本發(fā)明涉及煙用添加劑領(lǐng)域，具體涉及利用固定化酵母菌制備煙用橙花提取物的制備方法。

背景技術(shù)：

加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是完善產(chǎn)品風(fēng)格的決定因素和提高卷煙香氣質(zhì)量的有效手段之一。目前煙用香精香料主要還是通過對(duì)天然動(dòng)植物的提取、化學(xué)合成制備。由于受到天然植物資源有限以及化學(xué)合成條件較苛刻限制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來，利用微生物發(fā)酵法制備煙用香原料，為煙用香原料的生產(chǎn)提供一條經(jīng)濟(jì)、高效的途徑，開發(fā)一些傳統(tǒng)方法無法生產(chǎn)的新型煙用香原料。

微生物固定化技術(shù)，是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適應(yīng)條件下能夠快速、大量增殖的生物技術(shù)，能夠彌補(bǔ)懸浮微生物發(fā)酵處理效率低、固液分離困難、抗毒性差等缺點(diǎn)。因此，近年來，微生物固定化技術(shù)的研究非?；钴S，發(fā)展較快，已應(yīng)用到許多工業(yè)部門如食品發(fā)酵工業(yè)，環(huán)境保護(hù)，新能源開發(fā)以及生物傳感器等，并取得了深入發(fā)展，顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)越性。主要涉及到以下幾個(gè)方面：在食品發(fā)酵工業(yè)中用于生產(chǎn)乙醇、啤酒、酸奶等；在環(huán)境保護(hù)中用于環(huán)境監(jiān)測(cè)和工業(yè)廢水的處理；在新能源開發(fā)中用于生產(chǎn)氫氣、甲烷、生化電池、微生物電池等；固定化微生物還可作為分子識(shí)別元件，用于制作各種生物傳感器。而隨著固定微生物技術(shù)的不斷成熟、完善，逐漸向高效低能耗、低成本、簡(jiǎn)單化、安全自動(dòng)化、無污染等方向發(fā)展，在能源危機(jī)、資源短缺、環(huán)境污染日趨嚴(yán)重的情況下，由此將推動(dòng)其在廢水處理方面更加深入和廣泛的應(yīng)用，具有更加深遠(yuǎn)的意義。尤其在廢水處理方面，具有很大的應(yīng)用前景。但在利用微生物固定化技術(shù)制備煙用橙花提取物卻未見報(bào)道。

橙花是苦橙的白色花瓣，蕓香科柑橘屬植物，原產(chǎn)于法國(guó)南部、摩洛哥、埃及和意大利等地。以橙花為原料的香料橙花精油和橙花凈油是卷煙中常用的煙用添加劑，在卷煙中具有豐富煙香、增加花香和甜香香韻的作用。

酵母菌是一些單細(xì)胞真菌，是子囊菌、擔(dān)子菌等幾科單細(xì)胞真菌的通稱，一般泛指能發(fā)酵糖類的真菌，可用于釀造生產(chǎn)，該菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生乙酸乙酯、苯乙醇等香氣物質(zhì)，這些香氣物質(zhì)能夠賦予卷煙特征的甜香香氣，是一種生產(chǎn)煙用香料的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)香菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種固定化酵母菌制備煙用橙花提取物的方法，結(jié)合微生物固定化發(fā)酵、冷凍干燥和分子蒸餾等技術(shù)，開發(fā)了一種新型煙用橙花提取物。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案：所述一種固定化酵母菌制備煙用橙花提取物的方法，其特征在于具體包括以下步驟：

(1)取橙花，加入其重量5～10倍的水，在50～65℃下微波提取2～3次，每次提取時(shí)間為2～3小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并多次提取液，得到橙花提取物a；

(2)將酵母菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；

(3)酵母菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的1～3％的步驟(2)中制備的酵母菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1h形成小球，然后將小球取出再加入飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得pva-sa固定化酵母菌小球，然后采用無菌水沖洗，烘干備用；

(4)將步驟(1)中制備的橙花提取物a與步驟(3)中制備的固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比5～10:1混合，在溫度為15～22℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1～5rpm的條件下發(fā)酵3～5d，然后置于4℃冷柜中保存7～14d；

(5)將步驟(4)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，然后將過濾后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，其冷凍干燥的料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為6～12h；

(6)取步驟(5)中冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2～4倍的80～95％酒精溶液，沉淀24～48小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.25～1.30；然后在濃縮物中加入丙二醇，得橙花提取物b，所述丙二醇的加入量為總質(zhì)量的20％；

(7)將步驟(6)中制備的橙花提取物b，在壓力0.5～5pa，進(jìn)料溫度為55℃～60℃，進(jìn)料速度為5～15ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為80～100rpm的條件下進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為橙花提取物。

本發(fā)明中采用的酵母菌為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)hhl-1，于2009年11月17日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:m209272。

本發(fā)明采用的微生物固定化技術(shù)具有發(fā)酵處理效率高、固液分離容易、抗毒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物工藝的不足。

本發(fā)明以橙花花為原料，利用固定化酵母菌發(fā)酵橙花提取物，獲得了一種品質(zhì)優(yōu)良的煙用橙花提取物，該提取物在卷煙中具有豐富煙香，增加甜香和花香香韻、增加卷煙香氣透發(fā)性，口腔余味較舒適。與現(xiàn)有橙花浸膏和橙花提取物相比，該橙花提取物在卷煙中香氣更加豐富，甜香韻和花香韻更加明顯，卷煙香氣透發(fā)性更好；與懸浮酵母菌發(fā)酵相比，該方法制備的橙花提取物中酯類香氣物質(zhì)含量增加了13.68％～17.29％，苯乙醇含量增加了23.47％～30.11％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，香氣更加豐富，果甜香和花香韻更加明顯，口腔余味更加舒適。該方法替代了橙花提取物傳統(tǒng)的提取技術(shù)，更新了生物發(fā)酵制備工藝，使得其能夠在卷煙中適用性增加，對(duì)煙用橙花提取物的制備提供了一條新途徑。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)的描述。

本發(fā)明以下實(shí)施例中的pva-sa(聚乙烯醇-海藻酸鈉)固定化酵母菌小球是按照以下方法采用聚乙烯醇(pva)和海藻酸鈉(sa)對(duì)酵母菌進(jìn)行固定化得到的：

(1)將酵母菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；上述方法中養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)為常用的普通肉湯培養(yǎng)基，其具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1；

(2)酵母菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的1～3％的步驟(2)中制備的酵母菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1h形成小球，然后將小球取出再加入到飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得pva-sa固定化酵母菌小球，然后采用無菌水沖洗，烘干備用；所述含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液的量和飽和na2so4溶液的量并無特殊要求，含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液只需要能夠使混合液產(chǎn)生沉淀，滿足乳酸菌的固定化要求即可，na2so4溶液的只需要將小球完全浸泡便可；所述硼酸飽和溶液、飽和na2so4溶液均為飽和水溶液。

本發(fā)明中采用的酵母菌為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)hhl-1，于2009年11月17日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:m209272。

實(shí)施例1，一種固定化酵母菌制備煙用橙花提取物的方法，包括以下步驟：

(1)取橙花，加入其質(zhì)量5倍的水，在55℃下微波提取2次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并多次提取液，得到橙花提取物a，兩次提取的條件完全相同；

(2)將步驟(1)中制備的橙花提取物a與上述方法制備的pva-sa固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比5:1混合，在溫度為15℃，攪拌轉(zhuǎn)速為5rpm的條件下發(fā)酵4d，然后置于4℃冷柜中保存8d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，過濾后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為10h；

(4)取步驟(3)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量3倍的80～95％酒精溶液，沉淀24小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.25，然后在濃縮物中加入總質(zhì)量20％的丙二醇，得橙花提取物b；

(5)將步驟(4)的橙花提取物b，在壓力2pa，進(jìn)料溫度為55℃，進(jìn)料速度為15ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為80rpm的參數(shù)條件下進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為橙花提取物。

實(shí)施例1中制備的橙花提取物在卷煙中具有豐富煙香，果甜香和花香韻更加明顯，口腔余味更加舒適，增加卷煙香氣透發(fā)性。

實(shí)施例2，一種固定化酵母菌制備煙用橙花提取物的方法，包括以下步驟：

(1)取橙花，加入其質(zhì)量10倍的水，，在60℃下微波提取3次，每次提取時(shí)間為3小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并多次提取液，得到橙花提取物a，三次提取的條件完全相同；

(2)將步驟(1)中制備的橙花提取物a與上述方法制備的pva-sa固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比10:1混合，在溫度為20℃，攪拌轉(zhuǎn)速為3rpm的條件下發(fā)酵5d，然后置于4℃冷柜中保存14d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為12h；

(4)取步驟(3)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2倍的80～95％酒精溶液，沉淀24小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.30，然后在濃縮物中加入總質(zhì)量20％的丙二醇，得橙花提取物b；

(5)將步驟(4)的橙花提取物b，在4pa，進(jìn)料溫度為60℃，進(jìn)料速度為10ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為100rpm，進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為橙花提取物。

實(shí)施例2中制備的橙花提取物具有豐富煙香，果甜香和花香韻更加明顯，口腔余味更加舒適，增加卷煙香氣透發(fā)性。

實(shí)施例3，一種固定化酵母菌制備煙用橙花提取物的方法，包括以下步驟：

(1)取橙花，加入其質(zhì)量8倍的水，在60℃下微波提取2次，每次提取時(shí)間為3小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并多次提取液，得到橙花提取物a，兩次提取的條件完全相同；

(2)將步驟(1)中制備的橙花提取物a與上述方法制備的pva-sa固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比7:1混合，在溫度為18℃，攪拌轉(zhuǎn)速為5rpm的條件下發(fā)酵6d，然后置于4℃冷柜中12d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，并將過濾后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為6～12h；

(4)取步驟(3)中冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量4倍的80～95％酒精溶液，沉淀48小時(shí)，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.30，然后在濃縮物中加入總質(zhì)量20％的丙二醇，得橙花提取物b；

(5)將步驟(4)的橙花提取物b，在3pa，進(jìn)料溫度為57℃，進(jìn)料速度為5ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為80rpm，進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為橙花提取物。

實(shí)施例3中制備的橙花提取物具有豐富煙香，果甜香和花香韻更加明顯，口腔余味更加舒適，增加卷煙香氣透發(fā)性。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)，申請(qǐng)人將本發(fā)明制備的橙花提取物與現(xiàn)有傳統(tǒng)提取方法制備的橙花提取物、采用懸浮酵母菌發(fā)酵制備的橙花提取物按照正常加香方式添加到煙絲中，制成卷煙，并進(jìn)行評(píng)吸，其評(píng)吸效果如下：

三種不同工藝制備的橙花提取在卷煙中的感官評(píng)價(jià)效果比較

從上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)可以看出來，本發(fā)明中制備的橙花提取物添加到卷煙中效果更好，而且根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與懸浮酵母菌發(fā)酵相比，該方法制備的橙花提取物中酯類香氣物質(zhì)含量增加了13.68％～17.29％，苯乙醇含量增加了23.47％～30.11％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，香氣更加豐富，果甜香和花香韻更加明顯，口腔余味更加舒適。