本發(fā)明涉及h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
h5亞型禽流感病毒嚴(yán)重危害我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對公共安全衛(wèi)生造成威脅。在部分養(yǎng)殖密度較高的地區(qū)，禽流感已成為制約當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素。尤其是近年來爆發(fā)的h5n1亞型高致病性禽流感病毒不僅引起禽類的大面積發(fā)病、死亡，更對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。預(yù)防該病最行之有效的辦法就是疫苗的接種，而目前市場生產(chǎn)的禽流感疫苗均為雞胚組織苗。
利用雞胚繁殖病毒制備禽流感疫苗的生產(chǎn)過程中涉及活病毒操作，會對環(huán)境的生物安全產(chǎn)生威脅。同時(shí)在禽流感流行時(shí)由于受到雞胚供應(yīng)的限制，疫苗生產(chǎn)存在生產(chǎn)周期長和產(chǎn)量低等缺點(diǎn)。
因此，人類社會亟需一種能夠快速反應(yīng)、大量生產(chǎn)的新型h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的生產(chǎn)方式。
昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)(baculovirusexpressionvectorsystem,bevs)作為一種真核表達(dá)載體系統(tǒng)，具有安全性高，對外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)和高效表達(dá)外源基因的能力等特點(diǎn)，目前已成為基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)(即桿狀病毒、大腸桿菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))之一。同時(shí)由于昆蟲細(xì)胞屬于半貼壁半懸浮細(xì)胞，對于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)病毒或重組蛋白提供了很好的條件。
但是，目前現(xiàn)有技術(shù)中尚未有報(bào)道公開利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)來增殖生產(chǎn)h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的方法。因此，我們需要在利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)增殖生產(chǎn)疫苗的實(shí)現(xiàn)過程中解決以下技術(shù)問題：首先，選擇何種細(xì)胞株用于h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的生產(chǎn)；其次，如何獲得能夠高效增殖的，滿足疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞株；最后，我們還需要尋找到適合的培養(yǎng)生產(chǎn)工藝條件，從而保證疫苗生產(chǎn)的高效、安全，有利于工業(yè)化推廣和實(shí)際應(yīng)用推廣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種新的利用昆蟲桿狀病毒增殖h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的方法。
為了實(shí)現(xiàn)這一目的，我們公開了以下技術(shù)方案。
首先，我們公開了利用hifi細(xì)胞培養(yǎng)增殖h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗，并且進(jìn)一步地，我們公開所述的h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗是將表達(dá)重組表達(dá)h5亞型禽流感病毒ha蛋白的桿狀病毒種毒接種在hifi細(xì)胞中復(fù)制繁殖的。
其中，優(yōu)選表達(dá)重組表達(dá)h5亞型禽流感病毒ha蛋白的桿狀病毒種毒是利用sf9細(xì)胞復(fù)制、繁殖。
所述的hifi細(xì)胞是指粉紋夜蛾卵巢細(xì)胞，屬于昆蟲細(xì)胞的一種。所述的sf9是指草地貪夜蛾細(xì)胞，也是昆蟲細(xì)胞的一種。
進(jìn)一步地，我們對hifi細(xì)胞和sf9細(xì)胞進(jìn)行了單克隆篩選，利用這一高效增殖機(jī)制的篩選獲得的hifi細(xì)胞和sf9細(xì)胞可以與病毒之間建立良好的匹配關(guān)系，從而使得繁殖獲得的h5亞型其流感病毒ha亞單位疫苗血凝效價(jià)達(dá)到212，利用這一亞單位疫苗制備的滅活疫苗抗體效價(jià)達(dá)到8.17log2，效果優(yōu)于常規(guī)疫苗。
具體地，這一篩選方式描述如下：將經(jīng)過無血清馴化后的sf9細(xì)胞用滴管重懸吹散后，利用96孔板進(jìn)行多輪細(xì)胞單克隆化篩選，我們將96孔板的行以a-h標(biāo)示，列以1-12標(biāo)示，位于左上角的第一個(gè)孔的坐標(biāo)即標(biāo)記為a1，以此類推96個(gè)孔中的每一個(gè)孔都獲得了一個(gè)標(biāo)記號。
然后我們將200μl體積的細(xì)胞懸液加入到a1孔內(nèi)，細(xì)胞數(shù)1000個(gè)，然后用8道移液器在所有孔中加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，從a1孔上下混勻吸出100μl加入b1孔，再從b1孔上下混勻吸出100μl加入c1孔，以此類推，依次進(jìn)行一級稀釋至h1孔；然后，分別用8道移液槍從a1-h1孔中上下混勻吸出100μl，加入到a2-h2孔內(nèi)，以此類推，依次進(jìn)行二級稀釋至a12-h12孔，這樣就獲得了多個(gè)單細(xì)胞孔，待單細(xì)胞孔中的細(xì)胞長滿單孔時(shí)，挑選細(xì)胞形態(tài)均一，生長性能良好的細(xì)胞株擴(kuò)增。
向經(jīng)過多輪細(xì)胞單克隆化篩選獲得的細(xì)胞株進(jìn)行h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗種毒的增殖，以桿狀病毒tcid50為檢測標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得增殖桿狀h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗種毒的能力達(dá)到108.5tcid50/ml的細(xì)胞株作為用于表達(dá)重組表達(dá)h5亞型禽流感病毒ha蛋白的桿狀病毒種毒的sf9細(xì)胞備用。
針對hifi細(xì)胞來說，其篩選的方式描述如下：將經(jīng)過無血清馴化后的hifi細(xì)胞用滴管重懸吹散后，利用96孔板進(jìn)行多輪細(xì)胞單克隆化篩選，我們將96孔板的行以a-h標(biāo)示，列以1-12標(biāo)示，位于左上角的第一個(gè)孔的坐標(biāo)即標(biāo)記為a1，以此類推96個(gè)孔中的每一個(gè)孔都獲得了一個(gè)標(biāo)記號。
然后我們將200μl體積的細(xì)胞懸液加入到a1孔內(nèi)，細(xì)胞數(shù)1000個(gè)，然后用8道移液器在所有孔中加入100μl細(xì)胞培養(yǎng)液，從a1孔上下混勻吸出100μl加入b1孔，再從b1孔上下混勻吸出100μl加入c1孔，以此類推，依次進(jìn)行一級稀釋至h1孔；然后，分別用8道移液槍從a1-h1孔中上下混勻吸出100μl，加入到a2-h2孔內(nèi)，以此類推，依次進(jìn)行二級稀釋至a12-h12孔，這樣就獲得了多個(gè)單細(xì)胞孔，待單細(xì)胞孔中的細(xì)胞長滿單孔時(shí)，挑選細(xì)胞形態(tài)均一，生長性能良好的細(xì)胞株擴(kuò)增。
向經(jīng)過多輪細(xì)胞單克隆化篩選獲得的細(xì)胞株進(jìn)行h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的增殖，以已培養(yǎng)物ha效價(jià)為檢測標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得增殖桿狀h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的能力達(dá)到11-12log2的細(xì)胞株作為用于表達(dá)重組表達(dá)h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的hifi細(xì)胞備用。
最后，我們還公開了疫苗生產(chǎn)培養(yǎng)工藝條件，包括以下步驟，（1）培養(yǎng)用于增殖h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗中毒的sf9-ha細(xì)胞；（2）將種毒接種于sf9-ha細(xì)胞，并培養(yǎng)增殖，收獲種毒；（3）培養(yǎng)用于增殖h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的hifi-ha細(xì)胞；（4）將種毒接種于hifi-ha細(xì)胞，并培養(yǎng)增殖，收獲h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗。
其中，步驟（2）中種毒的接種量為moi0.1～1，步驟（4）中種毒的接種量為moi1～4。
步驟（2）和步驟（4）中，病毒在反應(yīng)器中的增殖條件為：溶氧量為40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。
具體地，這一疫苗生產(chǎn)培養(yǎng)工藝條件可以描述為，包括以下步驟：
(1)用于增殖h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗種毒的sf9-ha細(xì)胞的培養(yǎng)：
a:搖瓶增殖自懸浮sf9-ha細(xì)胞的方法：將復(fù)蘇的細(xì)胞重懸在無血清培養(yǎng)基中，在100ml搖瓶中自懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)96h后，按照1:4的比例進(jìn)行傳代；
b:攪拌式反應(yīng)器自懸浮增殖sf9-ha細(xì)胞的方法：將擴(kuò)增的sf9-ha細(xì)胞按照1～2×106cell/ml的初始密度接種至新鮮無血清培養(yǎng)基中；溶氧量為40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。培養(yǎng)72～96h后，細(xì)胞達(dá)到能夠接種h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗制備種毒的要求2～4×106cell/ml；
(2)種毒的增殖與收獲：步驟1中細(xì)胞達(dá)到接種要求后，進(jìn)行以下步驟：將種毒按照moi0.1～1的接種量通過補(bǔ)液裝置進(jìn)入反應(yīng)器中培養(yǎng)，同時(shí)添加新鮮無血清培養(yǎng)基至原培養(yǎng)體積的2倍，繼續(xù)培養(yǎng)；病毒在反應(yīng)器中的增殖的條件：溶氧量40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。培養(yǎng)72～96h后，種毒效價(jià)達(dá)到108.5tcid50/ml，達(dá)到后期接毒的標(biāo)準(zhǔn)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)用于增殖h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗的hifi-ha細(xì)胞的培養(yǎng)：
搖瓶增殖自懸浮hifi-ha細(xì)胞的方法：將復(fù)蘇的細(xì)胞重懸在無血清培養(yǎng)基中，在100ml搖瓶中自懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)96h后，按照1:5的比例進(jìn)行傳代；
攪拌式反應(yīng)器自懸浮增殖hifi-ha細(xì)胞的方法：將擴(kuò)增的hifi-ha細(xì)胞按照1～2×106cell/ml的初始密度接種至新鮮無血清培養(yǎng)基中；溶氧量為40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。培養(yǎng)72～96h后，細(xì)胞達(dá)到能夠接種h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗種毒的要求2～4×106cell/ml；
h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗的增殖與收獲：步驟3中細(xì)胞達(dá)到接種要求后，進(jìn)行以下步驟：將種毒按照moi1～4的接種量通過補(bǔ)液裝置進(jìn)入反應(yīng)器中培養(yǎng)，同時(shí)添加新鮮無血清培養(yǎng)基至原培養(yǎng)體積的2倍，繼續(xù)培養(yǎng)；病毒在反應(yīng)器中的增殖的條件：溶氧量40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。培養(yǎng)72～96h后，h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗ha效價(jià)達(dá)到211～12，符合制苗要求。
其中sf9-ha細(xì)胞和hifi-ha細(xì)胞是指前述的經(jīng)過多輪細(xì)胞單克隆化篩選獲得的細(xì)胞株。
本發(fā)明所公開的h5亞型禽流感病毒ha亞單位疫苗的制備方法克服了當(dāng)前以雞胚組織苗為基礎(chǔ)的疫苗生產(chǎn)技術(shù)的不足，可以在反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)無血清懸浮培養(yǎng)，大大降低了生產(chǎn)成本，縮短了生長周期，可以快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，減少人力資源，顯著提高疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量。
同時(shí)，本發(fā)明提供h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗的培養(yǎng)過程中不需要添加血清，安全性高，不存在被外源病毒污染的可能。
另外，本發(fā)明應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，具有自動化程度高，生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定，減少人工操作。產(chǎn)量大，占地小。
同時(shí)，本發(fā)明提供h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗制備方法，該方法簡單、安全、高效，得到的病毒液效價(jià)高、質(zhì)量穩(wěn)定，適合工業(yè)放大培養(yǎng)。
最后，通過本發(fā)明所公開的技術(shù)方案后獲得的h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗制備疫苗接種后，抗體效價(jià)高，持續(xù)期長，能夠有效保護(hù)接種動物。
附圖說明
圖1為疫苗免疫后抗體效價(jià)檢測結(jié)果。
具體實(shí)施方式
為了更好的理解本發(fā)明，下面我們結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
除非有特殊說明，本發(fā)明實(shí)施例中所用的試劑、儀器等均為市售產(chǎn)品。
材料說明
按照公開文獻(xiàn)《h5亞型禽流感病毒ha基因桿狀病毒系統(tǒng)的表達(dá)及活性鑒定》（畜牧與獸醫(yī)2014年第46卷第3期：15-19）中公開的方式獲得h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗種毒。
用于sf9-ha細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基為gibco生產(chǎn)sf-900?iisfm。
用于hifi-ha細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基為gibco生產(chǎn)expressfivetmsfm。
實(shí)施例1高效增殖h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗種毒的sf9細(xì)胞株（sf9-ha）的篩選
sf9-ha細(xì)胞株是從草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)卵巢細(xì)胞系sf9中篩選獲的。具體篩選步驟如下：
sf-9細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行適應(yīng)和馴化，無血清培養(yǎng)基采用gibco公司生產(chǎn)sf-900?iisfm。
傳代至2~4代后，得到明顯適應(yīng)無血清培養(yǎng)的sf9細(xì)胞株，將細(xì)胞用滴管重懸吹散后，進(jìn)行多輪細(xì)胞單克隆化篩選，單克隆篩選方法如下：將200ul體積的細(xì)胞懸液加入96孔板的左上角一孔，即a1孔，（細(xì)胞數(shù)1000個(gè)細(xì)胞），然后用8道移液器在所有孔中加100ul細(xì)胞培養(yǎng)液。從a1孔上下混勻吸出100ul，加入b1孔，以此類推，依次進(jìn)行一級稀釋；用8道移液器從a1~h1孔，上下混勻吸出100ul，加入a2~h2孔，以此類推，依次進(jìn)行二級稀釋；理論上可以得到多個(gè)單細(xì)胞孔。待單細(xì)胞孔細(xì)胞長滿單孔，挑選細(xì)胞形態(tài)均一，生長性能良好的細(xì)胞株擴(kuò)增、凍存、備用。
將篩選獲得細(xì)胞株進(jìn)行h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗種毒的增殖，以桿狀病毒tcid50為檢測標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得能夠高效增殖h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗種毒的細(xì)胞株。
經(jīng)過三輪單克隆篩選后的細(xì)胞經(jīng)過測試檢測后，獲得的新的sf9細(xì)胞株增殖桿狀h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗種毒的能力從原來的107.5tcid50/ml增加至108.5tcid50/ml，建立篩選候選細(xì)胞株細(xì)胞庫；
搖瓶培養(yǎng)：將候選細(xì)胞株重懸至無血清培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)基中，搖瓶震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速為60～100rpm、溫度為27℃；
攪拌式反應(yīng)器自懸浮增殖sf9-ha細(xì)胞的方法：將擴(kuò)增的sf9-ha細(xì)胞按照1～2×106cell/ml的初始密度接種至新鮮無血清培養(yǎng)基中；溶氧量為40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。
實(shí)施例2高效增殖h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗的hifi細(xì)胞株（hifi-ha）的篩選
hifi-ha細(xì)胞株是從粉紋夜蛾trichoplusiani卵細(xì)胞系bti-tn-5b1-4（hifi細(xì)胞系）細(xì)胞系中篩選獲的。具體篩選步驟如下：
hifi細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行適應(yīng)和馴化，無血清培養(yǎng)基是gibco公司生產(chǎn)expressfivetmsfm。
傳代至2～4代后，得到明顯適應(yīng)無血清培養(yǎng)的hifi細(xì)胞株，將細(xì)胞用滴管重懸吹散后，進(jìn)行多輪細(xì)胞單克隆化篩選，單克隆細(xì)胞株的獲得方式與sf9-ha相同，挑選細(xì)胞形態(tài)均一，生長性能良好的細(xì)胞株擴(kuò)增、凍存、備用。
將篩選獲得細(xì)胞株進(jìn)行h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗的增殖，以已培養(yǎng)物ha效價(jià)為檢測標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得能夠高效增殖h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗的hifi細(xì)胞株。
經(jīng)過三輪單克隆篩選后的細(xì)胞經(jīng)過測試檢測后，獲得的新的hifi-ha細(xì)胞株增殖桿狀h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗種毒的能力從原來的9～10log2提高至11～12log2，建立篩選候選細(xì)胞株細(xì)胞庫；
搖瓶培養(yǎng)：將候選細(xì)胞株重懸至無血清培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)基中，搖瓶震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速為60～100rpm、溫度為27℃；
攪拌式反應(yīng)器自懸浮增殖hifi-ha細(xì)胞的方法：將擴(kuò)增的hifi-ha細(xì)胞按照1～2×106cell/ml的初始密度接種至新鮮無血清培養(yǎng)基中；溶氧量為40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。
實(shí)施例3大規(guī)模制備h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗的生產(chǎn)方式，包括如下步驟：
制備種毒用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：搖瓶培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)sf9-ha細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到4～6×106cell/ml時(shí)進(jìn)行分瓶傳代，培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速為60～100rpm、溫度為27℃；待細(xì)胞密度再次達(dá)到4～6×106cell/ml時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行自懸浮培養(yǎng)，反應(yīng)器培養(yǎng)條件：1～2×106cell/ml細(xì)胞初始密度溶氧量為40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。
細(xì)胞種毒的增殖：sf9-ha進(jìn)入反應(yīng)器培養(yǎng)24h后，將重組病毒接種至反應(yīng)器中。將種毒按照moi0.1～1的接種量通過補(bǔ)液裝置進(jìn)入反應(yīng)器中培養(yǎng)，同時(shí)添加新鮮無血清培養(yǎng)基至原培養(yǎng)體積的2倍，繼續(xù)培養(yǎng)；病毒在反應(yīng)器中的增殖的條件：溶氧量40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。培養(yǎng)72～96h后，種毒效價(jià)達(dá)到108.5tcid50/ml，達(dá)到后期接毒的標(biāo)準(zhǔn)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
生產(chǎn)疫苗用細(xì)胞的傳代及培養(yǎng)：搖瓶培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)hifi-ha細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到4～6×106cell/ml時(shí)進(jìn)行分瓶傳代，培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速為60～100rpm、溫度為27℃；待細(xì)胞密度再次達(dá)到4～6×106cell/ml時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行自懸浮培養(yǎng)，反應(yīng)器培養(yǎng)條件：1～2×106cell/ml細(xì)胞初始密度溶氧量為40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。
制苗毒液的增殖：hifi-ha進(jìn)入反應(yīng)器培養(yǎng)后，將重組病毒接種至反應(yīng)器中。將種毒按照moi0.1～1的接種量通過補(bǔ)液裝置進(jìn)入反應(yīng)器中培養(yǎng)，同時(shí)添加新鮮無血清培養(yǎng)基至原培養(yǎng)體積的2倍，繼續(xù)培養(yǎng)；病毒在反應(yīng)器中的增殖的條件：溶氧量40～60%的溶液飽和溶氧度；攪拌速度為60～100rpm；ph為6.0～6.5；溫度為27℃。培養(yǎng)72～96h后，接毒后每隔一段時(shí)間取樣觀察，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測細(xì)胞培養(yǎng)物的ha效價(jià)，待細(xì)胞大部分出現(xiàn)病變（腫大、破碎），且溶氧值呈明顯的上升趨勢，停止反應(yīng)器攪拌，收獲抗原。
實(shí)施例4半成品檢驗(yàn)及制苗、成品檢驗(yàn)：
a：血凝價(jià)的測定：將以上收獲的細(xì)胞懸液反復(fù)凍融3次后，測定血凝效價(jià)。血凝效價(jià)≥11log2。
b:無菌檢測：按照《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》附錄301頁進(jìn)行，無細(xì)菌生長。
c:油佐劑疫苗的配置：油相制備按照注射用白油（見《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》附錄343頁）96份、司本-804份、硬脂酸鋁2份的比例配置油相。取硬脂酸鋁，用少量注射用白油混合，加熱融化至半透明狀，再與全量司本-80及剩余注射用白油混合均勻，經(jīng)121℃滅菌15min，冷卻至室溫，備用。水相制備取經(jīng)檢驗(yàn)合格的h5亞型禽流感病毒亞單位疫苗，按照病毒液的4%加入吐溫-80乳化1min。將水相和油相按照1:3（體積比）比例進(jìn)行乳化，1000rpm×3～5min。
實(shí)施例5疫苗成品檢測
a：性狀外觀為白色乳狀液；劑型呈油包水型；穩(wěn)定性在37℃保存21天或者以3000rpm×15min，為破乳；粘度用1ml潔凈吸管（上口內(nèi)經(jīng)2.7mm、下口內(nèi)經(jīng)1.2mm），吸取25℃左右的疫苗1ml,令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時(shí)間，在8秒以內(nèi)。
b：無菌檢測按《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》附錄301頁進(jìn)行，結(jié)果：無菌生長；
c:安全檢驗(yàn)用3~5周齡spf（speceficpathogenfree，即無特定病原）雞10只，皮下、肌肉注射疫苗2羽份（0.4ml）,觀察14天。雞全部存活，剖檢注射部位，無因疫苗注射引起的嚴(yán)重局部反應(yīng)，如紅腫、疫苗殘留等。
d：效力檢測（血清效價(jià)）
用3～5周齡spf（speceficpathogenfree，即無特定病原）雞10只，皮下、肌肉注射疫苗1羽份（0.2ml)，同時(shí)設(shè)立同類商品疫苗和空白對照各10只。14天、21天、28天后，采集各組血清并測定血清hi抗體效價(jià)。具體結(jié)果見圖1。