長，導致酶的活力大大降低，多步純化，也導致了回收效率不高。純化方法少，又會導致純化的目的蛋白純度相對較低，達不到技術人員的理想要求。之前的文獻報道，關于CYP101的載體構建中，為了便于克隆和純化，采用了較長的純化標簽，如GST、MBP、Halo等融合表達標簽，包含幾十到幾百個氨基酸殘基；或者采用短純化標簽，例如6*His(6個氨基酸殘基)，flag(8個氨基酸殘基)，avidin(15個氨基酸殘基)，并在短標簽和目的蛋白之間加了較長的連接肽段，由于這些短標簽的引入，導致最終得到的目的蛋白比天然的蛋白至少多出10個以上的氨基酸，與天然結構存在差異，可能影響目的蛋白的性質或功能。
在CYP101酶的純化過程中，為了純化方便引入標簽，雖然純化后可利用蛋白酶切除標簽以保證和天然蛋白的相似性，但是酶切操作繁瑣，成本高，往往難以用于大量純化后樣品。同時酶切步驟，增加了純化時間，造成酶的活性難以保證。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供CYP101酶重組載體及構建方法、CYP101酶高效表達純化方法。
本發(fā)明提供了CYP101酶的載體構建方法，并提供了后續(xù)表達、純化方法，其表達量大、操作方便、需時較短、產物純度高。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)：
本發(fā)明第一方面：提供CYP101酶重組載體，為重組質粒pET28a-CYP101，其中CYP101酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本發(fā)明第二方面：提供CYP101酶重組載體的構建方法，包括以下步驟：
1)、模板：提取惡臭假單胞桿菌全基因組，用作PCR擴增反應的模板；
2)、PCR擴增：以惡臭假單胞桿菌的全基因組為模板，通過PCR擴增反應，制得擴增產物；
設計上下游引物序列分別為：
上游引物F：CCGCCATGGCGATGGTTCCCAGCGACCTGTATC；
下游引物R：GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAGPCR；
待反應結束后，電泳鑒定擴增片段，同時切膠回收目的片段；
3)、酶切：將擴增產物和原核表達載體pET28a同時進行NcoI和XhoI酶切，分別回收基因PCR產物和pET-28a載體酶切片段；
4)、目的基因片段與載體連接：T4DNA連接酶進行連接，16℃連接反應過夜，獲得重組質粒pET28a-CYP101；
5)、將重組質粒pET28a-CYP101轉化到TOP10感受態(tài)細菌，將其涂布于含卡那霉素50μg/ml的LB平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱12-16小時，便于后續(xù)挑選出陽性菌落；
6)、挑菌：挑取上步中平板中的單克隆菌落于含卡那霉素50μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，250rpm的搖床培養(yǎng)12小時；
7)、初步鑒定：取轉化平板上的陽性菌落，轉接10ml的含卡那霉素50μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃180rpm恒溫搖床培養(yǎng)12-16小時，菌液PCR鑒定后，使用小量提取質粒試劑盒進行質粒提取，并將重組質粒pET28a-CYP101NcoI和XhoI雙酶切鑒定，兩次鑒定產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
8)、核苷酸序列測定：將酶切鑒定正確的陽性菌株送去測序，確定構建載體的正確性。
本發(fā)明第三方面：提供包含CYP101酶重組載體的轉化體，選用大腸桿菌BL21-plysS作為宿主菌。
本發(fā)明第四方面：提供CYP101酶高效表達純化方法，包括以下步驟：
第一步：重組質粒pET28a-CYP101的構建；
第二步：CYP101的誘導表達：將重組質粒pET28a-CYP101轉化入大腸桿菌BL21-plysS感受態(tài)細菌中，并進行種子培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)至OD600達到0.5-0.7，用終濃度為0.5-1mM的IPTG誘導40-48小時；離心收集菌體并洗滌；
第三步：CYP101蛋白的純化：
A、細胞上清液的制備：采用菌體重懸、溶菌酶處理、超聲破碎、離心、濾膜過濾后獲得濾液加入500mM咪唑至咪唑終濃度達到20mM，得到細胞上清液，用于親和純化；
B、Ni-NTA柱親和純化：利用Ni-NTA柱，經過細胞上清液親和上樣、清洗雜蛋白、緩沖液置換后進行目的蛋白收集；
C、DEAE離子交換純化：采用DEAE離子交換層析柱，收集液上樣，再用緩沖液洗柱子除去未結合的蛋白質，最后用含有緩沖液D和緩沖液H的洗脫液洗脫，即得目的蛋白CYP101酶。
第一步重組質粒pET28a-CYP101的構建方法同上述CYP101酶重組載體的構建方法。
第二步所述的CYP101的誘導表達具體包括以下步驟：
21)轉化：將重組質粒PET28a-CYP101轉化入大腸桿菌BL21-plysS感受態(tài)細菌中，并劃線于卡納抗生素LB固體培養(yǎng)基平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱12-16小時；
22)、種子培養(yǎng)：挑取單克隆的菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)，250rpm下?lián)u菌過夜；
23)、擴大培養(yǎng)：將步驟22)得到的菌液以1:500的接種比例轉接到含卡納抗生素的TB培養(yǎng)基，加入微量元素，37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)；
24)、誘導表達：至OD600＝0.5-0.7，取1ml菌液做陰性對照，其余菌液加入終濃度為0.5mM的IPTG，置于24℃、200rpm的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)40小時；
25)、收菌：用大容量低溫離心機離心收菌，3500rpm，4℃，離心20分鐘，棄去上層培養(yǎng)基，收集菌體，菌體用冷的緩沖液A重懸沉淀，以清洗菌體表面，3500rpm，4℃，離心20分鐘，棄上清收集菌體；
所述的緩沖液A為含有50mM磷酸鉀與50mM氯化鉀的緩沖液，其pH為7.4。
步驟A所述的細胞上清液的制備具體包括以下步驟：
a1、菌體重懸：將CYP101的誘導表達收集的菌體用冷的緩沖液A重懸沉淀；
a2、溶菌酶處理：加入終濃度為2μg/ml的溶菌酶，按照1:200加入PMSF蛋白酶抑制劑，冰上靜置30分鐘；
a3、超聲破碎：超聲破碎，超聲3秒，停7秒，循環(huán)模式，至菌體澄清；
a4、高速離心：16000rpm，15分鐘，4℃將破碎后的液體離心15分鐘，收集上清，重復離心一次，收集上清；
a5、濾膜過濾：上述上清液須用0.45μm針孔式濾膜過濾，去掉不溶物；
a6、獲得濾液加入500mM咪唑至咪唑終濃度達到20mM，得到細胞上清液，用于親和純化；
所述的緩沖液A為含有50mM磷酸鉀與50mM氯化鉀的緩沖液，其pH為7.4。
步驟B所述的Ni-NTA柱親和純化具體包括以下步驟：
b1、親和上樣：平衡Ni-NTA柱，使用冷的緩沖液B進行平衡，將細胞上清液以2ml/分鐘流速流入Ni-NTA柱，同時將穿出液再以相同流速重復上樣；
b2、清洗雜蛋白：以500ml冷的緩沖液B清洗雜蛋白，流速為5ml/分鐘，然后繼續(xù)用20ml冷的緩沖液C清洗；
b3、緩沖液置換：用冷的緩沖液D，以5ml/分鐘流速，充分置換整個體系中的含鹽緩沖液；
b4、目的蛋白收集：采用梯度洗脫，其中第一進樣口使用冷的緩沖液E，第二進樣口使用冷的緩沖液F，并設置第一進樣口濃度變化為從100％到0％、第二進樣口濃度變化為從0％到100％進行梯度洗脫，流速控制為2ml/分鐘，收集目的蛋白CYP101；
所述的緩沖液B為含有50mM磷酸鉀、50mM氯化鉀、20mM咪唑的緩沖液，其pH為7.4；
所述的緩沖液C為含有50mM磷酸鉀、50mM氯化鉀、30mM咪唑的緩沖液，其pH為7.4；
所述的緩沖液D為含有50mM Tris的緩沖液，其pH為7.4；
所述的緩沖液E為含有20mM咪唑、50mM Tris的緩沖液，其pH為7.4；
所述的緩沖液F為含有150mM咪唑，50mM Tris的緩沖液，其pH為7.4。
步驟C所述的DEAE離子交換純化具體包括以下步驟：
c1、用冷的緩沖液D平衡DEAE離子交換層析柱，取用Ni-NTA柱親和純化后合并的目的蛋白收集液樣品直接上樣，穿出液重復上樣；
c2、用冷的緩沖液G清洗雜質蛋白至流出液中的紫外吸收值不變；
c3、目的蛋白收集：以冷的緩沖液D和緩沖液H分別為第一進樣口與第二進樣口的進樣液，并設置第一進樣口濃度變化為從10％變化至40％，第二進樣口濃度變化為從90％變化至60％，進行梯度洗脫，流速控制為2ml/分鐘，收集目的蛋白CYP101；
c4、濃縮：使用超濾管濃縮上述收集的樣品，以4000rpm，4℃，離心3次，其中置換緩沖液為緩沖液B，然后用BCA法定量樣品濃度，濃度達到15mg/ml以上可作后續(xù)凍干操作；
c5、凍干：將上述樣品完全凍干，制成干粉，密封置于-80℃長期保存；
所述的緩沖液B為含有50mM磷酸鉀、50mM氯化鉀、20mM咪唑的緩沖液，其pH為7.4；
所述的緩沖液D為含有50mM Tris的緩沖液，其pH為7.4；
所述的緩沖液G為含有50mM Tri、100mM NaCl的緩沖液，其pH為7.4；
所述的緩沖液H為含有50mM Tris、1M NaCl的緩沖液，其pH為7.4。
本發(fā)明改進了細胞色素酶CYP101原核表達載體的構建，相對天然蛋白增加的氨基酸殘基較少，只在C端增加了9個氨基酸殘基，即Glu Leu Glu His His His His His His，既保證了純化的便利，又對蛋白質結構影響較??；同時優(yōu)化了宿主表達菌BL21 plysS中CYP101的誘導培養(yǎng)條件，以保證蛋白的高表達水平；最后簡化了純化流程，結合Ni-NTA親和柱和DEAE離子交換柱兩步純化，在保證高產率的條件下極大提高了蛋白純度。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：
1、本發(fā)明CYP101酶高效表達純化方法工藝簡單，操作方便，目標蛋白表達量高，純化得率高，產品純度高，最終每升培養(yǎng)基可獲得23mg純度95％以上的目的蛋白。
2、本發(fā)明改進了CYP101酶的表達載體，使得所表達蛋白在原有天然CYP101酶序列的基礎上只增加了含6個組氨酸標簽在內的9個氨基酸殘基，即Glu Leu Glu His His His His His His，用于親和純化，非常接近天然蛋白。
3、本發(fā)明使用PET28a質粒用于構建表達載體，保證了CYP101蛋白的高表達水平。
4、本發(fā)明使用大腸桿菌BL21-plysS作為宿主，其表達量高，僅僅使用較簡單的三角搖瓶小量培養(yǎng)的方式，即達到超過29mg/L的表達水平。若使用常規(guī)的發(fā)酵罐，則總表達量可提高一個數(shù)量級以上。
5、本發(fā)明中對細菌誘導表達培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，采用TB培養(yǎng)基，誘導劑IPTG 0.5mM，在30℃誘導培養(yǎng)40h。
6、本發(fā)明CYP101酶高效表達純化方法簡化了純化流程，裂解液過濾處理后直接用Ni-NTA柱進行親和純化，親和洗脫之前對緩沖液進行置換，使收集液中鹽離子濃度很低，無需任何操作，可直接上樣DEAE弱陰離子交換柱。經過上述親和與離子交換兩步純化即可獲得高純度(>95％)目的蛋白，減少了純化時間，降低了蛋白失活的可能；同時減少了純化過程中目的蛋白的損失。
7、本發(fā)明CYP101酶高效表達純化方法中，首先使用親和純化，用于上樣的細胞裂解液須含20mM咪唑，一方面帶有融合標簽的CYP101酶在此咪唑濃度下仍能充分吸附在Ni-NTA的柱子上，同時此咪唑濃度下，保證細胞裂解中的雜蛋白極少的在Ni-NTA柱上的吸附。不僅極大減少后續(xù)對雜蛋白的清洗體積，縮短純化時間，同時也很大的提高了此步純化后的CYP101的純度；洗脫時采用咪唑梯度洗脫，能很好避免收集的CYP101酶中混入雜蛋白，提高獲得產物純度，簡化了純化流程，減少了純化時間。
8、本發(fā)明CYP101酶高效表達純化方法中，后續(xù)使用離子交換純化，其中使用DEAE弱陰離子柱，對CYP101蛋白有很好的吸附效果，有利于提高產品的純度和得率。
附圖說明
圖1為重組PET28a-CYP101載體的圖譜。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
實施例1：PET28a-CYP101的載體構建
1、模板：提取惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)全基因組，用作PCR擴增反應的模板。本實施例的來源為700412TM，該產品為成熟產品，可以直接購買。
2、PCR擴增：以惡臭假單胞桿菌的全基因組為模板，通過PCR擴增反應，制得擴增產物；
其中，設計上下游引物序列分別為：
上游引物F：CCGCCATGGCGATGGTTCCCAGCGACCTGTATC
下游引物R：GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAGPCR
PCR反應體系包括：10×擴增緩沖液(含Mg2+)5μl，2.5M dNTP混合物2μl，10μM引物1μl，模板DNA 2μl，Taq DNA聚合酶1μl，加入ddH2O至50μl。
反應體系各組分混勻后，放入PCR儀中，按下述反應參數(shù)設置循環(huán)條件。PCR反應參數(shù)：94℃預變性3分鐘；94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，30個循環(huán)；72℃延伸10分鐘；4℃持續(xù)1小時。
待反應結束后，電泳鑒定擴增片段，同時切膠回收目的片段。
3、酶切：將擴增產物(步驟2中得到的基因片段)和原核表達載體pET28a同時進行NcoI(NEB#R0193)和XhoI(NEB#R0146)酶切，分別回收基因PCR產物和pET-28a載體酶切片段。
4、目的基因片段與載體連接：T4DNA連接酶(NEB#M0202)進行連接，16℃連接反應過夜，獲得重組質粒pET28a-CYP101。轉化到TOP10感受態(tài)細菌，將其涂布于LB平板(含卡那霉素50μg/ml)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱12-16小時，便于后續(xù)挑選出陽性菌落。其中，卡那霉素產品型號為Amresco 0408。
5、挑菌：挑取上步中平板中的單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/ml)中，在37℃，250rpm的搖床培養(yǎng)12小時。
6、初步鑒定：取轉化平板上的陽性菌落，轉接10ml的LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/ml)中，37℃180rpm恒溫搖床培養(yǎng)12-16小時，菌液PCR鑒定后，使用小量提取質粒試劑盒(Promega#D3396-01)進行質粒提取，并將重組質粒pET28a-CYP101NcoI和XhoI雙酶切鑒定，兩次鑒定產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
7、核苷酸序列測定：將酶切鑒定正確的陽性菌株送去測序，確定構建載體的正確性。
本實施例中，重組PET28a-CYP101載體的圖譜如圖1所示。
實施例2：CYP101的大量誘導表達
1、轉化：將2μl重組質粒PET28a-CYP101轉化入大腸桿菌BL21-plysS感受態(tài)細菌中，并劃線于卡納抗生素LB固體培養(yǎng)基平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱12-16小時。
2、種子培養(yǎng)：挑取單克隆的菌落于20ml的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶37℃震蕩培養(yǎng)，250rpm下?lián)u菌過夜。
3、擴大培養(yǎng)：將步驟2得到的菌液以1:500的接種比例轉接到含卡納抗生素的1L TB培養(yǎng)基，加入250μl trace elements(微量元素，為直接購買的已知產品)，37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)。
4、誘導表達：三角搖瓶在上述條件下培養(yǎng)接近3小時，至OD600＝0.5-0.7，取1ml菌液做陰性對照，其余菌液加入終濃度為0.5mM的IPTG(異丙基-β-D硫代半乳糖苷，Amresco 367-93-1)，置于24℃、200rpm的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)40小時。
5、收菌：用大容量低溫離心機離心收菌，3500rpm，4℃，離心20分鐘，棄去上層培養(yǎng)基，收集菌體(冰上操作)，菌體用冷的緩沖液A(50mM磷酸鉀，50mM氯化鉀，pH7.4)重懸沉淀(冰上緩慢吹勻)，以清洗菌體表面，3500rpm，4℃，離心20分鐘，棄上清收集菌體。離心后菌體作下一步純化。若不能立即純化應-80℃保存。
實施例3：CYP101蛋白的純化
CYP101蛋白的純化過程全程置于冰上操作。
A、細胞上清液的制備
a1、菌體重懸：實施例2收集到的菌體用冷的緩沖液A(50mM磷酸鉀，50mM氯化鉀，pH7.4)重懸沉淀(冰上緩慢吹勻)。
a2、溶菌酶處理：加入終濃度為2μg/ml的溶菌酶，按照1:200加入PMSF蛋白酶抑制劑，冰上靜置30分鐘。
a3、超聲破碎：超聲破碎，超聲3秒，停7秒，循環(huán)模式，至菌體澄清。
a4、高速離心：16000rpm，15分鐘，4℃將破碎后的液體離心15分鐘，收集上清，重復離心一次，收集上清；
a5、濾膜過濾：上述上清液須用0.45μm針孔式濾膜過濾(冰上操作)，去掉不溶物，以免后續(xù)親和純化中堵塞純化柱。
a6、獲得濾液加入500mM咪唑至咪唑終濃度達到20mM，得到細胞上清液，用于親和純化。
B、Ni-NTA柱親和純化
使用蛋白純化儀為層析系統(tǒng)
b1、親和上樣：平衡Ni-NTA柱，使用冷的緩沖液B(50mM磷酸鉀，50mM氯化鉀，20mM咪唑，pH7.4)進行平衡，將a6步驟獲得的溶液以2ml/分鐘流速流入Ni-NTA柱，同時將穿出液再以相同流速重復上樣。此時，因為柱上吸附了大量的CYP101蛋白，可明顯觀察到其變?yōu)榧t棕色。上樣全程在4℃的層析柜中操作。
b2、清洗雜蛋白：以500ml冷的緩沖液B(50mM磷酸鉀，50mM氯化鉀，20mM咪唑，pH7.4)清洗雜蛋白，流速為5ml/分鐘。然后繼續(xù)用20ml冷的緩沖液C(50mM磷酸鉀，50mM氯化鉀，30mM咪唑，pH7.4)清洗。
b3、緩沖液置換：用約30ml冷的緩沖液D(50mM Tris，pH7.4)，以5ml/分鐘流速，充分置換整個體系中的含鹽緩沖液。
b4、目的蛋白收集：采用梯度洗脫，A進樣口使用冷的緩沖液E(20mM咪唑，50mM Tris，pH7.4)，B進樣口使用冷的緩沖液F(150mM咪唑，50mM Tris,pH7.4)，并設置A進樣口為100％→0％、B進樣口為0％→100％進行梯度洗脫，流速控制為2ml/分鐘，收集目的蛋白CYP101?？擅黠@觀察到收集管中的收集液為棕紅色。將收集的目的蛋白進行12％SDS-PAGE檢測。據(jù)此將較純的目的蛋白收集液合并。
C、DEAE離子交換純化
使用蛋白純化儀為層析系統(tǒng)
c1、用20ml冷的緩沖液D(50mM Tris，pH7.4)平衡DEAE離子交換層析柱，取上述步驟b4親和純化后合并的目的蛋白收集液樣品直接上樣，穿出液重復上樣。上樣后觀察到DEAE柱明顯變成棕紅色。
c2、用冷的緩沖液G(50mM Tris，100mM NaCl，pH7.4)清洗雜質蛋白至流出液中的紫外吸收值基本不變。
c3、目的蛋白收集：以冷的緩沖液D(50mM Tris，pH7.4)和緩沖液H(50mM Tris，1M NaCl，pH7.4)，分別為AB進樣液，并設置A進樣口為10％-40％、B進樣口為90％-60％進行梯度洗脫，流速控制為2ml/分鐘，收集目的蛋白CYP101?？擅黠@觀察到收集液呈棕紅色。將收集的目的蛋白進行12％SDS-PAGE檢測。據(jù)此將較純的目的蛋白收集液合并。
c4、濃縮：使用10KDa賽默飛公司的超濾管濃縮上述收集的樣品。以4000rpm，4℃，離心3次。其中置換緩沖液為緩沖液B。然后用BCA法定量樣品濃度，濃度達到15mg/ml以上可作后續(xù)凍干操作，此時因為CYP101蛋白較濃，顏色接近深紅棕色。
c5、凍干：將上述樣品完全凍干，制成干粉，密封置于-80℃長期保存。
上述的對實施例的描述是為便于該技術領域的普通技術人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應該在本發(fā)明的保護范圍之內。
<110> 上海交通大學
<120> CYP101酶重組載體及構建方法、CYP101酶高效表達純化方法
<160> 2
<210> 1
<211>1245
<212> DNA
<400> 1
atgacgactg aaaccataca aagcaacgcc aatcttgccc ctctgccacc ccatgtgcca 60
gagcacctgg tattcgactt cgacatgtac aatccgtcga atctgtctgc cggcgtgcag 120
gaggcctggg cagttctgca agaatcaaac gtaccggatc tggtgtggac tcgctgcaac 180
ggcggacact ggatcgccac tcgcggccaa ctgatccgtg aggcctatga agattaccgc 240
cacttttcca gcgagtgccc gttcatccct cgtgaagccg gcgaagccta cgacttcatt 300
cccacctcga tggatccgcc cgagcagcgc cagtttcgtg cgctggccaa ccaagtggtt 360
ggcatgccgg tggtggataa gctggagaac cggatccagg agctggcctg ctcgctgatc 420
gagagcctgc gcccgcaagg acagtgcaac ttcaccgagg actacgccga acccttcccg 480
atacgcatct tcatgctgct cgcaggtcta ccggaagaag atatcccgca cttgaaatac 540
ctaacggatc agatgacccg tccggatggc agcatgacct tcgcagaggc caaggaggcg 600
ctctacgact atctgatacc gatcatcgag caacgcaggc agaagccggg aaccgacgct 660
atcagcatcg ttgccaacgg ccaggtcaat gggcgaccga tcaccagtga cgaagccaag 720
aggatgtgtg gcctgttact ggtcggcggc ctggatacgg tggtcaattt cctcagcttc 780
agcatggagt tcctggccaa aagcccggag catcgccagg agctgatcga gcgtcccgag 840
cgtattccag ccgcttgcga ggaactactc cggcgcttct cgctggttgc cgatggccgc 900
atcctcacct ccgattacga gtttcatggc gtgcaactga agaaaggtga ccagatcctg 960
ctaccgcaga tgctgtctgg cctggatgag cgcgaaaacg cctgcccgat gcacgtcgac 1020
ttcagtcgcc aaaaggtttc acacaccacc tttggccacg gcagccatct gtgccttggc 1080
cagcacctgg cccgccggga aatcatcgtc accctcaagg aatggctgac caggattcct 1140
gacttctcca ttgccccggg tgcccagatt cagcacaaga gcggcatcgt cagcggcgtg 1200
caggcactcc ctctggtctg ggatccggcg actaccaaag cggta 1245
<210> 2
<211>424
<212> PRT
<400> 2
Met Thr Thr Glu Thr Ile Gln Ser Asn Ala Asn Leu Ala Pro Leu
5 10 15
Pro Pro His Val Pro Glu His Leu Val Phe Asp Phe Asp Met Tyr
20 25 30
Asn Pro Ser Asn Leu Ser Ala Gly Val Gln Glu Ala Trp Ala Val
35 40 45
Leu Gln Glu Ser Asn Val Pro Asp Leu Val Trp Thr Arg Cys Asn
50 55 60
Gly Gly His Trp Ile Ala Thr Arg Gly Gln Leu Ile Arg Glu Ala
65 70 75
Tyr Glu Asp Tyr Arg His Phe Ser Ser Glu Cys Pro Phe Ile Pro
80 85 90
Arg Glu Ala Gly Glu Ala Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Ser Met Asp
95 100 105
Pro Pro Glu Gln Arg Gln Phe Arg Ala Leu Ala Asn Gln Val Val
110 115 120
Gly Met Pro Val Val Asp Lys Leu Glu Asn Arg Ile Gln Glu Leu
125 130 135
Ala Cys Ser Leu Ile Glu Ser Leu Arg Pro Gln Gly Gln Cys Asn
140 145 150
Phe Thr Glu Asp Tyr Ala Glu Pro Phe Pro Ile Arg Ile Phe Met
155 160 165
Leu Leu Ala Gly Leu Pro Glu Glu Asp Ile Pro His Leu Lys Tyr
170 175 180
Leu Thr Asp Gln Met Thr Arg Pro Asp Gly Ser Met Thr Phe Ala
185 190 195
Glu Ala Lys Glu Ala Leu Tyr Asp Tyr Leu Ile Pro Ile Ile Glu
200 205 210
Gln Arg Arg Gln Lys Pro Gly Thr Asp Ala Ile Ser Ile Val Ala
215 220 225
Asn Gly Gln Val Asn Gly Arg Pro Ile Thr Ser Asp Glu Ala Lys
230 235 240
Arg Met Cys Gly Leu Leu Leu Val Gly Gly Leu Asp Thr Val Val
245 250 255
Asn Phe Leu Ser Phe Ser Met Glu Phe Leu Ala Lys Ser Pro Glu
260 265 270
His Arg Gln Glu Leu Ile Glu Arg Pro Glu Arg Ile Pro Ala Ala
275 280 285
Cys Glu Glu Leu Leu Arg Arg Phe Ser Leu Val Ala Asp Gly Arg
290 295 300
Ile Leu Thr Ser Asp Tyr Glu Phe His Gly Val Gln Leu Lys Lys
305 310 315
Gly Asp Gln Ile Leu Leu Pro Gln Met Leu Ser Gly Leu Asp Glu
320 325 330
Arg Glu Asn Ala Cys Pro Met His Val Asp Phe Ser Arg Gln Lys
335 340 345
Val Ser His Thr Thr Phe Gly His Gly Ser His Leu Cys Leu Gly
350 355 360
Gln His Leu Ala Arg Arg Glu Ile Ile Val Thr Leu Lys Glu Trp
365 370 375
Leu Thr Arg Ile Pro Asp Phe Ser Ile Ala Pro Gly Ala Gln Ile
380 385 390
Gln His Lys Ser Gly Ile Val Ser Gly Val Gln Ala Leu Pro Leu
395 400 405
Val Trp Asp Pro Ala Thr Thr Lys Ala Val Glu Leu Glu His His
410 415 420
His His His His
424