一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或該序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的編碼同等功能氨基酸序列的由SEQ?ID?No.1衍生的核苷酸序列。本發(fā)明利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，可以獲得光誘導(dǎo)的特異表達(dá)的啟動(dòng)子；利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入到植物基因組中，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定向操作，獲得光誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株；這不僅可以實(shí)現(xiàn)目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的定時(shí)、定點(diǎn)、定量三維調(diào)控，而且為植物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用提供強(qiáng)有力的工具。
【專利說明】一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。【背景技術(shù)】
[0002]植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生命周期是不同的基因在時(shí)間和空間上有序表達(dá)的結(jié)果。高等植物基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互作用。啟動(dòng)子是一段位于基因5’端上游區(qū)的DNA序列，它包含有增強(qiáng)或阻遏基因表達(dá)的序列和對(duì)激素或外界脅迫有應(yīng)答作用的序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過其與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)的。
[0003]植物啟動(dòng)子按其轉(zhuǎn)錄方式可以分為組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，但不具有絕對(duì)性。組成型啟動(dòng)子廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因，如常用于轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的CaMV35S啟動(dòng)子，ubiquitin啟動(dòng)子和actin啟動(dòng)子，它能高效、持續(xù)和非特異的啟動(dòng)外源基因表達(dá)，但外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中組成型表達(dá)也會(huì)帶來很多負(fù)面影響。例如，持續(xù)合成外源基因產(chǎn)物會(huì)增加植物的代謝負(fù)擔(dān)，并且這種高效表達(dá)經(jīng)常是以大量的營(yíng)養(yǎng)消耗為代價(jià)，從而直接影響了植株的生長(zhǎng)發(fā)育，表現(xiàn)為植物生長(zhǎng)延滯、植株矮小、產(chǎn)量降低等；另外，利用組成型啟動(dòng)子可能誘發(fā)基因沉默，影響轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用；并且，隨著人們對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物食品安全問題的越來越多的關(guān)注，組成型啟動(dòng)子也越來越不能滿足現(xiàn)代基因工程育種的要求。與組成型啟動(dòng)子相比，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子只在某些物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下或者植物發(fā)育到特定的階段，才啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。它不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定時(shí)空積累，增加區(qū)域表達(dá)量，提高植株的抗逆性，同時(shí)可避免由組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)外源基因超表達(dá)引起的對(duì)植株發(fā)育的負(fù)面影響，也可以在一定程度上解決轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中的基因沉默和食品安全性問題，是應(yīng)用植物轉(zhuǎn)基因技 術(shù)進(jìn)行基因工程育種的理想啟動(dòng)子。
[0004]光是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的因素之一，因?yàn)樗粌H作為植物感知環(huán)境的信號(hào)來源，還作為光合作用的能量來源。因此，對(duì)光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究有助于了解植物基因光下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制，并應(yīng)用于基因工程中使外源基因伴隨植物生理狀態(tài)適度表達(dá)，同時(shí)維持轉(zhuǎn)基因植株的健康生長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是解決目前分子育種過程中，因使用組成型啟動(dòng)子，使得外源基因持續(xù)大量表達(dá)，而破壞了植物的代謝平衡，阻礙植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的問題，提供一種新的植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子序列及其應(yīng)用。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示，全長(zhǎng)序列為1567bp ;該序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的編碼同等功能氨基酸序列的由SEQ ID N0.1衍生的核苷酸序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0007]本發(fā)明還提供了上述光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子的構(gòu)建方法，具體步驟為:以玉米基因組DNA為模板，根據(jù)ZmRBCS-1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得上述光誘導(dǎo)型
基因啟動(dòng)子。
[0008]優(yōu)選地，所述玉米為B73系。
[0009]所述特異性引物的核苷酸序列為:
[0010]5， -CAAGCTT GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3，；
[0011]5， -GGGATCC CATGGCTGCCTGGCTGC CTAG-3，。
[0012]其中，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C 5min ；94°C 45sec，69°C 45sec，72°C 2min，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保溫保存。
[0013]本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子的引物對(duì)，其核苷酸序列為:
[0014]5， -CAAGCTT GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3，；
[0015]5， -GGGATCC CATGGCTGCCTGGCTGC CTAG-3，。
[0016]本發(fā)明還提供了含上述光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，優(yōu)選為P1-ZmRBCS-1:⑶S。
[0017]本發(fā)明還提供上述啟動(dòng)子在植物基因工程中獲得光誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明還提供上述啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因玉米和水稻中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，可以獲得光誘導(dǎo)的特異表達(dá)的啟動(dòng)子；利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入到植物基因組中，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定向操作，獲得光誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株；這不僅可以實(shí)現(xiàn)目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的定時(shí)、定點(diǎn)、定量三維調(diào)控，而且為植物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用提供強(qiáng)有力的工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中玉米Zm-RBCS-1啟動(dòng)子p0片段和pi片段的克隆:A圖中 M 為 DNA maker, I 為 Zm-RBCS-1 啟動(dòng)子 p0 片段；B 圖中 M 為 DNA maker, I 為 Zm-RBCS-1啟動(dòng)子Pl片段。
[0021]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中含有Zm-RBCS-1啟動(dòng)子pO片段和pi片段的pBI121載體質(zhì)粒，酶切位點(diǎn)為Hind III和BamH I的酶切圖。圖中M為DNA maker, I為pO-ZmRBCS-l:GUS利用Hind III /BamH I雙酶切的圖譜，2為p1-ZmRBCS-1 AUS利用Hind III /BamH I雙酶切的圖譜
[0022]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定。A圖中M為DNA maker, I為水稻中花11，2為pO-ZmRBCS-l:⑶S轉(zhuǎn)基因植株；B圖中M為DNA maker，I為水稻中花11，2為P1-ZmRBCS-1 AUS轉(zhuǎn)基因植株。
[0023]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中轉(zhuǎn)基因水稻的葉片、葉鞘在不同光線處理后GUS染色分析結(jié)果。A圖是？0-21111?05-1:^5轉(zhuǎn)基因植株，？0-2111-1?05-1:^5的葉片、葉鞘⑶S染色后沒有變藍(lán)圖是P1-ZmRBCS-1 AUS轉(zhuǎn)基因植株，PO-Zm-RBCS-1 AUS的葉片、葉鞘⑶S染色后都變藍(lán)，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)色越來越深。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0026]實(shí)施例1玉米Zm-RBCS-1啟動(dòng)子pO和pi片段的克隆及序列分析⑴啟動(dòng)子克隆
[0027]生物信息學(xué)分析顯示，Zm-RBCS-1基因的啟動(dòng)子中含有多個(gè)光應(yīng)答的順式作用元件，說明該基因有可能受到光誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明將Zm-RBCS-1基因的序列登錄號(hào)ZM04G24740在Plaza網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)分析，得到包含此基因上游約2227bp (pO)和1567bp(pl)的序列。根據(jù)二者序列分別設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增Zm-RBCS-1的啟動(dòng)子pO和pi片段。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增Zm-RBCS-1啟動(dòng)子pO片段引物為:正向引物5’ -CAAGCTTCTGCAGCGCGCATGGCATCGTG-3’(SEQ ID N0.4), 5'端引入HindIII 酶切位點(diǎn);反向引物 5’-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3’ (SEQ ID N0.3)，3’ 端引入 BamHI 酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 Zm-RBCS-1 啟動(dòng)子 Pl 片段引物為:正向引物 5’-CAAGCTT GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’ (SEQ ID N0.2),5’ 端引入 HindIII 酶切位點(diǎn)；反向引物為 5’-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3’ (SEQ IDN0.3), 3'端引入BamHI酶切位點(diǎn)。利用PCR技術(shù)從玉米B73的基因組DNA上分別擴(kuò)增Zm-RBCS-1啟動(dòng)子的pO和pi片段，得到2227bp和1567bp的PCR產(chǎn)物(圖l)，pl片段的序列如SEQ ID N0.1所示，pO片段的序列如SEQ ID N0.5所示。
[0028]PCR反應(yīng)體系:
【權(quán)利要求】
1.一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的編碼同等功能氨基酸序列的由SEQ ID N0.1衍生的核苷酸序列。
2.一種植物光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子的構(gòu)建方法，具體步驟為:以玉米基因組DNA為模板，根據(jù)ZmRBCS-1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得上述光誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述玉米為B73。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述特異性引物的核苷酸序列為:
5’ -CAAGCTTGGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’ ；
5，-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3，。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C5min ；94°C 45sec，69°C 45sec，72°C 2min，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin，4°C保溫保存。
6.用于擴(kuò)增植物光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的引物，其核苷酸序列為:
5’ -CAAGCTTGGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’ ；
5，-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3，。
7.含權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。
8.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其為pl-ZmRBCS-1:⑶S。
9.權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子在植物基因工程中獲得光誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因玉米、水稻中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103740718SQ201310739014
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】楊建平, 蘇亮, 習(xí)雨琳, 郭林, 孟凡華, 宋梅芳, 侯佩, 方聰燕 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所