發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有改善的特性，例如生長(zhǎng)，和改善的氮代謝的表達(dá)移動(dòng)信號(hào)hy5的轉(zhuǎn)基因植物，制備這樣的植物的方法和用于改善氮代謝和生長(zhǎng)的方法。
背景技術(shù)：
：氮(n)對(duì)作物發(fā)育是根本的，因?yàn)樗纬珊芏嘤袡C(jī)分子、核酸和蛋白的基礎(chǔ)成分。n營(yíng)養(yǎng)影響所有水平的植物功能，從代謝到資源分配，生長(zhǎng)和發(fā)育。由于施用的有機(jī)和肥料n的強(qiáng)烈的硝化，對(duì)于植物根的n獲取的最豐富的來源是天然有氧土壤中的硝酸根(no3-)。在過去的五十年期間，全球作物生產(chǎn)能力品著增加，這主要是由于改良的作物品種和化肥、特別是氮的大量投入。然而，對(duì)于很多作物，肥料n利用效率僅為約30-50％，大部分損失到環(huán)境中，導(dǎo)致各種有害影響，如空氣和水質(zhì)的惡化以及生物多樣性的喪失(ju，x.t.等人procnatlacadsciusa.106，3041-3046(2009))。此外，氮是供應(yīng)的最昂貴的營(yíng)養(yǎng)物之一并且商購(gòu)肥料代表了植物生產(chǎn)中的主要成本。據(jù)估計(jì)，環(huán)境中多余的n目前每年花費(fèi)歐盟700億歐元到3200億歐元(sutton等人，nature472，159-61(2011)。在中國(guó)，過去30年間谷物產(chǎn)量的增加伴隨著n利用效率(nue)從55急劇減少到20kg谷物/kg施用的肥料n(guo，等人science327，1008-1010(2010))。增加nue和限制氮肥料使用都是保護(hù)環(huán)境和改善可持續(xù)和多產(chǎn)的農(nóng)業(yè)的重要挑戰(zhàn)。該挑戰(zhàn)特別與需要大量n肥以獲得最大產(chǎn)量并且估計(jì)nue遠(yuǎn)小于50％的谷類作物相關(guān)(hirel等人，journalofexperimentalbotany，vol.58，no.9，pp.2369-2387(2007))。因此重要的是鑒別控制植物n代謝(包括n利用效率(nue)和n攝取)的關(guān)鍵步驟。對(duì)于大多數(shù)植物物種，nue主要取決于植物怎樣從土壤提取無機(jī)氮，吸收硝酸鹽和銨，以及循環(huán)有機(jī)氮。nue可以定義為每單位的土壤中可獲得的n(包括土壤和肥料中存在的殘留n)的谷物產(chǎn)率，即產(chǎn)出(總植物n、谷物n、生物量產(chǎn)率、谷物產(chǎn)率)和投入(施用的總n、土壤n或n-肥)的比率。因此，nue可以分為兩個(gè)過程：攝取效率(nupe；植物從土壤以硝酸根和銨離子去除n的能力)和利用效率(nute；使用n產(chǎn)生谷物產(chǎn)量的能力)。植物對(duì)氮的利用涉及多個(gè)步驟，包括攝取、吸收、遷移，和當(dāng)植物衰老時(shí)，再循環(huán)和再活化。為了控制土壤中改變的硝酸根濃度，植物根發(fā)展出至少三種硝酸根攝取體系，兩個(gè)高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體系(hats)和一個(gè)低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體系(lats)，負(fù)責(zé)硝酸根的獲得(crawfordandglasstrendsplantsci3：389-395(1998))。組成型hats(chats)和硝酸根誘導(dǎo)型hats(ihats)操作從而在外部介質(zhì)中以低的硝酸根濃度攝取硝酸根，飽和范圍是0.2-0.5mm。相比之前，lats在硝酸根獲得中以較高外部硝酸根濃度起作用。通過lats和hats的攝取由分別屬于nrt1和nrt2家族的硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)。經(jīng)由根的攝取通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)，將硝酸根攝取的表達(dá)和活性與植物的n狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。擬南芥(at)蛋白hy5，是一種堿性亮氨酸拉鏈(bzip)轉(zhuǎn)錄因子，已知其整合多種植物激素的(例如，生長(zhǎng)素和脫落酸)和環(huán)境的(例如，低溫)信號(hào)，并且在控制植物光敏形態(tài)發(fā)生的發(fā)育(photomorphogenicdevelopment)中發(fā)揮作用(18，28-30)。還已知側(cè)根形成在喪失hy5功能的突變體中增加(18，28)。已經(jīng)確立，嫩芽到根的長(zhǎng)距離信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)根生長(zhǎng)和n攝取(26，27)。本發(fā)明人首次鑒別了該信號(hào)的分子基礎(chǔ)并且表明hy5是介導(dǎo)植物中n代謝的嫩芽到根移動(dòng)信號(hào)。這提供了用于改善作物中營(yíng)養(yǎng)利用效率的備選策略。多產(chǎn)的農(nóng)業(yè)需要大量昂貴的含氮肥料。改善作物植物的nue因此至關(guān)重要。需要為作物植物提供更多地營(yíng)養(yǎng)有效基因型以保證用于全球食品安全的可持續(xù)作物生產(chǎn)，并且減少化肥投入的成本和消極環(huán)境效應(yīng)，如對(duì)空氣和水質(zhì)量的消極環(huán)境效應(yīng)，和生物多樣性的喪失。本發(fā)明旨在解決該需求。發(fā)明概述本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，hy5參與n代謝。如本文中所述的實(shí)例中表明的，在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)athy5導(dǎo)致根中硝酸根攝取的增加。此外，本發(fā)明人表明，hy5作為響應(yīng)光從嫩芽移動(dòng)到根的移動(dòng)信號(hào)起作用并且介導(dǎo)根生長(zhǎng)和硝酸根攝取。因此，盡管hy5在根中產(chǎn)生，僅當(dāng)由于光感在嫩芽/葉中產(chǎn)生的hy5蛋白移動(dòng)到根時(shí)，其積累至有效水平，并且誘導(dǎo)根發(fā)育和no3-攝取。hy5是調(diào)節(jié)光響應(yīng)的碳和氮代謝、使得植物能夠在對(duì)環(huán)境光改變的整個(gè)生物響應(yīng)中協(xié)調(diào)嫩芽和根生長(zhǎng)的嫩芽-根移動(dòng)蛋白的出人意料的發(fā)現(xiàn)，打開了增強(qiáng)作物營(yíng)養(yǎng)利用、生長(zhǎng)和生產(chǎn)率的生物技術(shù)途徑的方法，特別是使用組織特異性啟動(dòng)子以提升hy5水平用于有利的效應(yīng)。在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于增加植物中氮代謝的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，其包含含有hy5核酸序列和組織特異性調(diào)節(jié)序列的核酸構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，其包含含有hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述植物不是擬南芥。在另一方面，本發(fā)明涉及包含hy5核酸序列和組織特異性啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含如本文中所述的核酸構(gòu)建體的載體。在另一方面，本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞，其包含如本文中所述的核酸構(gòu)建體或如本文中所述的載體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生具有增加的氮攝取的植物的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含hy5核酸序列和組織特異性啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明涉及用于增加植物根中hy5蛋白的存在的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含與綠色組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)植物中c和n代謝平衡的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明涉及用于增加植物根中hy5蛋白的存在的方法，其包括在植物的綠色組織中引入并表達(dá)包含hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。在最后的方面，本發(fā)明涉及遺傳改變的植物，其中所述植物在內(nèi)源性hy5核酸序列或內(nèi)源性hy5啟動(dòng)子中攜帶突變，或其中所述突變向植物基因組中引入至少一個(gè)額外拷貝的hy5核酸。綜上所述，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案：1.用于增加植物中氮代謝的方法，所述方法包括在植物中引入并表達(dá)包含hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。2.根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸構(gòu)建體包含編碼seqidno：3所限定的athy5蛋白或其功能變體的seqidno：1或2或編碼seqidno：3的同系物的核酸序列。3.根據(jù)第2項(xiàng)所述的方法，其中所述同系物與seqidno：3具有至少30％的序列同一性。4.根據(jù)第2或3項(xiàng)所述的方法，其中所述同系物選自seqidnos：4至29。5.根據(jù)前述各項(xiàng)所述的方法，其中所述植物選自玉米、水稻、小麥、歐洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、馬鈴薯、番茄、煙草、葡萄、大麥、豌豆、豆、蠶豆、萵苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西蘭花或其他蕓苔屬蔬菜或楊樹。6.根據(jù)前述各項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸構(gòu)建體包含調(diào)節(jié)序列。7.根據(jù)第6項(xiàng)所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)序列選自組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。8.根據(jù)第7項(xiàng)所述的方法，其中所述組織特異性啟動(dòng)子是綠色組織特異性啟動(dòng)子。9.轉(zhuǎn)基因植物，其包含含有hy5核酸序列和組織特異性調(diào)節(jié)序列的核酸構(gòu)建體。10.根據(jù)第9項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述組織特異性啟動(dòng)子是綠色組織特異性啟動(dòng)子。11.根據(jù)第10項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述核酸構(gòu)建體包含編碼seqidno：3限定的athy5蛋白的seqidno：1或2或編碼seqidno：3的同系物的核酸序列。12.根據(jù)第11項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述同系物與seqidno：3具有至少30％的序列同一性。13.根據(jù)第11或12項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述同系物來自seqidnos：4至29。14.根據(jù)第9-13項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、水稻、小麥、歐洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、馬鈴薯、番茄、煙草、葡萄、大麥、豌豆、豆、蠶豆、萵苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西蘭花或其他蕓苔屬蔬菜或楊樹。15.轉(zhuǎn)基因植物，其包含含有hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述植物不是擬南芥。16.核酸構(gòu)建體，其包含hy5核酸序列和組織特異性啟動(dòng)子。17.根據(jù)第16項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中所述組織特異性啟動(dòng)子是綠色組織特異性啟動(dòng)子。18.根據(jù)第16或17項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中所述核酸構(gòu)建體包含編碼seqidno：3所限定的athy5蛋白的seqidno：1或2或編碼seqidno：3的同系物的核酸序列。19.根據(jù)第18項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中所述同系物與seqidno：3具有至少30％的序列同一性。20.根據(jù)第18項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中所述同系物選自seqidnos：4至29。21.根據(jù)第16至20項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體，其中所述植物選自玉米、水稻、小麥、歐洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、馬鈴薯、番茄、煙草、葡萄、大麥、豌豆、豆、蠶豆、萵苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西蘭花或其他蕓苔屬蔬菜或楊樹。22.載體，其包含根據(jù)第16至21項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體。23.宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)第16至21項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體或根據(jù)第22項(xiàng)所述的載體。24.用于產(chǎn)生具有增加的氮攝取的植物的方法，其包括向植物中引入并表達(dá)包含hy5核酸序列和組織特異性啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體。25.用于增加植物根中hy5蛋白的存在的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含與綠色組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。26.用于調(diào)節(jié)植物中c和n代謝之間的平衡的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。27.用于增加植物根中hy5蛋白的存在的方法，其包括在植物的綠色組織中引入并表達(dá)包含hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。28.遺傳改變的植物，其中所述植物在內(nèi)源性hy5核酸序列或內(nèi)源性hy5啟動(dòng)子攜帶突變或其中所述突變將至少一個(gè)額外拷貝的hy5核酸引入植物基因組。本發(fā)明在以下非限制性附圖中進(jìn)一步描述。附圖圖1.hy5調(diào)控根生長(zhǎng)和nrt2.1-依賴性的no3-攝取的嫩芽-照射促進(jìn)。(a)差別性嫩芽/根照射條件的圖示。將5-日齡幼苗暴露于3天差別性光處理(100μmol.s-1.m-2)：照射的(s(l))或暗生的(s(d))嫩芽，照射的(r(l))或暗生的(r(d))根。(b)對(duì)wt和hy5-526初生根生長(zhǎng)的差別性嫩芽/根照射效應(yīng)。箭頭表明實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的根尖位置。比例尺，1cm。(c)對(duì)wt、hy5-526、hy5和cop1-4幼苗初生根延伸長(zhǎng)度的差別性嫩芽/根照射影響。(d)對(duì)幼苗根的15no3-攝取的差別性嫩芽/根照射影響。(e)對(duì)10-日齡嫁接的植物的初生根延伸長(zhǎng)度的差別性嫩芽/根照射影響。嫁接物表示為接穗/砧木(例如，hy5/hy5-526具有hy5接穗和hy5-526砧木)。(f)對(duì)如(e)中嫁接的植物的根的15no3-攝取的差別性嫩芽/根照射影響。(c-f)數(shù)據(jù)表示為平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小寫字母表示平均值之間不顯著的差異(p＜0.05)。圖2.hy5從嫩芽到根遷移調(diào)節(jié)根生長(zhǎng)和no3-攝取。(a)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的初生根延伸生長(zhǎng)的差別性嫩芽/根照射影響。(b)hy5-gfp在phy5；hy5-gfphy5根中的分布。(c)在pcab3：hy5-gfphy5根中可檢測(cè)的hy5-gfp的分布。(d)14-日齡植物中的相對(duì)myc-hy5轉(zhuǎn)錄物豐度，相對(duì)于pcab3：myc-hy5hy5植物的水平的轉(zhuǎn)錄設(shè)為1。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝3)。(e)嫩芽(s)和根(r)中myc-hy5的免疫學(xué)檢測(cè)，hsp90上樣對(duì)照。(f)嫩芽-照射的pcab3：hy5-gfphy5/hy5嫁接物的根中hy5-gfp的分布。(g)嫩芽-照射的表達(dá)tev蛋白酶的pcab3：2×gustevre-hy5-gfphy5植物的根中hy5-gfp的檢測(cè)。(h)對(duì)表達(dá)tev蛋白酶的植物的初生根延伸生長(zhǎng)的差別性嫩芽/根照射影響。(i)對(duì)表達(dá)tev蛋白酶的植物的根15no3-攝取的差別性嫩芽/根照射影響。(j)對(duì)根中phy5：gfp轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的差別性嫩芽/根照射影響。(k)幼苗根(如所示嫁接的)中hy5-gfp的分布。(b，c，f，g，j，k)比例尺，50μm。(a，d，h，i)數(shù)據(jù)表示為平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小寫字母表示平均值之間不顯著的差異(p＜0.05)。圖3.hy5協(xié)調(diào)n和c代謝。(a)初生幼苗根(如所示的基因型/嫁接嵌合體)中的nrt2.1轉(zhuǎn)錄物水平，相對(duì)于wt根的水平的轉(zhuǎn)錄設(shè)為1。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝3)。(b)嫁接嵌合體的根no3-攝取。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝30)。(c)顯示用于來自14-日齡phy5：myc-hy5hy5植物的提取物的chip分析的nrt2.1啟動(dòng)子片段。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m(n＝3)。箭頭表示c/g盒序列基序。(d)將來自(c)的片段3與mbp-hy5孵育。用10，20，50或100-倍過量的未標(biāo)記的探針進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。(e)7-日齡幼苗中psy、tps1、sweet11和sweet12轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)豐度。值相對(duì)于wt水平表示，數(shù)據(jù)為平均值±s.e.m.(n＝3)。(f)chip測(cè)定。在tps1，sweet11和sweet12啟動(dòng)子中含有g(shù)-盒基序的片段用于來自14-日齡phy5：myc-hy5hy5植物的提取物的chip分析。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m(n＝3)。(g)蔗糖影響nrt2.1轉(zhuǎn)錄物豐度。相對(duì)于wts(l)/r(d)幼苗的水平的轉(zhuǎn)錄設(shè)為1。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝3)。(h)蔗糖影響根15no3-攝取。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝30)。(i)hy5對(duì)nrt2.1啟動(dòng)子的體內(nèi)結(jié)合。使用10-日齡phy5：myc-hy5hy5植物進(jìn)行chip-pcr分析。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m(n＝3)。相同的小寫字母表示平均值之間不顯著的差異(p＜0.05)。圖4.hy5響應(yīng)波動(dòng)的光環(huán)境協(xié)調(diào)植物生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)。(a)以如所示的注量率(fluencerate)生長(zhǎng)的幼苗的初生根延伸長(zhǎng)度。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝30)。(b)以如所示的注量率生長(zhǎng)的幼苗的15no3-攝取。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝30)(c)不同注量率的幼苗嫩芽生物量。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝30)。(d)以不同光注量率在土壤生長(zhǎng)21天(16h光周期)的植物的整個(gè)植物生物量。(e)d中所示植物的c含量。(f)d中所示植物的n含量。(g)以如所示的注量率生長(zhǎng)的21-日齡植物的c/n含量比。(d-g)數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝16)。相同的小寫字母表示平均值間不顯著的差異(p＜0.05)。圖5.pphy5在擬南芥中的表達(dá)和oshy5在擬南芥中的表達(dá)。來自擬南芥、水稻(oryzasativa)和小立碗蘚(physcomitrellapatens)的hy5同源物的保守功能。(a-c)光生長(zhǎng)的6-日齡擬南芥植物(如所示，wt、hy5和含有表達(dá)hy5-gfp的轉(zhuǎn)基因的hy5)的下胚軸長(zhǎng)度(a)、初生根分生組織細(xì)胞數(shù)(b)和根nrt2.1轉(zhuǎn)錄水平(c)。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m(n＝30)。(d)嫁接的植物的砧木部分(wt根)中與athy5、oshy5或pphy5融合的gfp的分布。圖6.a)athy5與同源物的比對(duì)；b)athy5與athyh序列的比對(duì)，c)同源物樹。圖7.差別性嫩芽/根照射對(duì)側(cè)根發(fā)育的影響。(a)差別性嫩芽/根照射對(duì)側(cè)根發(fā)育的影響。將3-日齡wt幼苗轉(zhuǎn)移至新的板，然后暴露于10d差別性光處理(100μmol.s-1.m-2)。比例尺，1cm。(b)不同處理中的側(cè)根產(chǎn)生。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小寫字母表示平均值之間不顯著的差異(p＜0.05)。圖8.hy5序列的等位基因變異。(a)hy5-526中的剪接位點(diǎn)突變。深灰色框表示外顯子，黑線表示內(nèi)含子，并且數(shù)字表示外顯子大小(bp)。(b)hy5和突變的hy5-526之間的蛋白序列比較。右側(cè)的數(shù)字表示全蛋白中的殘基位置。相同的殘基由深灰色框表示，并且變體殘基由淺灰色框表示。圖9.光生長(zhǎng)的6-日齡幼苗(如所示，wt、hy5和含有表達(dá)hy5-gfp或myc-hy5的轉(zhuǎn)基因的hy5)的下胚軸長(zhǎng)度。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小寫字母表示平均值之間不顯著的差異(p＜0.05)。圖10.在嫁接的植物pcab3：hy5-gfphy5接穗中可檢測(cè)的hy5-gfp的分布。(a)實(shí)驗(yàn)使用下胚軸嫁接嵌合體。(b)10-日齡嫁接的植物的接穗葉中的hy5-gfp分布。圖11.10-日齡嫁接的植物的根中hy5-gfp的分布。(a)在嫁接的植物的phy5：hy5-gfphy5砧木根中可檢測(cè)的hy5-gfp的分布。比例尺，50μm。(b)嫁接的植物的嫩芽和根中的相對(duì)hy5-gfp轉(zhuǎn)錄物豐度，如(a)中表達(dá)的，相對(duì)于嫁接的植物的phy5：myc-hy5hy5接穗葉的水平的轉(zhuǎn)錄設(shè)為1。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝3)。(c)接穗(嫩芽)和砧木(根)中hy5-gfp的免疫學(xué)檢測(cè)，利用hsp90上樣對(duì)照。圖12.差別性嫩芽/根照射對(duì)葉中的hy5-gfp的分布的影響。(a)嫩芽-照射的pcab3：2×gus-tevre-hy5-gfphy5植物的葉中hy5-gfp的分布。(b)表達(dá)tev蛋白酶的嫩芽-照射的pcab3：2×gus-tevre-hy5-gfphy5植物的葉中hy5-gfp的分布。圖13.hyh不是調(diào)控根生長(zhǎng)的光調(diào)節(jié)的嫩芽至根移動(dòng)信號(hào)。(a)嫩芽-照射對(duì)6-日齡ws、hyh-1和hy5hyh-1幼苗的初生根生長(zhǎng)的影響。(b)對(duì)ws、hyh-1和hy5hyh-1幼苗初生根延伸長(zhǎng)度的差別性嫩芽/根照射影響。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小寫字母表示平均值之間不顯著的差異(p＜0.05)。(c)hyh-gfp不可檢測(cè)地從嫩芽移動(dòng)到根。將由psuc2：hyh-gfphyh-1接穗和hyh(ws)砧木構(gòu)成的10-日齡嫁接的植物的接穗(葉)和砧木(根)中的hyh-gfp分布與由psuc2：hy5-gfphy5接穗和hy5(col)砧木構(gòu)成的10-日齡嫁接的植物的接穗(葉)和砧木(根)中的hy5-gfp分布相比較。圖14.hy5結(jié)合hy5啟動(dòng)子。(a)chip測(cè)定。該圖表描繪推定的用于chip分析的hy5啟動(dòng)子和片段(1-7)。使用14-日齡phy5：myc-hy5hy5植物進(jìn)行chip-pcr。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m(n＝3)。(b)emsa測(cè)定。將在a中顯示的含t/g-盒-基序的hy5啟動(dòng)子片段與所示的mbp-hy5孵育。用于hy5結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)分別利用含有t/g-盒基序的10×，20×，50×和100×未標(biāo)記的探針進(jìn)行。圖15.葡萄糖對(duì)根nrt2.1轉(zhuǎn)錄物豐度和15no3-攝取的影響。(a)wt和hy5幼苗的根中的nrt2.1轉(zhuǎn)錄物豐度。轉(zhuǎn)錄物水平相對(duì)擬南芥肌動(dòng)蛋白2的豐度表示。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝3)。(b)7-日齡wt和hy5幼苗根的15no3-攝取。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝10)。圖16.蔗糖對(duì)hy5啟動(dòng)子活性、hy5轉(zhuǎn)錄物和hy5對(duì)hy5啟動(dòng)子的結(jié)合親和力的影響。(a)蔗糖水平對(duì)根中hy5轉(zhuǎn)錄(如通過由phy5：gfp轉(zhuǎn)基因驅(qū)動(dòng)的gfp表達(dá)可顯現(xiàn)的)和hy5穩(wěn)定性(從phy5：hy5-gfp表達(dá)的hy5-gfp)的影響。比例尺，50μm。(b)蔗糖水平對(duì)根hy5轉(zhuǎn)錄物豐度的影響。轉(zhuǎn)錄物水平相對(duì)擬南芥肌動(dòng)蛋白2的豐度表示。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝3)。(c)使用在含有1％或3％蔗糖的1/2ms培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的10-日齡phy5：myc-hy5hy5植物進(jìn)行的chip-pcr分析。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝3)。利用student’st-檢驗(yàn)產(chǎn)生p值。圖17.myc-hy5的表達(dá)恢復(fù)對(duì)wt水平的hy5蔗糖敏感性。(a)蔗糖-處理的hy5和phy5：myc-hy5hy5根中nrt2.1轉(zhuǎn)錄物的水平。轉(zhuǎn)錄物水平相對(duì)于擬南芥肌動(dòng)蛋白2的豐度表示。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.(n＝3)。(b)蔗糖-處理的hy5和phy5：myc-hy5hy5根中15no3-攝取率。數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m(n＝30)。相同的小寫字母的存在表示平均值之間不顯著的差異(p＜0.05)。圖18.增加光注量率對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。以不同光注量率在土壤中生長(zhǎng)21天(16h光周期)的wt植物的嫩芽(上圖)和根(下圖)系統(tǒng)。比例尺，1cm。詳述現(xiàn)在將進(jìn)一步描述本發(fā)明。在以下段落，更詳細(xì)限定本發(fā)明的不同方面?？梢詫⑦@樣限定的各個(gè)方面與任何其他一個(gè)方面或多個(gè)方面組合，除非有明確相反指示。尤其是，指明為優(yōu)選的或有利的任何特征可以與指明為優(yōu)選或有利的任何其他一個(gè)特征或多個(gè)特征組合。除非另有指示，本發(fā)明的實(shí)踐將利用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的植物學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)和重組dna技術(shù)、生物信息學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中充分解釋。如本文中使用的，術(shù)語″核酸″、″核酸序列″、″核苷酸″、″核酸分子″或″多核苷酸″意在包括dna分子(例如，cdna或基因組dna)、rna分子(例如，mrna)、天然存在的、突變的、合成的dna或rna分子和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的dna或rna的類似物。其可以是單鏈或雙鏈的。這樣的核酸或多核苷酸包括，但不限于，結(jié)構(gòu)基因的編碼序列，反義序列，和不編碼mrnas或蛋白產(chǎn)物的非編碼調(diào)節(jié)序列。這些術(shù)語還包括基因。術(shù)語″基因″或“基因序列“廣泛地用于指與生物功能相關(guān)的dna核酸。因此，基因可以包括如基因組序列中的內(nèi)含子和外顯子，或可以僅包括如cdna中的編碼序列，和/或可以包括與調(diào)節(jié)序列組合的edna。術(shù)語“肽”、″多肽″和″蛋白″在本文中可交替使用，并且指通過肽鍵連接在一起的以任何長(zhǎng)度的多聚形式的氨基酸。如本文中使用的，術(shù)語“遺傳改變的”包括，但不限于，轉(zhuǎn)基因植物和突變體植物。為了本發(fā)明的目的，″轉(zhuǎn)基因的″、“轉(zhuǎn)基因”或″重組″意為關(guān)于例如核酸序列、表達(dá)盒、基因構(gòu)建體或包含核酸序列的載體或轉(zhuǎn)化有本發(fā)明所述的核酸序列、表達(dá)盒或載體的生物體，所有那些構(gòu)建體通過重組方法產(chǎn)生，其中(a)編碼用于本發(fā)明的方法的蛋白的核酸序列，或(b)與本發(fā)明所述的核酸序列可操作連接的遺傳控制序列，例如啟動(dòng)子，或(c)a)和b)不是處在它們的天然遺傳環(huán)境或已經(jīng)通過重組方法修飾，對(duì)于修飾，例如，可能采取一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的取代、添加、刪除、倒位或插入的形式。天然遺傳環(huán)境理解為意為原植物中的天然基因組或染色體基因座或基因組文庫中的存在。在基因組文庫的情況下，優(yōu)選，至少部分保留核酸序列的天然遺傳環(huán)境。環(huán)境在核酸序列至少一側(cè)側(cè)連并且具有至少50bp，優(yōu)選至少500bp，特別優(yōu)選至少1000bp，最優(yōu)選至少5000bp的序列長(zhǎng)度。當(dāng)該表達(dá)盒被非天然、合成的(″人工″)方法如，例如，誘變處理修飾時(shí)，天然存在的表達(dá)盒-例如如上文定義的核酸序列的天然啟動(dòng)子與編碼用于本發(fā)明的方法的多肽的相應(yīng)核酸序列的天然存在的組合-變?yōu)檗D(zhuǎn)基因表達(dá)盒。合適的方法，例如，記述在us5,565,350或wo00/15815中，其通過參考結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的目的的轉(zhuǎn)基因植物因此理解為意為，如上文所述的，用于本發(fā)明的方法的核酸不在所述植物的基因組中它們的天然基因座，對(duì)于核酸，可能同源或異源表達(dá)。因此，植物表達(dá)轉(zhuǎn)基因。然而，如所述的，在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因還意為，當(dāng)本發(fā)明的不同實(shí)施方案所述的核酸在植物的基因組中其天然位置時(shí)，就天然序列而言，該序列已被修飾，和/或天然序列的調(diào)節(jié)序列被修飾，例如通過誘變進(jìn)行修飾。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選理解為意為，本發(fā)明所述的核酸在基因組的非天然基因座的表達(dá)，即發(fā)生核酸的同源表達(dá)或優(yōu)選地發(fā)生核酸的異源表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合入植物，并且植物優(yōu)選對(duì)于轉(zhuǎn)基因是純合的。本發(fā)明的方面涉及重組dna技術(shù)，并且在優(yōu)選的實(shí)施方案中排除僅基于通過常規(guī)育種方法產(chǎn)生植物的實(shí)施方案。為了本發(fā)明的目的，“突變體”植物是與天然存在的野生型(wt)植物相比遺傳改變的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變體植物是與天然存在的野生型(wt)植物相比，使用誘變方法，如本文中所述的誘變方法改變的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，誘變方法靶向基因組修飾或基因組編輯。在一個(gè)實(shí)施方案中，與野生型序列相比，使用誘變方法改變內(nèi)源性hy5核酸或hy5啟動(dòng)子序列。與野生型植物相比，這些突變可以引起激活或另外增強(qiáng)hy5啟動(dòng)子或其功能同系物或變體的活性或可以增強(qiáng)hy5核酸或功能同系物或其變體的表達(dá)水平。與野生型植物相比，這樣的植物具有如本文中所述的改變的表型，如增加的氮代謝。因此，在該實(shí)例中，植物基因組中存在突變的內(nèi)源性hy5基因或hy5啟動(dòng)子序列賦予增加的氮代謝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用靶向基因組修飾特異性靶向內(nèi)源性hy5基因或hy5啟動(dòng)子序列，并且，存在在植物中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因不賦予突變的hy5基因或hy5啟動(dòng)子序列的存在。在備選的實(shí)施方案中，提供表達(dá)seqidno：1，2或3中限定的核酸、或其功能同系物或變體的突變體植物。此外，與野生型植物相比，這樣的植物具有改變的表型并且顯示增加的氮代謝。此外，再次，在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的植物的表型不由一種或多種轉(zhuǎn)基因的存在賦予。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，hy5是調(diào)節(jié)嫩芽生長(zhǎng)和c吸收與根生長(zhǎng)和n攝取的光調(diào)節(jié)的偶聯(lián)的嫩芽至根移動(dòng)信號(hào)。hy5從嫩芽轉(zhuǎn)移到根并且然后通過自身調(diào)節(jié)反饋環(huán)激活根hy5表達(dá)。此外，如擬南芥中所示，athy5直接調(diào)節(jié)硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白atnrt2.1的表達(dá)。因此，hy5的嫩芽-至-根遷移是光激活的atnrt2.1轉(zhuǎn)錄和根中n攝取(以no3-的形式)所需要的。換句話說，盡管hy5在根中產(chǎn)生，但是，僅當(dāng)由于光感而在嫩芽/葉中產(chǎn)生的hy5蛋白移動(dòng)到根時(shí)，其積累有效的水平并且誘導(dǎo)根發(fā)育和n-攝取。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于增加植物中的硝酸根代謝的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含植物hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。hy5在陸生植物中高度保守。保守的功能由本文中所述的實(shí)驗(yàn)證明，并且本發(fā)明人表明，水稻hy5、oshy5在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)時(shí)，可以誘導(dǎo)atnrt2.1，并且來自苔蘚、小立碗蘚(physcomitrella)的hy5也可以誘導(dǎo)atnrt2.1(圖5)。根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面，包括上述方法，植物hy5核酸編碼的植物hy5蛋白特征在于cop1相互作用結(jié)構(gòu)域和堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的存在(holme等人，embojournal，vol.20，第118-127頁，2001)。對(duì)于athy5的這些結(jié)構(gòu)域的序列在下文顯示。然而，這些序列在其他hy5蛋白中高度保守(參見例如圖6)，并且技術(shù)人員因此將能夠容易地鑒定除擬南芥之外的植物的hy5蛋白。因此，根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面的植物hy5蛋白包含一個(gè)或多個(gè)以下鑒別的保守的結(jié)構(gòu)域或與下文顯示的基序具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的全序列同一性的結(jié)構(gòu)域。athy5蛋白包括以下cop1相互作用結(jié)構(gòu)域：esdeeirrvpef(seqidno：30，參見圖6)。這包括推定的用于磷酸化的ckii位點(diǎn)(esdeeseqidno：31)。該結(jié)構(gòu)域(包括cop1相互作用結(jié)構(gòu)域)的核心v-p-e/d-x-g基序(seqidno：32，x是疏水殘基)是高度保守的結(jié)構(gòu)基序，其對(duì)于與cop1的相互作用是必需的。athy5蛋白還包括下文所示的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域：堿性基序：krlkrllrnrvsaqqarerkk(seqidno：33)亮氨酸拉鏈：lenrvkdlenknseleerlstlqnenqml(seqidno：34)在一個(gè)實(shí)施方案中，hy5核酸構(gòu)建體包含編碼seqidno：3限定的athy5蛋白的seqidno：1或2或其功能變體或同系物。如本文中使用的術(shù)語“核酸序列的功能變體”，就seqidno：1或另一序列而言是指保留完全非變體序列的生物功能的變體基因序列或基因序列的部分，例如當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)賦予增加的生長(zhǎng)或產(chǎn)量。功能變體還包括研目的基因的變體，其具有不影響功能的序列改變，例如在非保守的殘基中的改變。還包括的是與本文中所示的野生型序列相比，基本上相同，即僅具有相一些序列改變，例如在非保守的殘基中的改變，并且是有生物活性的變體。因此，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，要理解，本發(fā)明的方面，包括方法和用途，不僅包括包含或由seqidno：1組成的核酸序列，而且還包括不影響所得到的蛋白的生物活性和功能的seqidno：1的功能變體或部分。導(dǎo)致在給定位點(diǎn)產(chǎn)生不同氨基酸的不影響編碼的多肽的功能特性的核酸序列的改變是本領(lǐng)域中公知的。例如，用于氨基酸丙氨酸(一種疏水氨基酸)的密碼子可以被編碼另一較不疏水殘基，如甘氨酸，或更疏水殘基，如纈氨酸、亮氨酸、或異亮氨酸的密碼子取代。類似地，導(dǎo)致一種帶負(fù)電的殘基替代另一種，如天冬氨酸替代谷氨酸，或一種帶正電的殘基替代另一種，如賴氨酸替代天冬酰胺的改變，也可以預(yù)期產(chǎn)生功能相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物。導(dǎo)致多肽分子的n-末端和c-末端部分的改變的核苷酸變化將不會(huì)預(yù)期改變多肽的活性。每種建議的修飾充分在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)中，這是編碼產(chǎn)物保留生物活性的決定因素。功能變體與非變體氨基酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的全序列同一性。技術(shù)人員將理解，本發(fā)明不限于使用athy5的方面。因此，在本發(fā)明的方面的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列編碼seqidno：3的同系物。如本文中使用的術(shù)語同系物還意味著來自其他植物物種的athy5同源物。athy5多肽或athy5核酸序列的同系物分別以優(yōu)先性增加的順序與seqidno：3表示的氨基酸或與seqidno：1或2中所示的核酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的全序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，全序列同一性是至少37％。在一個(gè)實(shí)施方案中，全序列同一性是至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，最優(yōu)選90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少99％。hy5同系物的功能變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果兩個(gè)序列中的核苷酸或氨基酸殘基序列分別在如下文所述對(duì)最大一致性進(jìn)行比對(duì)時(shí)相同，兩個(gè)核酸序列或多肽被稱為″同一的″。在一個(gè)或兩個(gè)核酸或多肽序列的情況下，術(shù)語″同一的″或百分?jǐn)?shù)″同一性″是指當(dāng)如使用以下序列比較算法之一或通過人工比對(duì)和肉眼檢查測(cè)量，經(jīng)比較窗口對(duì)最大一致性比較和比對(duì)時(shí)，相同的或具有相同的指定的氨基酸殘基或核苷酸百分?jǐn)?shù)的兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列。當(dāng)就蛋白或肽而言使用序列同一性的百分?jǐn)?shù)時(shí)，認(rèn)為不相同的殘基位置常常差異在于保守氨基酸取代，其中氨基酸殘基替代其他具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基，并且因此不改變分子的功能特性。在序列差異在于保守取代時(shí)，百分?jǐn)?shù)序列同一性可以上調(diào)以校正取代的保守性質(zhì)。進(jìn)行此調(diào)節(jié)的方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列用作參考序列，測(cè)試序列與其比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，指定隨后的坐標(biāo)，并且如果需要，指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J(rèn)的程序參數(shù)，或可以指定替代的參數(shù)。然后基于程序參數(shù)，序列比較算法計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的百分?jǐn)?shù)序列同一性。適于確定序列同一性和序列相似性的算法的非限制性實(shí)例是blast和blast2.0算法。同系物的實(shí)例在圖6、表1和seqidnos：4-29中顯示。本發(fā)明人表明，來自小立碗蘚(physcomitrellapatens)的與athy5具有38.6％序列同一性的同系物和與athy5具有65.5％序列同一性的oshy5當(dāng)在擬南芥中表達(dá)時(shí)均誘導(dǎo)atnrt2.1(圖5)，并且挽救功能突變體的hy5損失。合適的同系物可以通過序列比較和保守的結(jié)構(gòu)域的鑒定來鑒別。本領(lǐng)域中存在可以用于鑒別這樣的序列的預(yù)測(cè)器。同系物的功能可以如本文中所述的鑒別，并且例如在植物中過表達(dá)時(shí)或當(dāng)通過挽救突變體表型在hy5功能缺失突變體中表達(dá)時(shí)，技術(shù)人員由此能夠確認(rèn)該功能。因此，本發(fā)明和本文中所述的hy5核苷酸序列也可以用于從其他生物、特別是其他植物，例如作物植物分離相應(yīng)序列。以這種方式，如pcr、雜交等方法可以用于基于它們與本文中所述的序列的序列同源性鑒別這樣的序列。當(dāng)鑒別和分離同系物時(shí)，也可以考慮序列的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和特征結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。可以基于它們與整個(gè)序列或與其片段的序列同一性分離序列。在雜交技術(shù)中，已知核苷酸序列的全部或部分用作探針，其與存在于來自選擇的植物的克隆的基因組dna片段或cdna片段的群體(即，基因組或cdna文庫)中的其他相應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交。雜交探針可以是基因組dna片段、cdna片段、rna片段、或其他寡核苷酸，并且可以用可檢測(cè)的基團(tuán)，或任何其他可檢測(cè)的標(biāo)志物標(biāo)記。用于雜交和用于構(gòu)建cdna和基因組文庫的探針的制備方法一般在本領(lǐng)域中已知，并且在sambrook，等人.，(1989)molecularcloning：alibrarymanual(第2版，coldspringharborlaboratorypress，plainview，newyork)中描述。這樣的序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行?！鍑?yán)格條件″或″嚴(yán)格雜交條件″意為這樣的條件，在該條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度高于與其他序列的雜交程度(例如，高于背景至少2-倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同情況下將不同。通過控制雜交的嚴(yán)格性和/或洗滌條件，可以鑒別與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))。備選地，可以調(diào)整嚴(yán)格性條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，從而檢測(cè)較低程度的相似性(異源探測(cè))。通常，探針長(zhǎng)度小于約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。通常，嚴(yán)格條件將是這樣的條件：其中在ph7.0至8.3鹽濃度小于約1.5mna離子，通常約0.01至1.0mna離子濃度(或其他鹽)，并且對(duì)于短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)，溫度是至少約30℃，并且對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)，溫度是至少約60℃。雜交持續(xù)時(shí)間通常小于約24小時(shí)，通常約4至12小時(shí)。還可以通過加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺來獲得嚴(yán)格條件。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的athy5同系物選自玉米、水稻、小麥、歐洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、馬鈴薯、番茄、煙草、葡萄、大麥、豌豆、豆、蠶豆、萵苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西蘭花或其他蕓苔屬蔬菜或楊樹。根據(jù)本文中所述的方法，植物表達(dá)對(duì)于個(gè)體植物是″外源的″多核苷酸，所述″外源的″多核苷酸是通過除有性雜交之外的任何方式引入植物的多核苷酸。下文描述了通過其可以實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)的方式的實(shí)例。在方法的一個(gè)實(shí)施方案中，外源的核酸是在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的，其對(duì)于所述植物不是內(nèi)源的，而是源自另一植物物種的植物hy5核酸序列。例如，athy5可以在不是擬南芥(arabidopsis)的另一植物中表達(dá)。在方法的一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)源性核酸在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，其是包含內(nèi)源性hy5核酸或源自其的序列的核酸構(gòu)建體。例如，oshy5可以在水稻中表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面、本文所述的方法和應(yīng)用的植物，包括轉(zhuǎn)基因植物，可以是單子葉或雙子葉植物。雙子葉植物可以選自包括但不限于以下各項(xiàng)的科：菊科(asteraceae)，十字花科(brassicaceae)(例如歐洲油菜(brassicanapus))，藜科(chenopodiaceae)，葫蘆科(cucurbitaceae)，豆科(leguminosae)(蘇木科(caesalpiniaceae)，aesalpiniaceae，含羞草科(mimosaceae)，papilionaceae或豆科(fabaceae))，錦葵科(malvaceae)，薔薇科(rosaceae)或茄科(solanaceae)。例如，植物可以選自萵苣、向日葵、擬南芥、西蘭花、菠菜、西瓜、筍瓜、甘藍(lán)、番茄、馬鈴薯、山藥、辣椒、煙草、棉花、秋葵、蘋果、玫瑰、草莓、苜蓿、豆、大豆、蠶豆、豌豆、扁豆、花生、鷹嘴豆、杏、梨、桃、葡萄藤、甜椒、辣椒或柑橘物種。單子葉植物可以是，例如，選自科檳榔科(arecaceae)、石蒜科(amaryllidaceae)或禾本科(poaceae)。例如，植物可以是谷類作物，如玉米、小麥、水稻、大麥、燕麥、高粱、黑麥、粟、蕎麥、或飼料作物如黑麥草屬(loliumspecies)或羊茅屬(festucaspecies)，或作物如甘蔗、洋蔥、韭菜、山藥或香蕉。還包括的是生物燃料和生物能源作物如油菜/加拿大油菜、甘蔗、甜高粱、柳枝稷(panicumvirgatum)(柳枝稷(switchgrass))、亞麻籽、羽扇豆和柳樹、楊樹、楊樹雜交種、芒草(miscanthus)或裸子植物，如火炬松。還包括的是用于用于青貯飼料(玉米)、放牧或草料(草、三葉草、sanfoin、苜蓿)、纖維(例如棉花、亞麻)、建筑材料(例如松樹、橡樹)、制漿(例如楊樹)、用于化學(xué)工業(yè)的進(jìn)料儲(chǔ)備(例如高芥酸油料種子油菜、亞麻籽)和用于舒適目的(例如用于高爾夫球場(chǎng)的草皮草)、公共和私人花園的觀賞植物(例如金魚草、矮牽牛、玫瑰、天竺葵、煙草屬)和家用的植物和切花(非洲堇(africanviolets)、秋海棠(begonias)、菊花(chrysanthemums)、天竺葵、毛蜘蛛植物(coleusspiderplants)、龍血樹(dracaena)、橡膠植物)的作物。優(yōu)選，植物是作物植物。作物植物意為以商業(yè)規(guī)模的種植的用于人或動(dòng)物消耗或使用的任何植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物是谷物。最優(yōu)選的植物是玉米、水稻、小麥、歐洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、馬鈴薯、番茄、煙草、葡萄、大麥、豌豆、豆、蠶豆、萵苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西蘭花或其他蕓苔屬蔬菜或楊樹。如本文中使用的術(shù)語″植物″包括完整的植物、植物的祖先和后代和植物部分，包括種子、果實(shí)、嫩芽、莖、葉、根(包括塊莖)、花、組織和器官，其中前述每一個(gè)包含如本文中所述的核酸構(gòu)建體。術(shù)語″植物″還包括植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生區(qū)、配偶體、孢子體、花粉和小孢子，同樣地，其中前述每一個(gè)包含如本文中所述的核酸構(gòu)建體。所述方法還可以包括從植物中篩選出包含本文所述的多核苷酸構(gòu)建體和/或具有本文中所述的任何表型(如增加的氮代謝)的那些植物，并且選擇具有所述表型(如增加的氮代謝)的植物。在另一實(shí)施方案中，進(jìn)一步的步驟包括測(cè)量所述植物后代或其部分中的氮代謝，并且與對(duì)照植物比較氮代謝。優(yōu)選地，將后代植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且包含在植物細(xì)胞中遺傳保持的外源的多核苷酸，并且所述方法可以包括驗(yàn)證構(gòu)建體穩(wěn)定整合的步驟。所述方法還可以包括從選擇的后代植物收集種子的另外步驟。本發(fā)明的方面還延伸至從該植物的可收獲部分衍生的、優(yōu)選直接衍生的產(chǎn)物，如干顆粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的植物或其部分的食品和食物補(bǔ)充物。根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面，與對(duì)照植物相比，轉(zhuǎn)基因植物中的氮代謝增加。如本文中使用的根據(jù)本發(fā)明的所有方面的對(duì)照植物是未按照本發(fā)明的方法修飾的植物。因此，未將對(duì)照植物遺傳修飾以表達(dá)編碼hy5的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照植物是野生型植物。對(duì)照植物通常是相同植物物種，優(yōu)選與修飾的植物具有相同的遺傳背景。根據(jù)本發(fā)明的氮代謝包括根據(jù)本發(fā)明增加的nue和氮獲取(no3-的攝取)。根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面使用的術(shù)語″增加″、″改善″或″增強(qiáng)″可交替使用。nue可以定義為土壤中每單位的可獲得的n(包括土壤和肥料中存在的殘留n)的谷物產(chǎn)量。植物的總體n使用效率包含攝取和利用效率并且可以計(jì)算為upe。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照植物相比，nue增加5％-50％以上，例如至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。在另一實(shí)施方案中，與對(duì)照植物相比，氮攝取增加5％-50％以上，例如至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。增加的氮代謝導(dǎo)致增加的產(chǎn)率。因此，本發(fā)明的方法可以用于增加的產(chǎn)率。術(shù)語“產(chǎn)率”包括以下特征的非限制性列表中的一種或多種：早期開花時(shí)間、生物量(植物的生物量(根和/或嫩芽生物量)或種子/谷物生物量)、種子/谷物產(chǎn)率、種子/谷物生存力和萌芽效率、種子/谷物尺寸、谷物淀粉含量、早期活力、綠度值、增加的生長(zhǎng)率、綠色組織延遲的衰老。術(shù)語″產(chǎn)率″通常意為典型地與指定作物、區(qū)域和時(shí)期相關(guān)的經(jīng)濟(jì)值的可測(cè)量產(chǎn)生。個(gè)體植物部分基于其數(shù)量、尺寸和/或重量直接促進(jìn)產(chǎn)率。實(shí)際產(chǎn)率是每年每平方米作物年的產(chǎn)率，其通過用總產(chǎn)量(包括收獲和評(píng)估的產(chǎn)量)除以種植的平方米確定。因此，根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)率包括以下各項(xiàng)的一種或多種，并且可以通過評(píng)價(jià)以下各項(xiàng)中的一種或多種測(cè)量：每株植物增加的種子產(chǎn)率，增加的種子飽滿率，增加的飽滿種子的數(shù)量，增加的收獲指數(shù)，增加的生存力/萌發(fā)效率，增加的種子/蒴果(capsule)/莢/谷粒的數(shù)量或大小，增加的生長(zhǎng)或增加的分枝，例如具有更多分枝的花序，增加的生物量或谷物填充。優(yōu)選地，增加的產(chǎn)率包括增加的谷粒/種子/蒴果/莢數(shù)量，增加的生物量，增加的生長(zhǎng)，增加的花器官和/或增加分枝的花的數(shù)量。相對(duì)于對(duì)照植物產(chǎn)率增加。例如，與對(duì)照植物相比，產(chǎn)率增加2％，3％，4％，5％-50％以上，例如，至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。如上文所述的用于增加植物中氮代謝的方法(包括在植物中引入并表達(dá)包含植物hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體)可以包括進(jìn)一步的步驟，所述步驟包括評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物的表型、測(cè)量nue和/或no3-攝取、與對(duì)照植物比較nue和/或no3-攝取、測(cè)量產(chǎn)率和與對(duì)照植物比較產(chǎn)率中的一個(gè)或多個(gè)。用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域中已知的。因此，根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面，將包含hy5核酸的核酸，例如seqdno.1，其功能變體或同系物引入植物并作為轉(zhuǎn)基因表達(dá)。將核酸序列通過稱為轉(zhuǎn)化的過程引入所述植物。如本文所稱的術(shù)語″引入″或″轉(zhuǎn)化″包括將外源的多核苷酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞，而不論用于轉(zhuǎn)移的方法。不論通過器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生能夠后續(xù)克隆繁殖的植物組織，可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并且從其產(chǎn)生整體植物。選擇的特定組織將根據(jù)對(duì)于轉(zhuǎn)化的特定物種可獲得的、并且與其最佳適應(yīng)的克隆繁殖體系變化。示例性的組織靶點(diǎn)包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、現(xiàn)有的分生組織(例如，頂端分生組織、腋芽和根分生組織)，以及誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時(shí)或穩(wěn)定引入宿主細(xì)胞，并且可以保持未整合，例如，作為質(zhì)粒存在。備選地，其可以整合入宿主基因組?？梢噪S后將得到的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞用于以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式再生轉(zhuǎn)化的植物。將外源基因轉(zhuǎn)移到植物的基因組中稱為轉(zhuǎn)化。在很多物種中，植物的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在是常規(guī)技術(shù)。有利地，多種轉(zhuǎn)化方法中的任一種可以用于將目的基因引入合適的祖細(xì)胞。對(duì)于從植物組織或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和再生植物所描述的方法可以用于瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體，電穿孔，增加游離dna攝取的化學(xué)劑，將dna直接注射入植物，粒子槍轟擊，使用病毒或花粉和顯微投影轉(zhuǎn)化。方法可以選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法、電穿孔原生質(zhì)體、顯微注射入植物材料、dna或rna-包被的粒子轟擊、用(非整合型)病毒感染等。轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因作物植物，優(yōu)選通過根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。為了選擇轉(zhuǎn)化的植物，將轉(zhuǎn)化中獲得的植物材料進(jìn)行選擇性條件，從而可以將轉(zhuǎn)化的植物與未轉(zhuǎn)化的植物相區(qū)分。例如，可以種植以上述方式獲得的種子，并且，在起始生長(zhǎng)期之后，通過噴霧進(jìn)行合適的選擇。其他可能性是，如果合適，在滅菌后在使用合適的選擇劑的瓊脂板上種植種子，從而只有轉(zhuǎn)化的種子可以生長(zhǎng)為植物。備選地，對(duì)轉(zhuǎn)化的植物篩選選擇性標(biāo)志物的存在。dna轉(zhuǎn)移和再生后，還可以例如使用dna分析評(píng)價(jià)推定的轉(zhuǎn)化的植物中目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組組成。備選地或另外地，可以使用rna印跡和/或蛋白質(zhì)印跡分析監(jiān)測(cè)新引入的dna的表達(dá)水平，這兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方式繁殖，如通過克隆繁殖或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或t1)轉(zhuǎn)化的植物可以自交并選擇純合的第二代(或t2)轉(zhuǎn)化子，并且t2植物可以隨后進(jìn)一步通過經(jīng)典育種技術(shù)繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的生物可以是多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化子(例如，轉(zhuǎn)化所有的細(xì)胞以含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的組織的嫁接物(例如，在植物中，嫁接到未轉(zhuǎn)化的接穗的轉(zhuǎn)化根莖)。本發(fā)明用于增加植物中氮代謝的方法包括引入并表達(dá)包含植物hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。所述核酸構(gòu)建體優(yōu)選包含與植物hy5核酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)元件。根據(jù)本發(fā)明的所有方面，包括上述方法并且包括如本文中所述的植物、方法和用途，術(shù)語″調(diào)節(jié)元件″在本文中與″控制序列″和″啟動(dòng)子″交替使用，并且所有術(shù)語以寬的范圍考慮，指能夠影響與它們連接的序列的表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序列。術(shù)語″啟動(dòng)子″通常是指位于基因的轉(zhuǎn)錄起始的上游的核酸控制序列，其參與rna聚合酶和其他蛋白的結(jié)合，從而指導(dǎo)可操作連接的核酸的轉(zhuǎn)錄。上述術(shù)語包括的是源自經(jīng)典真核基因組基因(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的tata盒，有或沒有ccaat盒序列)和另外的調(diào)節(jié)元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其響應(yīng)發(fā)育和/或外部刺激或以組織特異的方式改變基因表達(dá)。該術(shù)語內(nèi)還包括的是經(jīng)典的原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在該情況下，其可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語″調(diào)節(jié)元件″還包括賦予、激活或增強(qiáng)細(xì)胞、組織或器官中核酸分子的表達(dá)的合成的融合分子或衍生物?！逯参飭?dòng)子″包含調(diào)控植物細(xì)胞中編碼序列片段的表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。因此，植物啟動(dòng)子不必須是植物來源，而是可以源自病毒或微生物，例如來自攻擊植物細(xì)胞的病毒?！逯参飭?dòng)子″也可以源自植物細(xì)胞，例如源自用本發(fā)明的方法中要表達(dá)的和本文中所述的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物。這也適用于其他″植物″調(diào)節(jié)信號(hào)，如″植物″終止子。用于本發(fā)明的方法的核苷酸序列上游的啟動(dòng)子可以由一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、插入和/或刪除修飾，而不干擾啟動(dòng)子、開放閱讀框(orf)或3′-調(diào)節(jié)區(qū)如終止子或遠(yuǎn)離orf的其他3′調(diào)節(jié)區(qū)任一個(gè)的功能或活性。還可能的是，啟動(dòng)子的活性通過修飾它們序列增加，或它們完全被更有活性的啟動(dòng)子替代，甚至被來自異源生物的啟動(dòng)子替代。對(duì)于植物中的表達(dá)，如上文所述的核酸分子，優(yōu)選與合適的啟動(dòng)子可操作連接或包含合適的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子在正確的時(shí)間點(diǎn)并且以所需的空間表達(dá)模式表達(dá)所述基因。為了鑒別功能等價(jià)的啟動(dòng)子，候選啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式可以例如通過將啟動(dòng)子與報(bào)告基因可操作連接并且測(cè)定報(bào)告基因在植物的不同組織中的表達(dá)水平和模式來分析。合適的公知報(bào)告基因是技術(shù)人員已知的，并且包括例如β-葡糖苷酸酶或β-半乳糖苷酶。如本文中使用的術(shù)語″可操作連接的″是指啟動(dòng)子序列和目的基因之間的功能連接，從而所述啟動(dòng)子序列能夠起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。例如，核酸序列可以使用驅(qū)動(dòng)過表達(dá)的啟動(dòng)子表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的過表意為轉(zhuǎn)基因以高于由其內(nèi)源性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的內(nèi)源性對(duì)應(yīng)物的表達(dá)的水平表達(dá)。例如，過表達(dá)可以使用強(qiáng)啟動(dòng)子，如組成型啟動(dòng)子進(jìn)行?！敖M成型啟動(dòng)子”是指在生長(zhǎng)和發(fā)育的大多數(shù)、但不必要所有階段期間和在多數(shù)環(huán)境條件下，在至少一種細(xì)胞、組織或器官中有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(camv35s或19s)、水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、玉米泛素啟動(dòng)子、核酮糖二磷酸羥化酶(rubisco)小亞基、玉米或苜蓿h3組蛋白、ocs、sad1或2、gos2或產(chǎn)生增強(qiáng)的表達(dá)的任何啟動(dòng)子。備選地，增強(qiáng)的或增加的表達(dá)可以通過使用轉(zhuǎn)錄或翻譯增強(qiáng)子或激活劑實(shí)現(xiàn)，并且可以將增強(qiáng)子結(jié)合入基因以進(jìn)一步增加表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是組成型或強(qiáng)啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)序列是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自以下非限制性列表：hahb1啟動(dòng)子、rd29a(其驅(qū)動(dòng)dreb1a的干旱誘導(dǎo)性表達(dá))，玉米rabl7干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、p5cs1(其驅(qū)動(dòng)脯氨酸生物合成酶p5cs1的干旱誘導(dǎo)型表達(dá))，擬南芥進(jìn)化枝app2c的aba-和干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(abi1，abi2，hab1，pp2ca，hai1，hai2和hai3)或它們相應(yīng)的作物同源物。啟動(dòng)子還可以是組織特異的。這些類型的啟動(dòng)子在現(xiàn)有技術(shù)中描述，但非限制性實(shí)例在下文列出。其他合適的啟動(dòng)子也是技術(shù)人員已知的。組織特異性啟動(dòng)子是在植物發(fā)育期間的特定時(shí)間僅在特定細(xì)胞或組織(如在營(yíng)養(yǎng)組織或生殖組織)中有活性的轉(zhuǎn)錄控制元件。在發(fā)育控制下的組織-特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括僅(或主要僅)在特定組織(如營(yíng)養(yǎng)組織，例如，根或葉，或生殖組織，如果實(shí)、胚珠、種子、花粉、雌蕊(pistols)、花)或任何胚組織或表皮或葉肉中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。生殖組織特異的啟動(dòng)子可以是，例如，胚珠-特異的，胚-特異的，胚乳-特異的，珠被-特異的，種子和種皮-特異的，花粉-特異的，花瓣-特異的，萼片-特異的，或它們的一些組合。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是細(xì)胞類型特異的，例如，保衛(wèi)細(xì)胞-特異的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用綠色組織-特異的啟動(dòng)子。綠色組織包括葉和嫩芽。例如，綠色組織-特異的啟動(dòng)子可以選自玉米正磷酸激酶啟動(dòng)子、玉米磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化酶啟動(dòng)子、水稻磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化酶啟動(dòng)子、水稻小亞基核酮糖二磷酸羥化酶(rubisco)啟動(dòng)子、水稻β擴(kuò)張蛋白exbp9啟動(dòng)子、木豆小亞基核酮糖二磷酸羥化酶(rubisco)啟動(dòng)子、葉肉特異性啟動(dòng)子cab3(warnasooriya，s.n.，和montgomery，b.l.(2009)，plantphysiol149，424-433)或豌豆rbs3a啟動(dòng)子。葉-特異的啟動(dòng)子的實(shí)例還包括二磷酸核酮糖羧化酶(rbcs)啟動(dòng)子。例如，番茄rbcs1、rbcs2和rbcs3a基因在葉和光生長(zhǎng)的幼苗中表達(dá)，僅rbcs1和rbcs2在發(fā)育中的番茄果實(shí)中表達(dá)(meierfebslett.415：91-95，1997)。可以使用由matsuokaplantj.6：311-319，1194描述的幾乎僅在葉片和葉鞘中的葉肉細(xì)胞中高水平表達(dá)的二磷酸核酮糖羧化酶啟動(dòng)子。另一葉-特異的啟動(dòng)子是捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子，參見，例如，shiinaplantphysiol.115：477-483，1997；casalplantphysiol.116：1533-1538，1998。lifebslett.379：117-121，1996描述的擬南芥myb-相關(guān)基因啟動(dòng)子(atmyb5)也是葉-特異的。atmyb5啟動(dòng)子在幼花環(huán)和莖生葉邊緣上的發(fā)育中的葉表皮毛(leaftrichomes)、托葉和表皮細(xì)胞，和未成熟種子中表達(dá)。atmyb5mra在受精和胚發(fā)育的16細(xì)胞階段出現(xiàn)，并且存留超過胚期(heartstage)。另一類型的有用的營(yíng)養(yǎng)組織-特異的啟動(dòng)子是分生組織的啟動(dòng)子，其驅(qū)動(dòng)嫩芽尖端中的表達(dá)。例如，可以使用″shootmeristemless″和″scarecrow″啟動(dòng)子，它們?cè)诎l(fā)育中的嫩芽或根頂端分生組織中有活性，由dilaurenzio，cell86：423-433，1996；和long，nature379：66-69，1996描述。另一有用的啟動(dòng)子是這樣的啟動(dòng)子，其控制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶hmg2基因的表達(dá)，其表達(dá)限于分生組織和花(柱頭的分泌區(qū)、成熟花粉粒、雌蕊群脈管組織和受精的胚珠)組織(參見，例如，enjutoplantcell.7：517-527，1995)。還可用的是來自玉米和其他物種的knl-相關(guān)基因，其表現(xiàn)分生組織-特異的表達(dá)，參見，例如，grangerplantmol.biol.31：373-378，1996；kerstetterplantcell6：1877-1887，1994；hakephilos.trans.r.soc.lond.b.biol.sci.350：45-51，1995。本發(fā)明還涉及遺傳改變的植物，其包含hy5核酸序列和組織特異性調(diào)節(jié)序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物包含含有hy5核酸序列和組織特異性調(diào)節(jié)序列的核酸構(gòu)建體。術(shù)語hy5核酸序列和組織特異性調(diào)節(jié)序列在本文中其他地方描述。優(yōu)選地，組織特異性調(diào)節(jié)序列是葉或嫩芽特異性的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物不是擬南芥。本發(fā)明還延伸至轉(zhuǎn)基因植物，其包含含有hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述植物不是擬南芥。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，其包含與組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的植物hy5核酸序列。組織特異性啟動(dòng)子可以選自如上文所述的綠色組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明還涉及表達(dá)載體，其包含含有與組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的植物hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明涉及分離的宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化有如上文所述的核酸構(gòu)建體或載體。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，如根癌土壤桿菌，或分離的植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)基或試劑盒，所述試劑盒包含培養(yǎng)基和如上文所述的分離的宿主細(xì)胞。上文所述的核酸構(gòu)建體或載體可以用于使用本領(lǐng)域中已知的轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及上述核酸構(gòu)建體或載體在增加植物中氮代謝方面的用途。在另一方面，本發(fā)明涉及包含hy5核酸序列和組織特異性啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體或載體在增加植物根中hy5水平方面的用途。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有增加的氮代謝的植物的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含與綠色組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。在另一方面，本發(fā)明涉及用于增加植物根中hy5蛋白的存在的方法，其包括在植物引入并表達(dá)包含與綠色組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明人還證明了hy5調(diào)節(jié)c和n代謝之間的平衡。編碼與蔗糖形式的固定碳的利用度相關(guān)的蛋白(例如tps1)或編碼蔗糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)體(例如sweet11和12)的基因轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)豐度在hy5幼苗(缺少hy5)中強(qiáng)烈降低，提示hy5調(diào)節(jié)蔗糖合成和c代謝的遷移方面二者。他們還發(fā)現(xiàn)，蔗糖或葡萄糖基本上增強(qiáng)wt植物中的atnrt2.1轉(zhuǎn)錄物豐度和no3-攝取，但在hy5突變體中，這些效應(yīng)基本上降低。高親和力硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)和n-攝取的hy5-依賴性的蔗糖誘導(dǎo)促進(jìn)c和n代謝的協(xié)調(diào)的穩(wěn)態(tài)平衡。因此，本發(fā)明還涉及在植物中調(diào)節(jié)c和n代謝之間的平衡的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，hy5核酸序列與綠色組織特異性啟動(dòng)子可操作連接。本發(fā)明還涉及增加植物根中hy5水平的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)包含與綠色組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的hy5核酸序列的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明還延伸至通過如本文中所述的方法，例如增加硝酸根代謝的方法獲得或可獲得的植物。在另一方面，本發(fā)明涉及突變體植物，即具有增加的內(nèi)源性hy5核酸表達(dá)的植物，其中內(nèi)源性hy5啟動(dòng)子攜帶通過誘變或靶向的基因組編輯引入的突變，并且所述突變導(dǎo)致增加的內(nèi)源性hy5核酸表達(dá)。在該實(shí)施方案中，表達(dá)的增加是相對(duì)于對(duì)照或野生型植物中的水平而言的，如本文中其他地方所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向的基因組編輯用于修飾(例如，插入或改變)hy5啟動(dòng)子、或其功能同系物或變體的核酸序列中的至少一種核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該突變?cè)鰪?qiáng)內(nèi)源性啟動(dòng)子的活性。例如，靶向的基因組修飾可以用于插入至少一個(gè)增強(qiáng)子或啟動(dòng)子位點(diǎn)，如tata盒(tataaa)，gc盒(gggcgg)或caat(ggccaatct)盒，或其功能變體。在另一方面，本發(fā)明涉及具有增加的內(nèi)源性hy5核酸表達(dá)的植物，其中內(nèi)源性hy5核酸攜帶通過誘變或靶向的基因組編輯引入的突變，其導(dǎo)致所述核酸的增加的表達(dá)。在另一方面，本發(fā)明涉及具有增加的hy5核酸表達(dá)的植物，其中hy5表達(dá)通過將一個(gè)以上額外拷貝的hy5核酸結(jié)合入植物基因組而增加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)合基因組編輯實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，hy5核酸是seqidno：1或2或其功能同系物或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)源性啟動(dòng)子是seqidno：35或其功能同系物或變體。在本發(fā)明的另一方面中，提供增加植物中氮代謝的方法，所述方法包括將至少一種突變引入內(nèi)源性hy5序列或其調(diào)節(jié)序列中以增強(qiáng)內(nèi)源性hy5核酸的表達(dá)。還提供的是產(chǎn)生具有增加的氮攝取的植物的方法，增加植物根中hy5蛋白的存在的方法，調(diào)節(jié)植物中c和n代謝之間平衡的方法和增加植物根中hy5蛋白的存在的方法，其中所述方法包括將至少一種突變引入內(nèi)源性(即天然或天生的)hy5序列或其調(diào)節(jié)序列以增強(qiáng)內(nèi)源性hy5核酸的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)突變使用靶向的基因組編輯引入。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向的基因組編輯用于修飾(例如，插入或改變)hy5啟動(dòng)子、或其功能同系物或變體的核酸序列中的至少一個(gè)核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該突變?cè)鰪?qiáng)內(nèi)源性啟動(dòng)子的活性。例如，靶向的基因組修飾可以用于插入至少一個(gè)增強(qiáng)子或啟動(dòng)子位點(diǎn)，如tata盒(tataaa)、gc盒(gggcgg)或caat(ggccaatct)盒，或其功能變體。在另一實(shí)施方案中，靶向的基因組編輯用于將一個(gè)以上另外拷貝的hy5核酸結(jié)合入植物基因組。在一個(gè)實(shí)施方案中，hy5核酸是seqidno：1或2或其功能同系物或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)源性啟動(dòng)子是seqidno：35或其功能同系物或變體。在上述實(shí)施方案中，‘內(nèi)源性’核酸可以指植物基因組中天生的或天然的序列。靶向的基因組修飾或靶向的基因組編輯是通過同源重組(hr)-介導(dǎo)的重組事件使用靶向的dna雙鏈斷裂(dsbs)刺激基因組編輯的基因組工程技術(shù)。為了通過引入位點(diǎn)-特異的dnadsb實(shí)現(xiàn)有效的基因組編輯，可以使用四種主要類型的可定制dna結(jié)合蛋白：來源于微生物移動(dòng)遺傳元件的大范圍核酸酶(meganucleases)，基于真核轉(zhuǎn)錄因子的zf核酶，來自黃單胞菌屬細(xì)菌(xanthomonasbacteria)的轉(zhuǎn)錄激活劑樣效應(yīng)子(tales)，和來自ii型細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)crispr(規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù))的rna-引導(dǎo)的dna核酸內(nèi)切酶cas9。大范圍核酸酶、zf和tale蛋白均通過蛋白-dna相互作用識(shí)別特定的dna序列。盡管大范圍核酸酶整合核酸酶和dna-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，zf和tale蛋白分別由靶向dna的3或1個(gè)核苷酸(nt)的個(gè)體模塊組成。zf和tale可以以所需的組合組裝并且連接于foki的核酸酶結(jié)構(gòu)域以引導(dǎo)針對(duì)特定基因組基因座的溶核活性。在通過細(xì)菌iii型分泌體系遞送到宿主細(xì)胞中時(shí)，tal效應(yīng)子進(jìn)入核，結(jié)合宿主基因啟動(dòng)子中的效應(yīng)子-特異的序列并激活轉(zhuǎn)錄。它們的靶向特異性由串聯(lián)的33-35個(gè)氨基酸重復(fù)的中央結(jié)構(gòu)域決定。這接著單個(gè)截短的20個(gè)氨基酸的重復(fù)。大多數(shù)檢查的天然存在的tal效應(yīng)子具有12和27個(gè)完全重復(fù)。這些重復(fù)彼此僅區(qū)別于兩個(gè)相鄰的氨基酸，它們的重復(fù)-可變二殘基(rvd)。決定tal效應(yīng)子將識(shí)別哪個(gè)單個(gè)核苷酸的rvd：一個(gè)rvd對(duì)應(yīng)于一個(gè)核苷酸，四種最常見的rvd各自優(yōu)選與四種堿基之一相關(guān)聯(lián)。天然存在的識(shí)別位點(diǎn)一致地在tal效應(yīng)子活性所需的t之后。tal效應(yīng)子可以融合于foki核酸酶的催化結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生tal效應(yīng)子核酸酶(talen)，其在體內(nèi)產(chǎn)生靶向的dna雙鏈斷裂(dsbs)用于基因組編輯。該技術(shù)在基因組編輯中的使用在本領(lǐng)域中得到充分的描述，例如在us8,440,431，us8,440,432和us8,450,471中描述。參考文獻(xiàn)38描述了一組定制的質(zhì)粒，其可以與goldengate克隆方法一起使用以組裝多個(gè)dna片段。如其中所述的，goldengate方法使用iis型限制性核酸內(nèi)切酶，其在其識(shí)別位點(diǎn)外側(cè)切割產(chǎn)生獨(dú)特的4bp突出。克隆通過在同一反應(yīng)混合物中消化和連接來加速，原因在于正確組裝消除了酶識(shí)別位點(diǎn)。定制的talen或tal效應(yīng)子構(gòu)建體的組裝涉及兩個(gè)步驟：(i)將重復(fù)模塊組裝為1-10個(gè)重復(fù)的中間陣列，和(ii)將中間陣列連接為骨架以制備最終的構(gòu)建體?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的各個(gè)方面使用的另一基因組編輯方法是crispr。該技術(shù)在基因組編輯中的使用在本領(lǐng)域中得到充分描述，例如在us8,697,359和本文引用的參考文獻(xiàn)中充分描述。簡(jiǎn)言之，crispr是參與抵御入侵的噬菌體和質(zhì)粒的微生物核酸酶體系。微生物宿主中的crispr基因座含有crispr-相關(guān)(cas)基因以及能夠編程crispr-介導(dǎo)的核酸切割(sgrna)的特異性的非編碼rna元件的組合。在寬范圍的細(xì)菌宿主中鑒定了三種類型的(i-iii)crispr體系。各個(gè)crispr基因座的一個(gè)關(guān)鍵特征是由短的非重復(fù)序列區(qū)段(間隔臂)間隔的重復(fù)序列(同向重復(fù)(directrepeats))陣列的存在。非編碼crispr陣列被轉(zhuǎn)錄，并且在同向重復(fù)內(nèi)切割為含有個(gè)體間隔臂序列的短的crrna，其引導(dǎo)cas核酸酶至靶位點(diǎn)(原間隔(protospacer))。ii型crispr是最充分表征的體系之一，并且在四個(gè)順序步驟中攜帶靶向的dna雙鏈斷裂。第一，兩個(gè)非編碼rna，即前-crrna陣列和tracrrna，從crispr基因座轉(zhuǎn)錄。第二，tracrrna與前-crrna的重復(fù)區(qū)雜交，并且介導(dǎo)前-crrna加工為含有個(gè)體間隔臂序列的成熟crrna。第三，成熟crrna：tracrrna復(fù)合體通過通過crrna上的間隔臂和與原間隔相鄰基序(pam)相鄰的靶dna上的原間隔之間的沃森克里克堿基配對(duì)將cas9引導(dǎo)至靶dna，這是對(duì)于靶標(biāo)識(shí)別另外所需的。最后，cas9調(diào)控靶dna的切割以在原間隔內(nèi)產(chǎn)生雙鏈斷裂。因此，cas9是ii型crispr-cas體系的標(biāo)志蛋白，并且是大的單體dna核酸酶，其被兩個(gè)非編碼rna(crisprrna(crrna)和反激活crrna(tracrrna))的復(fù)合體被引導(dǎo)至與pam(原間隔相鄰基序)序列基序相鄰的dna靶序列。cas9蛋白含有兩個(gè)與ruvc和hnh核酸酶同源的核酸酶結(jié)構(gòu)域。hnh核酸酶結(jié)構(gòu)域切割互補(bǔ)dna鏈，而ruvc-樣結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈，并且由此在靶dna中引入鈍性切割。cas9連同sgrna的異源表達(dá)可以將位點(diǎn)-特異的雙鏈斷裂(dsbs)引入來自各種生物的活細(xì)胞的基因組dna。為了應(yīng)用于真核生物，使用cas9的密碼子優(yōu)化版本，其初始來自細(xì)菌釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)。單個(gè)引導(dǎo)rna(sgrna)是crispr/cas體系的第二組分，其與cas9核酸酶形成復(fù)合體。sgrna是通過將crrna與tracrrna融合產(chǎn)生的合成的rna嵌合體。位于其5′末端的sgrna引導(dǎo)序列賦予dna靶標(biāo)特異性。因此，通過修飾引導(dǎo)序列，可能產(chǎn)生具有不同靶標(biāo)特異性的sgrna。引導(dǎo)序列的典型長(zhǎng)度是20bp。在植物中，已經(jīng)使用植物rna聚合酶iii啟動(dòng)子(如u6和u3)來表達(dá)sgrna。本發(fā)明的方法中使用的cas9表達(dá)質(zhì)?？梢匀绫绢I(lǐng)域中描述進(jìn)行構(gòu)建。因此，本發(fā)明的方面涉及靶向的誘變方法，特別是基因組編輯，并且在優(yōu)選的實(shí)施方案中，排除僅基于通過傳統(tǒng)育種方法產(chǎn)生植物的實(shí)施方案。在本發(fā)明另一方面，提供檢測(cè)具有增加的或高的hy5表達(dá)水平和/或增加的或高的氮代謝水平的植物品種的篩選方法，所述方法包括在至少一種植物中檢測(cè)hy5表達(dá)水平，并且選擇具有最高或較高h(yuǎn)y5表達(dá)水平所述一種或多種植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇的植物還通過多種方式，如上文所述的那些繁殖。術(shù)語hy5和植物在上文定義。前述公開內(nèi)容提供包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的主題的一般描述，包括制備和使用本發(fā)明的方法，以及其最佳方式，提供以下實(shí)例以進(jìn)一步使得本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明，并提供其完整的書面描述。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，這些實(shí)例的具體內(nèi)容不應(yīng)該理解為限制本發(fā)明，其范圍應(yīng)該從本公開所附的權(quán)利要求和其等價(jià)物理解。根據(jù)本公開內(nèi)容，本發(fā)明的各種其他方面和實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的?！搴?或″在本文中使用的情況下要認(rèn)為是兩個(gè)指定特征或成分的每一個(gè)與或不與另一個(gè)的具體公開。例如″a和/或b″要理解為(i)a，(ii)b以及(iii)a和b中的每個(gè)的具體公開，就像每個(gè)在本文中單獨(dú)列出。除非上下文另有指示，上述特征的描述的定義不限于本發(fā)明的任何特定方面或?qū)嵤┓桨?，并且等效?yīng)用于描述的所有方面和實(shí)施方案。前述申請(qǐng)，和其中或它們的審查過程中引用的所有文獻(xiàn)和序列登記號(hào)(″申請(qǐng)引用的文獻(xiàn)″)和以及申請(qǐng)引用的文獻(xiàn)中引用或參考的所有文獻(xiàn)，和本文中引用或參考的所有文獻(xiàn)(″本文引用的文獻(xiàn)″)，和本文引用的文獻(xiàn)中引用或參考的所有文獻(xiàn)，連同對(duì)于本文中或本文中通過參考結(jié)合的任何文獻(xiàn)中所述的任何產(chǎn)品的任何制造商的使用說明、說明書、產(chǎn)品說明書和產(chǎn)品小冊(cè)，在此通過參考結(jié)合于本文，并且可以用于本發(fā)明的實(shí)踐。更具體地，所有參考的文獻(xiàn)通過參考結(jié)合至與好像指明各個(gè)個(gè)體文獻(xiàn)具體和分別通過參考結(jié)合相同的程度。實(shí)施例材料和方法植物材料和生長(zhǎng)條件。將擬南芥種子在4℃吸脹三天，然后置于1/2ms培養(yǎng)基上。將漏出的幼苗在22℃暴露于16h光周期。涉及幼苗嫁接的實(shí)驗(yàn)如之前所述進(jìn)行(17)。質(zhì)粒構(gòu)建體。擴(kuò)增hy5cdna并亞克隆入pcamv35s：nos載體(32)。將hy5、suc2和cab3啟動(dòng)子的序列擴(kuò)增并亞克隆入pcamv35s：nos載體，hy5啟動(dòng)子和gfp編碼序列二者也是這樣以產(chǎn)生phy5：gfp表達(dá)盒。將hy5編碼序列克隆入psk-n-tagged-myc載體(33)，并且然后亞克隆入pcamv35s：nos載體。為了制備pcab3：2×gus-tevrs-hy5-gfp融合構(gòu)建體，通過pcr將tev識(shí)別位點(diǎn)(tevrs)融合于2×gus編碼序列的3′-末端，并且將pcr產(chǎn)物引入pcab3：hy5-gfp載體。將tev蛋白酶擴(kuò)增和克隆入pcamv35s：nos載體(32)。為了構(gòu)建phy5：hy5-gfp轉(zhuǎn)基因，將hy5編碼序列克隆入phy5：gfp構(gòu)建體。用于pcr擴(kuò)增的引物序列在表2中給出。轉(zhuǎn)錄物分析。使用trizol試劑(invitrogen，newyork，usa)提取總rna，并且使用m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(promega，wisconsin，usa)反轉(zhuǎn)錄。如前所述進(jìn)行qrt-pcr分析(34)。由三次生物學(xué)重復(fù)代表各個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)至少三次技術(shù)重復(fù)。擬南芥肌動(dòng)蛋白2用作參比基因。相關(guān)引物在表3中給出。免疫印跡分析。粗制蛋白的制備通過在50mmtris-hcl(ph7.5)，150mmkcl，10mmmgcl2，1mmedta，10％甘油，0.1％np-40，1×完全蛋白酶抑制劑(roche)中提取獲得。將等分試樣經(jīng)10％(w/v)sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到hybondecl硝酸纖維素膜上。隨后按照已建立的方案(35)操作膜。分別使用抗-myc抗體(santacruzbiotechnology，santacruz，usa)和抗-gfp抗體(rochediagnosticsgmbh，德國(guó))檢測(cè)myc-hy5和hy5-gfp融合蛋白，并且使用upersignalwestpico化學(xué)發(fā)光底物(thermofisherscientific，waltham，usa)顯現(xiàn)信號(hào)?？偺己偷康臏y(cè)量。將脫水的植物組織研磨，并且使用elementarvariopyrocube分析儀(elementaranalysensystemegmbh，frankfurt，德國(guó))，使用高溫燃燒過程(36)以確定粉末化材料的總碳和氮含量。15no3-攝取活性測(cè)定。如其他地方所述(3)測(cè)定根15no3-流入。將根在80℃干燥過夜，并且使用anca-ms體系(pdzeuropaltd)測(cè)量15n含量。chip-pcr測(cè)定。將hy5和phy5：myc-hy5hy5幼苗在1/2ms板上生長(zhǎng)14天。然后將植物組織的2g等分試樣通過甲醛交聯(lián)固定。如之前所述(37)，chip測(cè)定使用抗-myc抗體(santacruzbiotechnology，santacruz，usa)。dna片段的富集通過qrt-pcr分析確定。進(jìn)行三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。相關(guān)引物序列在表4中給出。emsa測(cè)定。將hy5cdna擴(kuò)增并克隆入pmaltm-c2x載體(newenglandbiolabs，ipswich，usa)。根據(jù)制造商的說明，純化mbp和mbp-hy5融合蛋白。擴(kuò)增dna探針并使用生物素標(biāo)記試劑盒(invitrogen，newyork，usa)用生物素在其3-末端標(biāo)記。使用lightshift化學(xué)發(fā)光emsa試劑盒(thermofisherscientific，waltham，usa)進(jìn)行dna凝膠遷移測(cè)定。使用的引物序列在表5中給出。結(jié)果盡管植物嫩芽和根按照不同的發(fā)育軌跡，但是協(xié)調(diào)其生物學(xué)以在波動(dòng)的環(huán)境中優(yōu)化整體植物性能。代謝吸收的協(xié)調(diào)至關(guān)重要：嫩芽固定大氣中的碳(c；co2)，根獲取土壤離子氮(n；主要是硝酸根(no3-))(1)。因?yàn)閚是必需的，土壤no3-水平常常限制天然和農(nóng)業(yè)環(huán)境中的生產(chǎn)率(2，3)。已知n和c獲取率的調(diào)節(jié)是緊密關(guān)聯(lián)的(4，5)，利用光調(diào)節(jié)這兩個(gè)過程(6)。然而，潛在的調(diào)節(jié)長(zhǎng)距離嫩芽-根通訊的分子機(jī)制尚是未知的。作為調(diào)節(jié)嫩芽-根通訊的明顯報(bào)告子，并且因?yàn)楦ǔ２槐┞队诠?，我們因此確定分開的嫩芽或根照射對(duì)根生長(zhǎng)的影響(圖1a)。我們發(fā)現(xiàn)，野生型(wt)擬南芥(col-0實(shí)驗(yàn)株)幼苗(其嫩芽(僅)暴露于光(s(l)/r(d))的初生根與完全暴露于光(s(l)/r(l)的wt幼苗的初生根具有相似長(zhǎng)度(圖1a-c)。相比之下，wts(d)/r(l)幼苗的根比s(l)/r(d)幼苗的短，并且與s(d)/r(d)幼苗具有相似長(zhǎng)度(圖1b，c)。此外，s(l)/r(d)幼苗的側(cè)根增殖類似于s(l)/r(l)的，而s(d)/r(l)幼苗的側(cè)根增殖少得多，類似于s(d)/r(d)的側(cè)根增殖(圖7)。因此，嫩芽照射最可能通過嫩芽-至-根信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)根生長(zhǎng)。我們接著篩選在嫩芽-照射促進(jìn)的根生長(zhǎng)方面被特異性破壞的擬南芥突變體，并且發(fā)現(xiàn)，它們之一含有新的hy5功能缺失等位基因(hy5-526；圖1b；圖8)。進(jìn)一步分析表明，hy5無效等位基因(7；圖8)也消除嫩芽-照射促進(jìn)的根生長(zhǎng)(圖1c)。hy5編碼光敏形態(tài)發(fā)生的bzip轉(zhuǎn)錄因子hy5(8)。hy5由cop1泛素連接酶調(diào)節(jié)，所述泛素連接酶靶向hy5，用于在黑暗中的蛋白質(zhì)降解(9，10)。因此，我們發(fā)現(xiàn)，功能缺失copl-4突變體模擬暗生幼苗中根生長(zhǎng)的嫩芽-照射促進(jìn)(圖1c)。這些結(jié)果提示，hy5調(diào)控根生長(zhǎng)的嫩芽-照射促進(jìn)。我們接著發(fā)現(xiàn)，wt根no3-攝取由嫩芽的照射促進(jìn)，但不由根的照射促進(jìn)(圖1d)。no3-由植物經(jīng)由雙重低親和力/高親和力chl1/nrt1.1/npf6.3和高親和力nrt2.1轉(zhuǎn)運(yùn)子攝取(11-15)。嫩芽-照射促進(jìn)的no3-攝取在缺乏nrt2.1的nrt2.1-2突變體中大量減少，但在缺乏chl1/nrt1.1/npf6.3的chl1-5突變體中相對(duì)不受影響(圖1d)，表明根no3-攝取的嫩芽-照射促進(jìn)是顯著nrt2.1-依賴性的。此外，嫩芽-照射促進(jìn)的根no3-攝取在hy5和hy5-526二者中大量消除(圖1d)，這提示hy5調(diào)節(jié)nrt2.1-依賴性的對(duì)根no3-攝取的嫩芽-照射促進(jìn)。隨后的實(shí)驗(yàn)使用下胚軸移植嵌合體，并且發(fā)現(xiàn)hy5接穗允許根生長(zhǎng)和no3-攝取的嫩芽-照射促進(jìn)(相對(duì)于hy5-526接穗；圖1e，f)，這提示hy5-依賴性的嫩芽-衍生的信號(hào)調(diào)節(jié)根no3-攝取。為了確定hy5是否是該信號(hào)(的部分)，我們接著使用非組織特異性phy5(8)、光合組織-特異的pcab3(16，17)或韌皮部伴細(xì)胞-特異的psuc2啟動(dòng)子(18)在hy5中表達(dá)編碼hy5-gfp或myc-hy5融合蛋白的轉(zhuǎn)基因，發(fā)現(xiàn)hy5-gfp和myc-hy5二者補(bǔ)充hy5表型(圖9)，并且因此保留hy5活性。我們還發(fā)現(xiàn)phy5：hy5-gfp、pcab3：hy5-gfp和psuc2：hy5-gfp全部恢復(fù)hy5的初生根生長(zhǎng)的嫩芽照射調(diào)節(jié)(圖2a)。因?yàn)閜cab3-驅(qū)動(dòng)的表達(dá)是光合組織-特異性的，這些觀察結(jié)果提示hy5轉(zhuǎn)錄物、hy5、或hy5-依賴性的信號(hào)從嫩芽移動(dòng)到根。我們接著發(fā)現(xiàn)hy5-gfp可在s(l)/r(d)phy5：hy5-gfphy5幼苗的整個(gè)根中檢測(cè)，但在s(d)/r(d)中不被檢測(cè)到(圖2b)，這提示hy5在暗生根中相對(duì)穩(wěn)定，并且特別是根hy5豐度受嫩芽照射調(diào)節(jié)。我們此外在s(l)/r(d)pcab3：hy5-gfphy5幼苗的根中檢測(cè)到hy5-gfp，但在s(d)/r(d)對(duì)照中沒有檢測(cè)到(圖2c)，這暗示hy5轉(zhuǎn)錄物、或hy5(或二者)從嫩芽移動(dòng)到根。我們接著比較pcab3：myc-hy5hy5幼苗中myc-hy5轉(zhuǎn)錄物和myc-hy5的分布(圖2d，e)。盡管myc-hy3轉(zhuǎn)錄物僅可在s(l)/r(d)嫩芽中檢測(cè)到(圖2d)，myc-hy5在s(l)/r(d)嫩芽和根中檢測(cè)到(圖2e)。該結(jié)果通過檢測(cè)s(l)/r(d)-生長(zhǎng)的pcab3：hy5-gfphy5/hy5嫁接嵌合體的根中的hy5-gfp確認(rèn)(圖2f；圖10)。利用phy3：hy5-gfphy5幼苗的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)在嫁接的植物的s(l)/r(d)砧木根中檢測(cè)hy5-gfp(圖11)，這提示在韌皮部脈管中hy5從嫩芽移動(dòng)到根。我們接著從pcab3表達(dá)融合的hy5-gfp、tevrs(tev蛋白酶識(shí)別位點(diǎn))和雙β-葡糖苷酸酶(2×gus)(2×gus-tevrs-hy5-gfp)蛋白。在嫩芽中檢測(cè)到該蛋白，但在s(l)/r(d)植物的根中沒有檢測(cè)到，可能因?yàn)槠湎鄬?duì)大的尺寸阻止嫩芽-根移動(dòng)(圖2g；圖12)。然而，35s：tevp(表達(dá)tev蛋白酶)的共表達(dá)使得能夠在tevrs切割(19)，這導(dǎo)致在嫩芽和根中檢測(cè)到hy5-gfp(圖2g；圖12)。hy5-gfp移動(dòng)性的這些變化平行地反映了對(duì)嫩芽-照射促進(jìn)的初生根生長(zhǎng)(圖2h)和no3-攝取(圖2i)的影響。這些結(jié)果表明，hy5的嫩芽-根移動(dòng)是嫩芽-照射促進(jìn)的根生長(zhǎng)和no3-攝取所必需的。有趣的是，hyh，即一種與hy5密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑(20)，不是嫩芽-根移動(dòng)型的(圖13)。因此，hy5(但不是hy5mrna)是調(diào)控根生長(zhǎng)和no3-攝取的光調(diào)節(jié)的嫩芽-根移動(dòng)信號(hào)。由phy5：hy5-gfp(圖2b)、pcab3：hy5-gfp(圖2c)和phy5：hy5-gfphy5/hy5嫁接嵌合體(圖11)賦予hy5根的hy5-gfp分布不同。phy5：hy5-gfp導(dǎo)致hy5-gfp在整個(gè)根中檢測(cè)到，而pcab3：hy5-gfp和phy5：hy5-gfphy5/hy5幼苗賦予與根脈管系統(tǒng)更密切相關(guān)的hy5-gfp位置。該差異可能是因?yàn)閔y5激活根hy5表達(dá)。首先，在hy5中，phy5：gfp轉(zhuǎn)基因(報(bào)告phy5活性)的根表達(dá)的嫩芽-照射誘導(dǎo)降低(圖2j)，這提示源自嫩芽的hy5通常激活根phy5。第二，hy5-gfp可在嫩芽-照射的pcab3：myc-hy5hy5/phy5：hy5-gfphy5嫁接物的根中檢測(cè)到，但在嫩芽-照射的hy5/phy5：hy5-gfphy5嫁接物的根中不能檢測(cè)到(圖2k)。第三，使用phy5：myc-hy5hy5幼苗的根的emsa測(cè)定和chip分析確認(rèn)hy5對(duì)phy5的結(jié)合(21；圖14)。這些觀察結(jié)果表明，嫩芽-根轉(zhuǎn)移的hy5通過自調(diào)節(jié)反饋環(huán)路激活根hy5。我們接著發(fā)現(xiàn)，根nrt2.1轉(zhuǎn)錄物水平的嫩芽-照射促進(jìn)在hy5中大量消除(圖3a)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，hy5接穗/phy5：hy5-gfphy5砧木或pcab3：hy5-gfphy5接穗/hy5砧木允許根nr72.1轉(zhuǎn)錄物水平的嫩芽-照射-依賴性升高到與在hy5植物中觀察到的相似的程度，但pcab3：hy5-gfphy5接穗/hy5砧木的水平相對(duì)于在hy5植物中觀察到的降低(圖3a)。這些差別效應(yīng)平行反映對(duì)嫩芽-照射和nrt2.1-依賴性的no3-攝取的影響(圖3b)，并且涉及根中對(duì)功能性hy5的需要。chip和emsa測(cè)定表明hy5對(duì)nrt2.1啟動(dòng)子的體內(nèi)和體外結(jié)合(圖3c，d)，這表明hy5直接調(diào)節(jié)nrt2.1表達(dá)。綜上，這些結(jié)果提示嫩芽-根移動(dòng)性的hy5通過由根hy5的自活化放大的機(jī)制激活根nrt2.1，由此增加no3-攝取。近期的研究表明hy5部分通過控制葉綠素生物合成和光合成相關(guān)的基因(例如八氫番茄紅素合酶(phytoenesynthase)(psy，圖3e))的表達(dá)調(diào)整光合成能力(22，23)。固定的c以蔗糖的形式經(jīng)韌皮部主要轉(zhuǎn)運(yùn)到下沉組織(sinktissues)(例如，根)(24)，并且海藻糖前體海藻糖-6-磷酸鹽(t6p)用作光合成的碳水化合物狀態(tài)的代替物(25)。我們還發(fā)現(xiàn)，hy5通過促進(jìn)tps1(編碼海藻糖-6-磷酸鹽合酶的基因(25))以及sweet11和sweet12(編碼蔗糖流出轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因)的表達(dá)水平(24)影響蔗糖代謝和嫩芽-根轉(zhuǎn)運(yùn)(圖3e)。進(jìn)一步的chip實(shí)驗(yàn)確認(rèn)hy5對(duì)tps1、sweet11和sweet12啟動(dòng)子的結(jié)合(圖3f)。因此，hy5調(diào)節(jié)c固定和輸入韌皮部細(xì)胞，用于嫩芽-根遷移。因?yàn)閏-狀態(tài)調(diào)節(jié)n-狀態(tài)(4，5)，我們接著確定糖水平是否影響根nrt2.1轉(zhuǎn)錄物水平和光-調(diào)節(jié)的nrt2.1-依賴性的no3-攝取。我們發(fā)現(xiàn)糖(蔗糖或葡萄糖)增強(qiáng)nrt2.1表達(dá)和no3-攝取的嫩芽-照射促進(jìn)(在hy5中大量消除的作用)(圖3g，h；圖15)。此外，chip測(cè)定表明，蔗糖促進(jìn)光激活的myc-hy5對(duì)nrt2.1啟動(dòng)子的體內(nèi)結(jié)合，并且該效應(yīng)在糖不敏感型突變體sis4中消除(圖3i)。因?yàn)閔y5啟動(dòng)子活性和hy5-gfp豐度都不由蔗糖增加(圖16)，增加的hy5水平不可能促進(jìn)蔗糖誘導(dǎo)的myc-hy5對(duì)nrt2.1啟動(dòng)子結(jié)合親和力的增加。不論何種機(jī)制，nrt2.1表達(dá)和no3-攝取的蔗糖誘導(dǎo)依賴于hy5(圖17)。綜上，hy5蛋白移動(dòng)促進(jìn)c和n代謝的協(xié)調(diào)的穩(wěn)態(tài)平衡。因?yàn)槿肷涔饽芰棵芏?incidentlightfluence)的天然波動(dòng)影響c-固定(26)和hy5豐度(27)二者，我們因此確定增加能量密度(5-100μmol.s-1.m-2)對(duì)根生長(zhǎng)和no3-攝取的影響。我們發(fā)現(xiàn)增加能量密度促進(jìn)wt初生根延伸長(zhǎng)度(圖4a)和no3-攝取(圖4b)，這引起生物量積累的能量密度-依賴性的增加(圖4c)。然而，這些能量密度-依賴性效應(yīng)在hy5中大量消除(圖4a-c)。我們接著確定hy5是否在更成熟的植物中繼續(xù)協(xié)調(diào)生長(zhǎng)、c和n代謝。首先，我們發(fā)現(xiàn)，缺少hy5降低21-日齡土壤-生長(zhǎng)的植物的生物量，隨增加的能量密度增加的效應(yīng)(圖4d，圖18)。接著，我們發(fā)現(xiàn)21-日齡wt和hy5完整植物的c含量隨著增加的能量密度相對(duì)不變(圖4e)。相比之下，盡管wt完整植物的n含量保持相對(duì)不變，但是hy5的n含量隨能量密度增加顯著下降(圖4f)。結(jié)果，缺少hy5引起c/n含量比的能量密度-依賴性的增加(其在wt中保持相對(duì)不變；圖4g)。這些結(jié)果提示，移動(dòng)hy5調(diào)節(jié)嫩芽和根生長(zhǎng)、c和n獲取的協(xié)調(diào)。尤其是，hy5在改變的光能量密度維持c和n代謝的穩(wěn)態(tài)平衡。盡管之前的研究表明，在擬南芥的早期幼苗發(fā)育期間韌皮部-移動(dòng)的蔗糖作為來源于子葉的信號(hào)以控制初生根延伸(28)，調(diào)節(jié)側(cè)根生長(zhǎng)和n攝取的嫩芽-根長(zhǎng)距離信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制仍然不清楚(29)。這里，我們表明hy5是調(diào)控嫩芽生長(zhǎng)和c吸收與根生長(zhǎng)和n攝取的光調(diào)節(jié)的關(guān)聯(lián)的嫩芽-根移動(dòng)信號(hào)。該關(guān)聯(lián)通過嫩芽中c固定的hy5-調(diào)節(jié)以及通過根中hy5-依賴性的n-攝取的蔗糖-增強(qiáng)的促進(jìn)來實(shí)現(xiàn)。結(jié)果，hy5調(diào)控完整植物c相對(duì)于完整植物n狀態(tài)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。已經(jīng)已知在植物生長(zhǎng)和發(fā)育的控制中，hy5整合多種植物激素(例如，脫落酸)和環(huán)境(例如，低溫)信號(hào)傳導(dǎo)輸入(30，31)。我們關(guān)于hy5是移動(dòng)信號(hào)的發(fā)現(xiàn)對(duì)該知識(shí)增加另外的維度。我們的關(guān)于hy5移動(dòng)調(diào)控c和n代謝的穩(wěn)態(tài)協(xié)調(diào)的發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)對(duì)如何在波動(dòng)的環(huán)境中維持植物c和n營(yíng)養(yǎng)平衡的理解，并且提示改善作物種營(yíng)養(yǎng)使用效率的新策略。hy5同源物的鑒別兩個(gè)蛋白序列之間同一性的百分?jǐn)?shù)通過將匹配數(shù)除以總位置(包括缺口位置)來獲得。表1：hy5同源物同一性(基于蛋白序列)at：擬南芥(arabidopsisthaliana)；bn：歐洲油菜(brassicanapus)；gb：海島棉(gossypiumbarbadense)；gm：大豆(glycinemax)；hv：大麥(hordeumvulgare)；ta：普通小麥(triticumastivum)；os：水稻(oryzasativa)；so：甘蔗(saccharumofficinarum)；zm：玉米(zeamays)；sm：江南卷柏(selaginellamoellendorffii)；pp：小立碗蘚(physcomitrellapatens)。擬南芥中的pphy5的表達(dá)和擬南芥中oshy5的表達(dá)(圖5)為了研究是否存在hy5功能的進(jìn)化保守性，我們接著產(chǎn)生在hy5中使用擬南芥hy5基因的啟動(dòng)子表達(dá)oshy5-gfp和pphy5-gfp融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。我們發(fā)現(xiàn)pathy5：oshy5-gfp和pathy5：pphy5-gfp補(bǔ)充hy5下胚軸延伸表型(圖5a)。我們還發(fā)現(xiàn)，pathy3：oshy5-gfp和pathy5：pphy5-gfp二者恢復(fù)hy5的根分生組織大小和nrt2.1表達(dá)的嫩芽-照射調(diào)節(jié)(圖5b，c)。接著的實(shí)驗(yàn)使用下胚軸嫁接嵌合體，并且發(fā)現(xiàn)，oshy5-gfp和pphy5-gfp的分布可以在嫁接的植物的砧木根中檢測(cè)，這提示pphy5-gfp和oshy5-gfp融合蛋白二者都是移動(dòng)的(圖5d)。參考文獻(xiàn)1.g.coruzzi，d.r.bush，plantphysiol，125，61-64(2001).2.n.m.crawford，plamcell7，859-868(1995).3.c.h.ho，s.h.lin，h.c.hu，y.f.tsay，cell138，1184-1194(2009)4.a.nunes-nesi，a.r.fernie，m.stitt，mol.plant3，973-996(2010).5.p.matt等人，plantcellenviron.24，1119-1137(2001).6.c.lillo，biochem.j.415，11-19(2008).7.h.lian等人，genesdev.25，1023-1028(2011).8.t.oyama，y.shimura，k.okada，genesdev.15，2983-2995(1997).9.l.h.ang等人，mol.cell1，213-222(1998).10.m.t.osterlund，c.s.hardtke，n.wei，x.w.deng，nature405，462-466(2000).11.m.cerezo等人，plantphysiol.127，262-271(2001).12.d.y.little等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.102，13693-13698(2005).13.n.c.huang，k.h.liu，h.j.lo，y.f.tsay，plantcell11，1381-1392(1999).14.c.masclaux-daubresse等人，ann.bot.105，1141-1157(2010).15.q.liu，x.chen，k.wu，x.fu，curropinplantbiol.27，192-198(2015).16.h.an等人，development131，3615-3626(2004).17，l.corbesier等人，science316，1030-1033(2007).18.a.imlau，e.truernit，n.sauer，plantcell11，309-322(1999).19.j.mathieu，n.warthmann，f.küttner，m.schmid，currbiol.19，1055-1060(2007).20.m.holm，l.g.ma，l.j.qu，x.w.deng，genesdev.16，1247-1259(2002).21.n.abbas，j.p.maurya，d.senapati，s.n.gangappa，s.chattopadhyay，plantcell26，1036-1052(2014).22.k.kobayashi，t.obayashi，t.masuda，plantsignalbehav.7，922-926(2012).23.g.toledo-ortiz等人，plosgenet.10，e1004416(2014).24.l.q.chen等人，science335，207-211(2012).25.v.wahl等人，science339，704-707(2013).26.b.moore等人，science300，332-336(2003).27.m.t.osterlund，n.wei，x.w.deng，plantphysiol.124，1520-1524(2000).28.s.kircher，p.schopfer，proc.natl.acad.sci.u.s.a.109，11217-11221(2012).29.b.g.forde，j.a.cole，plantphysiol.131，395-400(2003).30.d.xu等人，plosgenet.10，e1004197(2014).31.r.catalá，j.medina，j.salinas，proc.natl.acad.sci.u.s.a.108，16475-16480(2011).32.s.wang等人，nat.genet.44，950-954(2012).33.s.wang等人，nat.genet.47，949-954(2015).34.h.sun等人，nat.genet.46，652-656(2014).35.c.jiang，x.gao，l.liao，n.p.harberd，x.fu，plantphysiol.145，1460-1470(2007).36.i.matejovic，commun.soilsci.plantanal.24，2213-2222(1993).37.a.v.gendrel，z.lippman，r.martienssen，v.colot，nat.methods2，213-218(2005).38.cermak，t.等人efficientdesignandassemblyofcustomtalenandothertaleffector-basedconstructsfordnatargeting.nucleicacidsres.39(2011).序列信息擬南芥seqidno：1用于構(gòu)建體的athy5cds：atgcaggaacaagcgactagctctttagctgcaagctctttaccatcaagcagcgagaggtcatcaagctctgctccacatttggagatcaaagaaggaattgaaagcgatgaggagatacggcgagtgccggagtttggaggagaagctgtcggaaaagaaacttccggtagagaatctggatcggcgaccggtcaggagcggacacaggcgactgtcggagaaagtcaaaggaagcgagggaggacaccggcggagaaagagaacaagcggctgaagaggttgttgaggaacagagtttcagctcagcaagcaagagagaggaaaaaggcttacttgagcgagttggaaaacagagtgaaagacttggagaacaaaaactctgaacttgaagagcgactctctactcttcagaacgagaaccagatgcttagacatattctgaagaacacaacaggaaacaagagaggaggtggtggtggttctaatgctgatgcaagcctttgaseqidno：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