本發(fā)明屬于獸用生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是涉及一種鱘源嗜水氣單胞菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鱘魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中具有重要地位。我國鱘魚養(yǎng)殖主要集中在山東、湖北、云南、四川、浙江、湖南、河北、廣東、貴州、福建、北京等省(直轄市)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年全國鱘魚總產(chǎn)量為7.6萬噸，比2013年產(chǎn)量增長17.43％，在淡水養(yǎng)殖主要魚類中產(chǎn)量增值幅度排名第三。施氏鱘(Amursturgeon,AcipenserschrenckiiBrandt,1869)是我國北方鱘魚養(yǎng)殖的主要品種，且有較大的野生產(chǎn)量。隨著施氏鱘養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，集約化程度的不斷提高以及養(yǎng)殖水環(huán)境的惡化，施氏鱘病害尤其是細(xì)菌性疾病的問題日益突出，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，目前已成為威脅我國施氏鱘養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要因素。嗜水氣單胞菌(AeromonasHydrophila)隸屬于單胞菌科(Aermonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，廣泛分布于淡水、污水及土壤中，能引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物患病。鱘魚感染嗜水氣單胞菌后，引起鱘魚細(xì)菌性敗血癥，主要癥狀表現(xiàn)為腹部、口腔周圍、骨板基部出血，肛門紅腫，鰓絲顏色較淡；剖檢有淡紅色腹水，肌肉、腎臟、性腺充血，后腸出血發(fā)炎，并充滿泡沫狀粘液物質(zhì)，可引起鱘魚大規(guī)模死亡。長期以來，主要依賴抗生素對鱘魚細(xì)菌性敗血癥進(jìn)行治療，但是隨著病原菌耐藥性產(chǎn)生，水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題日漸顯現(xiàn)，尋求新的防治方法已成為科研工作關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，開展免疫預(yù)防是控制魚類嗜水氣單胞菌感染暴發(fā)的重要手段，國內(nèi)外學(xué)者已在其疫苗研發(fā)方面做了大量的工作，但因嗜水氣單胞菌血清型多，對異種血清型菌株的免疫預(yù)防效果都不太理想，難以大范圍推廣使用，嗜水氣單胞菌的抗原多樣性已成為開發(fā)有效疫苗的主要障礙。因此，防止鱘魚感染嗜水氣單胞菌，選擇來源于鱘魚的嗜水氣單胞菌是研制高效疫苗及篩選疫苗生產(chǎn)菌株的關(guān)鍵。已知嗜水氣單胞菌不同菌株間存在著毒力差異，致病力的有無及強(qiáng)弱取決于毒力因子的種類組成。因此，篩選出致病力強(qiáng)、免疫原性好的鱘源嗜水氣單胞菌對于制備疫苗具有重要的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供了一種鱘源嗜水氣單胞菌HZ8，所述的鱘源嗜水氣單胞菌HZ8已于2016年10月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCCNO：M2016555，分類命名：嗜水氣單胞菌(AeromonasHydrophila)HZ8，地址：中國武漢武漢大學(xué)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種嗜水氣單胞菌HZ8在制備鱘魚細(xì)菌性敗血癥疫苗中的應(yīng)用，該菌株為鱘魚細(xì)菌性敗血癥的預(yù)防提供了產(chǎn)品和方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：一種嗜水氣單胞菌HZ8：本發(fā)明所述的鱘源嗜水氣單胞菌HZ8為申請人自鱘魚中分離獲得，該菌株在Arg，Leu，Asp和Met4種氨基酸為碳源的合成培養(yǎng)基生長良好，最適生長條件為pH7.0，28℃以及液體培養(yǎng)基中溶解氧7.5～10g/L。在合成培養(yǎng)基礎(chǔ)上，氨基酸Ser，Val，Trp，Aaf和Phe有較強(qiáng)的促進(jìn)嗜水氣單胞菌生長的能力。鋅離子抑制細(xì)菌的生長；低濃度的鐵離子對細(xì)菌生長有一定的促進(jìn)作用。該菌株含有氣溶素(aer)、鞭毛基因(fla)、熱穩(wěn)定性細(xì)胞興奮性腸毒素(ast)、熱不穩(wěn)定性細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)、溶血素(hly)、彈性蛋白酶(ahyB)，橫項(xiàng)鞭毛蛋白(laf)、腸毒素蛋白(act)和脂酶(lip)。該菌株對頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢哌酮鈉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、氨曲南和頭孢吡肟抗生素敏感。所述的嗜水氣單胞菌HZ8已于2016年10月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCCNO：M2016555，分類命名：嗜水氣單胞菌(AeromonasHydrophila)HZ8，地址：中國武漢武漢大學(xué)。一種嗜水氣單胞菌HZ8在制備鱘魚細(xì)菌性敗血癥疫苗中的應(yīng)用，包括利用該菌株作為主效成分，或是主效成分之一制備成鱘魚細(xì)菌性敗血癥疫苗；所述的疫苗包括目前存在的滅活疫苗，減毒疫苗等目前已知的疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明首次篩選得到的鱘源的具有高致病性的嗜水氣單胞菌，該菌株共有9個(gè)毒力因子，包括氣溶素(aer)、鞭毛基因(fla)、熱穩(wěn)定性細(xì)胞興奮性腸毒素(ast)、熱不穩(wěn)定性細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)、溶血素(hly)、彈性蛋白酶(ahyB)，橫項(xiàng)鞭毛蛋白(laf)、腸毒素蛋白(act)和脂酶(lip)。利用該菌株制備的滅活疫苗，能夠預(yù)防鱘魚細(xì)菌性敗血癥的發(fā)生，本發(fā)明解決了目前市場上無高致病性的鱘源嗜水氣單胞菌疫苗，以及異種血清型嗜水氣單胞菌疫苗用于鱘魚效果不理想的問題，具有良好的市場推廣前景。附圖說明圖1為鱘源嗜水氣單胞菌HZ8—革蘭氏陰性菌示意圖；標(biāo)尺：5微米。圖2為嗜水氣單胞菌HZ8磷鎢酸負(fù)染結(jié)果(×2000倍)圖3為8株菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。圖4為8株嗜水氣單胞菌ERIC擴(kuò)增結(jié)果示意圖。其中：泳道M：5kbDNAladderMarker；1：YW2；2：TR3；3：TH5；4：HZ8；5：ZG9；6：ZJ10；7：QJ11；8：ZJ12；9：陰性對照。圖5為注射滅活疫苗和PBS后試驗(yàn)魚外周血紅細(xì)胞數(shù)量變化示意圖。圖6為注射滅活疫苗和PBS后試驗(yàn)魚外周血白細(xì)胞數(shù)量變化示意圖。圖7為注射滅活疫苗和PBS后試驗(yàn)魚外周血單核細(xì)胞分類百分比變化示意圖。圖8為注射滅活疫苗和PBS后試驗(yàn)魚外周血嗜中性粒細(xì)胞分類百分比的變化示意圖。圖9為注射滅活疫苗和PBS后試驗(yàn)魚外周血淋巴細(xì)胞分類百分比的變化示意圖。圖10為注射滅活疫苗和PBS后試驗(yàn)魚外周血細(xì)胞吞噬指數(shù)的變化示意圖。圖11為注射滅活疫苗和PBS后試驗(yàn)魚外周血細(xì)胞吞噬百分率變化示意圖。圖12為注射滅活疫苗和PBS后試驗(yàn)魚血清中酸性磷酸酶活性變化示意圖。圖13為注射滅活疫苗和PBS后試驗(yàn)魚血清中溶菌酶活性變化示意圖。圖14為試驗(yàn)魚的血清抗體效價(jià)隨時(shí)間的變化曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案；所述試劑或材料如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道；本發(fā)明所述試驗(yàn)魚為施氏鱘(Amursturgeon，AcipenserschrenckiiBrandt，1869)實(shí)施例1：嗜水氣單胞菌HZ8的分離及鑒定：本發(fā)明采用分子生物學(xué)方法，對8株鱘源嗜水氣單胞菌病原菌開展了以致病性、表型分析、分子鑒定及毒力基因檢測為內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)研究。基于所有菌株gyrB基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，8個(gè)菌株都與嗜水氣單胞菌聚為一支；用PCR方法檢測了9個(gè)毒力基因在菌株中的分布模式。僅HZ8菌株含有所有檢測毒力基因：氣溶素(aer)、鞭毛基因(fla)、熱穩(wěn)定性細(xì)胞興奮性腸毒素(ast)、熱不穩(wěn)定性細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)、溶血素(hly)、彈性蛋白酶(ahyB)，橫項(xiàng)鞭毛蛋白(laf)、腸毒素蛋白(act)和脂酶(lip)。此外,以施氏鱘為感染對象,HZ8菌株半數(shù)致死劑量最低，毒力最強(qiáng)，為2.28×104cfu/ml。具體步驟如下：(1)將從湖北、廣州、浙江、江蘇等地收集的病癥典型的鱘魚，無菌條件下從肝臟分離細(xì)菌，畫線接種于LB固體培養(yǎng)基平皿上，37℃培養(yǎng)24h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得8株分離菌，分別命名為YW2、TR3、TH5、HZ8、ZG9、ZJ10、QJ11、ZJ12。(2)取純培養(yǎng)的細(xì)菌單個(gè)菌落涂于干凈的載玻片上，然后用革蘭氏染色和磷鎢酸染色，鏡檢，觀察其形態(tài)特征。結(jié)果顯示，革蘭氏染色菌體顏色為紅色，說明菌體為革蘭氏陰性菌。菌體呈桿狀，單個(gè)或成對分布(圖1，圖2)。(3)毒力基因的檢測選取嗜水氣單胞菌的9種主要胞外毒力因子氣溶素(aerolysin，aer)、溶血素(hemolysin，hly)、熱穩(wěn)定細(xì)胞腸毒素(heat-stablecytotonicenterotoxin，ast)、熱敏感細(xì)胞腸毒素(heat-labilecytotonicenterotoxin，alt)、細(xì)胞毒性腸毒素(cytolyticenterotoxin，act)、溶血毒素(hemolysin，hly)、彈性蛋白酶(elastase，ahyB)、脂肪酶(lipase，lip)、鞭毛蛋白(flagellin，fla)和側(cè)鞭毛蛋白(lateralflagella，laf)HZ8菌株含有所有檢測毒力基因。(4)序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將8菌株的gyrB基因序列用Blast在Genbank中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)其與嗜水氣單胞菌屬的gyrB基因序列自然聚類，它們的同源性為95％～99％。系統(tǒng)發(fā)育數(shù)分析，結(jié)果如圖3所示，8菌株與Aerononashydrophila聚合，且置信度很高，為97％。因此，8株細(xì)菌均為來源于鱘魚的嗜水氣單胞菌。(5)指紋圖譜分析根據(jù)腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列(Enterobacterialrepetitiveintergenicconsensus，ERIC)指紋圖譜的規(guī)律，ERIC將菌株分為4個(gè)遺傳分型，YW2、TH5、ZG9和QJ11為同一型，TR3為一型，HZ8為一型，ZJ10和ZJ12為統(tǒng)一性(圖4)。四個(gè)分型正好與菌株毒力基因分布情況一致。(6)嗜水氣單胞菌半數(shù)致死量測定根據(jù)毒力基因和指紋圖譜結(jié)果將8株嗜水氣單胞菌分成4型，挑選4株菌株作為各自型的代表菌株(YW2、TR3、HZ8和ZJ10)，進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的嗜水氣單胞菌3000r/min離心10min，去除上清液體，菌體沉淀用PBS稀釋成103-108CFU/ml，然后分別對試驗(yàn)鱘魚進(jìn)行腹腔注射感染，每組試驗(yàn)魚30尾，每尾注射劑量為0.1ml，并設(shè)置PBS組作為對照。攻毒后連續(xù)觀察14天，每天記錄試驗(yàn)魚的死亡情況，計(jì)算半數(shù)致死量。結(jié)果如表1所示，HZ8半數(shù)致死劑量最低，所以其毒力最強(qiáng)。表14株代表菌株的半數(shù)致死劑量至此，篩選得到一株鱘源嗜水氣單胞菌，該菌株已于2016年10月10日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：嗜水氣單胞菌(AeromonasHydrophila)HZ8地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號：CCTCCNO：M2016555。實(shí)施例2：免疫原和吞噬原的制備免疫原的制備：挑取嗜水氣單胞菌HZ8單菌落于LB培養(yǎng)基中，37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)12～16小時(shí)。將福爾馬林加入已培養(yǎng)好的嗜水氣單胞菌菌液中至終濃度為0.3％，恒溫培養(yǎng)箱37℃滅活48h，即為嗜水氣單胞菌滅活疫苗。將滅活好的疫苗用5000r/min離心10min沉淀菌體，PBS懸浮菌體后再離心沉淀菌體，反復(fù)3次。將菌濃度調(diào)整至1.0×108CFU/ml，即為免疫原，置4℃冰箱中備用，用于以下實(shí)施例。同上述方法相同，將制備金黃色葡萄球菌滅活作為吞噬原，置4℃冰箱中備用，用于以下實(shí)施例。實(shí)施例3：鱘源嗜水氣單胞菌HZ8安全性檢測(1)平面無菌檢測將制備好的免疫原，取100μL，在無菌操作臺中涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72h，觀察結(jié)果，沒有細(xì)菌生長。(2)試驗(yàn)魚安全性檢測取健康試驗(yàn)魚(體長15～20厘米)30尾，將制備好的免疫原經(jīng)腹腔注射進(jìn)行免疫，免疫劑量為1ml/尾。另取健康試驗(yàn)魚30尾腹腔注射等劑量PBS作為對照組。試驗(yàn)魚正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14天，沒有魚體死亡或受嗜水氣單胞菌感染后的典型癥狀。實(shí)施例4：免疫與血液樣品制備取健康試驗(yàn)魚(體長15～20厘米)90尾，將制備好的免疫原經(jīng)腹腔注射進(jìn)行免疫，免疫劑量為0.2ml/尾。另取健康試驗(yàn)魚90尾腹腔注射等劑量PBS作為對照組。于免疫接種后第1、4、7、14、21、28天分別從各組中隨機(jī)取8尾試驗(yàn)魚，斷尾取血。其中4尾魚血液混合并加肝素鈉抗凝劑，用于紅、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、吞噬活性和吞噬指數(shù)測定；另外4尾魚血液取出后，室溫靜置1h，4℃冰箱靜置5-6h，4000r/min離心，10min，取上清，即為魚血清，用于酸性磷酸酶活力、溶菌酶活力和血清抗體效價(jià)測定。實(shí)施例5：鱘源嗜水氣單胞菌滅活疫苗的免疫效果檢驗(yàn)(1)血細(xì)胞計(jì)數(shù)用Dacie氏稀釋液將抗凝血稀釋200倍,利用Neubarer計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)紅、白細(xì)胞。免疫組與對照組試驗(yàn)魚分別注射疫苗與PBS后，其外周血紅、白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分別如圖5和圖6所示，在免疫接種后4天免疫組紅、白細(xì)胞數(shù)量均達(dá)到峰值，分別為(8.50±0.17)×108個(gè)/ml和(8.96±0.44)×106個(gè)/ml。隨后免疫組紅、白細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，但在注射后第28天仍然高于對照組紅、白細(xì)胞數(shù)量。對照組的紅、白細(xì)胞數(shù)量分別在7.50×108個(gè)/ml和6.80×106個(gè)/ml上下浮動。(2)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)用Wright-Giemsa染液對抗凝血涂片進(jìn)行混合染色，沖洗晾干，油鏡下隨機(jī)觀察100個(gè)白細(xì)胞，記錄白細(xì)胞中單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞所占的百分比。從注射后第1天開始，免疫組試驗(yàn)魚外周血白細(xì)胞中單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞分類百分比明顯高于對照組。免疫組試驗(yàn)魚的單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞分類百分比上升較快，在免疫后第7天達(dá)到峰值，分別為10.50％和15.53％。此后緩慢減少，但至免疫后第28天仍高于對照組(圖7和圖8)。免疫組淋巴細(xì)胞分類百分比在第1～21天緩慢升高，在第21天達(dá)峰值73.51％，但與對照組差異不顯著。在免疫后第28天發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞分類百分比開始下降，但仍高于對照組，與對照組淋巴細(xì)胞分類百分比差異不顯著(圖9)。(3)吞噬細(xì)胞吞噬活性取0.1ml抗凝血，在其中加入25μL滅活的金黃色葡萄球菌，充分混勻后置于28℃恒溫水浴鍋中孵育60min，每間隔10min搖勻1次；1000r/min離心3min；吸取血清和血細(xì)胞之間的白細(xì)胞層制涂片。將涂片用Wright-Giemsa染液混合染色，沖洗晾干，油鏡觀察記錄結(jié)果。吞噬活性以吞噬百分比和吞噬指數(shù)表示。注射后，免疫組試驗(yàn)魚外周血細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬百分率變化趨勢大致相同。免疫后，免疫組吞噬指數(shù)和吞噬百分比迅速升高，在第4天達(dá)到峰值，吞噬指數(shù)為4.53，吞噬百分比為30％，從第7天開始逐漸降低，但至免疫后第28天仍高于對照組(圖10和圖11)。對照組吞噬指數(shù)和吞噬百分率都在某一數(shù)值上下波動，較穩(wěn)定。(4)酸性磷酸酶活力測定取50uL血清，按照酸性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)操作說明進(jìn)行測定，按以下公式進(jìn)行計(jì)算酸性磷酸酶活力：酸性磷酸酶(U/100ml)＝(測定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管酚的含量(0.005mg)×(100ml/0.05ml)注射后，免疫組試驗(yàn)魚的酸性磷酸酶活力在14天內(nèi)不斷增強(qiáng)(圖12)，第14天時(shí)達(dá)到峰值30.21U/ml，隨后逐漸下降，但整體水平明顯一直高于對照組。(5)溶菌酶活力檢測取20uL血清，按照溶菌酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)操作說明進(jìn)行測定，按以下公式進(jìn)行計(jì)算溶菌酶活力：溶菌酶活力(μg/ml)＝[(測定管OD2-測定管ODl)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD2-標(biāo)準(zhǔn)管ODl)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(200U/ml)×樣本測試前稀釋倍數(shù)注射后，免疫組和對照組的試驗(yàn)魚血清中溶菌酶活力變化如圖13所示，免疫組試驗(yàn)魚血清中溶菌酶活力在免疫后第7天達(dá)到峰值為214.65U/ml，隨后溶菌酶活力逐漸下降，但一直保持比對照組的溶菌酶活力高。(6)血清抗體效價(jià)采用96孔血凝板法進(jìn)行，將免疫原作為反應(yīng)抗原。取100μL血清,按二倍稀釋法用PBS依次稀釋，加入等體積的免疫原，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育1h，4℃條件下過夜，顯微鏡觀察血清凝集反應(yīng)的強(qiáng)度。免疫組試驗(yàn)魚血清抗體效價(jià)在免疫后21天內(nèi)逐漸增強(qiáng)，21天時(shí)達(dá)到最大值效價(jià)單位為1：203。而對照組的血清抗體效價(jià)一直低于1：8(圖14)。(7)疫苗免疫保護(hù)率測定免疫接種后第21天，用濃度為100倍LD50(約3.0×106CFU/ml)的嗜水氣單胞菌HZ8對免疫組和對照組鱘魚進(jìn)行攻毒。攻毒后第14天，免疫組累計(jì)死亡率為22.22％，而對照組累計(jì)死亡率為92.22％，嗜水氣單胞菌滅活疫苗對試驗(yàn)魚的相對保護(hù)率為75.91％(表2)。表2攻毒后免疫組和對照組試驗(yàn)魚死亡情況及相對免疫保護(hù)率上述的試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明篩選得到的鱘源嗜水氣單胞菌具有高致病性，用其制備的滅活疫苗，能夠預(yù)防鱘魚細(xì)菌性敗血癥的發(fā)生，具有良好的市場推廣前景。當(dāng)前第1頁1 2 3