本發(fā)明涉及一種蟲草多糖提取工藝，具體地說，涉及一種從蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖的工藝，屬于生物技術領域。
背景技術：
冬蟲夏草的有效成分主要是蟲草多糖，蟲草多糖是由甘露糖、蟲草素、腺苷、半乳糖、阿拉伯糖、木糖精、葡萄糖、巖藻糖組成的多聚糖。
國內(nèi)外大量研究資料表明，蟲草多糖具有抗腫瘤、抗衰老、抗菌、降低血糖等生理活性，同時還是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活免疫細胞依賴的免疫反應來增強機體免疫能力對抗外來病原體如病毒和微生物等。因此，蟲草多糖作為保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品有著廣泛的開發(fā)前景。
目前蟲草多糖的提純多采用傳統(tǒng)方法：水提醇沉法。本方法是將蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液離心后，在上清液中加入乙醇，沉淀后，離心，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑洗滌，再經(jīng)過烘干制得。
現(xiàn)有技術存在以下缺陷：（1）蟲草多糖成品的純度較低；（2）蟲草多糖提取率低；（3）使用大量的有機溶劑，污染大；（4）生產(chǎn)成本高，工藝繁瑣，不利于大量生產(chǎn)。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對以上不足，提供一種從蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖的工藝，以實現(xiàn)以下發(fā)明目的：
1、采用本發(fā)明方法，提高蟲草多糖成品的純度；
2、采用本發(fā)明方法，減少多糖損失，提高蟲草多糖提取率；
3、減少蟲草多糖提取工藝中的有機溶劑用量，減少環(huán)境污染；
4、降低成本，簡化生產(chǎn)工藝。
為解決以上技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：
一種蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖的工藝，所述的工藝包括打漿、水浴浸提、離心、膜分離、真空干燥步驟。
以下是對上述技術特征的進一步改進：
所述的打漿：打漿時的轉(zhuǎn)速為16000～22000 r/min，每打漿1～2min間歇1～2min，打漿次數(shù)為2～12次。
所述的水浴浸提：菌體破碎液與蒸餾水的料水比為：體積比1：1～1：3。
所述的水浴浸提：水浴溫度為85～95℃。
所述的水浴浸提：浸提時間為4～8小時。
所述的離心：將浸提液連續(xù)通過兩個串聯(lián)的管式離心機離心，離心機轉(zhuǎn)速為12000rpm～18000rpm，離心機處理量為1.2 m3/h～1.5 m3/h；
離心后，棄去沉淀，收集上清液。
所述的膜分離包括第一次膜分離：
將離心得到的上清液通過分子質(zhì)量2000 ku的陶瓷膜設備，過濾壓力為：進口壓力為0.5～0.8MPa，出口壓力0.2～0.5MPa；過濾時保持上清液溫度為：35～40℃，上清液流速為1～1.3m3/h。
所述的膜分離還包括第二次膜分離：
將第一次透過液通過分子質(zhì)量100 ku陶瓷膜設備，過濾壓力為：進口壓力為0.5～0.8MPa，出口壓力0.2～0.5Mpa；過濾時保持液體溫度為：35～40℃，液體流速為1～1.3m3/h。
所述的真空干燥：
干燥溫度為57～62℃，時間為20～30h，真空度為0.05～0.06Mpa。
本發(fā)明提取的蟲草多糖的質(zhì)量百分含量為90%以上。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下有益效果：
1、采用本發(fā)明方法制備的蟲草多糖成品純度高，其蟲草多糖含量為90%以上；
2、采用本發(fā)明方法提取蟲草多糖，多糖損失量少，膜分離的提取率高達98.98～99.37%；
3、采用本發(fā)明方法提取蟲草多糖，不需要乙醇等有機溶劑，對環(huán)境無污染；
4、采用本發(fā)明方法提取蟲草多糖，成本低，工藝更簡單。
具體實施方式
本發(fā)明采用的蝙蝠蛾擬青霉（Paecilomyces hepiali）菌株保藏號為CICC 14065。
實施例1 一種蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖的工藝
從蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖，包括如下步驟：
步驟1 打漿
蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵的配方為20%馬鈴薯、2%大豆粉、1%蔗糖、0.3% KH2PO4、0.15% MgSO4·7H2O、0.001%維生素B1、水補齊余量；上述百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)；發(fā)酵完成后，得到發(fā)酵液。
調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓力至0.03MPa，調(diào)節(jié)打漿機壓力為零，利用壓力差將經(jīng)過發(fā)酵的蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液1000L壓到打漿機；加入與發(fā)酵液等體積的水，開啟打漿機打漿，打漿至勻漿狀；
打漿時的轉(zhuǎn)速為16000 r/min，每打漿1min間歇1min，打漿次數(shù)為3次，得菌體破碎液。
步驟2 水浴浸提
調(diào)節(jié)打漿機壓力至0.03MPa，調(diào)節(jié)提取罐壓力為零，利用壓力差將上述菌體破碎液壓到提取罐內(nèi)。向提取罐內(nèi)注入蒸餾水，菌體破碎液與蒸餾水的料水比為：體積比1：1，混合后，使提取罐置于熱水浴中浸提，水浴溫度為85℃，浸提時間為4小時，冷卻后得到浸提液。
步驟3 離心
將上述浸提液連續(xù)通過兩個串聯(lián)的管式離心機離心，離心機轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心機處理量為1.2 m3/h；
離心后，棄去沉淀，收集上清液。
步驟4 膜分離
上清液通過離心機出液管接到中間儲罐中進入膜分離處理程序；
采用兩次膜分離：
第一次膜分離：
將上清液4000L通過分子質(zhì)量2000 ku的陶瓷膜設備，進行過濾，過濾壓力：進口壓力為0.5MPa，出口壓力0.2MPa；過濾時保持上清液溫度為：35℃，上清液流速為1m3/h；
所述陶瓷膜在壓力作用下使上清液中的大于孔徑的物質(zhì)（雜蛋白和殘留的菌體）被陶瓷膜截留，小于孔徑的物質(zhì)（多糖、單糖和無機鹽）透過陶瓷膜，得到3500L第一次透過液和500L第一次截留液，收集第一次透過液；
第二次膜分離：
將第一次透過液通過分子質(zhì)量100 ku陶瓷膜設備，進行過濾，過濾壓力：進口壓力為0.5MPa，出口壓力0.2Mpa；過濾時保持上清液溫度為：35℃，上清液流速為1m3/h；所述陶瓷膜在壓力作用使上清液含大于孔徑的物質(zhì)（多糖）被陶瓷膜截留，小于孔徑的物質(zhì)（單糖和無機鹽）透過陶瓷膜，得到3350L第二次透過液和150L第二次截留液，收集第二次截留液，即為蟲草多糖提取液。
兩次膜分離后蟲草多糖的損失情況見表1：
表1 兩次膜分離對蟲草多糖的影響
由表1可見，第一次膜分離后得到的透過液多糖的濃度為12.89g/L，損失率為0.29%，第二次膜分離后得到的截留液多糖的濃度為299g/L，損失率為0.74%；即得到的蟲草多糖提取液中蟲草多糖含量為299g/L，計算可得，蟲草多糖膜分離的提取率為98.98%。
步驟5 真空干燥
將上述的蟲草多糖提取液進行真空干燥，干燥溫度為57℃，時間為20h，真空度為0.05Mpa，得到蟲草多糖干粉，其中蟲草多糖含量為90%。
實施例2 一種蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖的工藝
從蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖，包括如下步驟：
步驟1 打漿
蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵的配方為20%馬鈴薯、2%大豆粉、1%蔗糖、0.3% KH2PO4、0.15% MgSO4·7H2O、0.001%維生素B1、水補齊余量；上述百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)；發(fā)酵完成后，得到發(fā)酵液。
調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓力至0.03MPa，調(diào)節(jié)打漿機壓力為零，利用壓力差將經(jīng)過發(fā)酵的蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液1000L壓到打漿機；加入與發(fā)酵液等體積的水，開啟打漿機打漿，打漿至勻漿狀；
打漿時的轉(zhuǎn)速為20000 r/min，每打漿1.5min間歇1.5min，打漿次數(shù)為3次，得菌體破碎液。
步驟2 水浴浸提
調(diào)節(jié)打漿機壓力至0.03MPa，調(diào)節(jié)提取罐壓力為零，利用壓力差將上述菌體破碎液壓到提取罐內(nèi)。向提取罐內(nèi)注入蒸餾水，菌體破碎液與蒸餾水的料水比為：體積比1：1，混合后，使提取罐置于熱水浴中浸提，水浴溫度為85℃，浸提時間為4小時，冷卻后得到浸提液。
步驟3 離心
將上述浸提液連續(xù)通過兩個串聯(lián)的管式離心機離心，離心機轉(zhuǎn)速為15000rpm，離心機處理量為1.3 m3/h；
離心后，棄去沉淀，收集上清液。
步驟4 膜分離
上清液通過離心機出液管接到中間儲罐中進入膜分離處理程序；
采用兩次膜分離：
第一次膜分離：
將上清液4000L通過分子質(zhì)量2000 ku的陶瓷膜設備，進行過濾，過濾壓力：進口壓力為0.6MPa，出口壓力0.4MPa；過濾時保持上清液溫度為：38℃，上清液流速為1.1m3/h；
所述陶瓷膜在壓力作用下使上清液中的大于孔徑的物質(zhì)（雜蛋白和殘留的菌體）被陶瓷膜截留，小于孔徑的物質(zhì)（多糖、單糖和無機鹽）透過陶瓷膜，得到3700L第一次透過液和300L第一次截留液，收集第一次透過液；
第二次膜分離：
將第一次透過液通過分子質(zhì)量100 ku陶瓷膜設備，進行過濾，過濾壓力：進口壓力為0.6MPa，出口壓力0.4Mpa；過濾時保持上清液溫度為：38℃，上清液流速為1.1m3/h；所述陶瓷膜在壓力作用使上清液含大于孔徑的物質(zhì)（多糖）被陶瓷膜截留，小于孔徑的物質(zhì)（單糖和無機鹽）透過陶瓷膜，得到3540L第二次透過液和160L第二次截留液，收集第二次截留液，即為蟲草多糖提取液。
兩次膜分離后蟲草多糖的損失情況見表2：
表2 兩次膜分離對蟲草多糖的影響
由表2可見，第一次膜分離后得到的透過液多糖的濃度為12.91g/L，損失率為0.26%，第二次膜分離后得到的截留液多糖的濃度為298g/L，損失率為0.37%；
即蟲草多糖提取液中蟲草多糖含量為298g/L，計算可得，蟲草多糖膜分離的提取率為99.37%。
步驟5 真空干燥
將上述的蟲草多糖提取液進行真空干燥，干燥溫度為60℃，時間為25h，真空度為0.06Mpa，得到蟲草多糖干粉，其中蟲草多糖含量為92%。
實施例3 一種蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖的工藝
從蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖，包括如下步驟：
步驟1 打漿
蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵的配方為20%馬鈴薯、2%大豆粉、1%蔗糖、0.3% KH2PO4、0.15% MgSO4·7H2O、0.001%維生素B1、水補齊余量；上述百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)；發(fā)酵完成后，得到發(fā)酵液。
調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓力至0.03MPa，調(diào)節(jié)打漿機壓力為零，利用壓力差將經(jīng)過發(fā)酵的蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液1000L壓到打漿機；加入與發(fā)酵液等體積的水，開啟打漿機打漿，打漿至勻漿狀；
打漿時的轉(zhuǎn)速為22000 r/min，每打漿2min間歇2min，打漿次數(shù)為3次，得菌體破碎液。
步驟2 水浴浸提
調(diào)節(jié)打漿機壓力至0.03MPa，調(diào)節(jié)提取罐壓力為零，利用壓力差將上述菌體破碎液壓到提取罐內(nèi)。向提取罐內(nèi)注入蒸餾水，菌體破碎液與蒸餾水的料水比為：體積比1：1，混合后，使提取罐置于熱水浴中浸提，水浴溫度為85℃，浸提時間為4小時，冷卻后得到浸提液。
步驟3 離心
將上述浸提液連續(xù)通過兩個串聯(lián)的管式離心機離心，離心機轉(zhuǎn)速為18000rpm，離心機處理量為1.5 m3/h；
離心后，棄去沉淀，收集上清液。
步驟4 膜分離
上清液通過離心機出液管接到中間儲罐中進入膜分離處理程序；
采用兩次膜分離：
第一次膜分離：
將上清液4000L通過分子質(zhì)量2000 ku的陶瓷膜設備，進行過濾，過濾壓力：進口壓力為0.8MPa，出口壓力0.5MPa；過濾時保持上清液溫度為：40℃，上清液流速為1.3m3/h；
所述陶瓷膜在壓力作用下使上清液中的大于孔徑的物質(zhì)（雜蛋白和殘留的菌體）被陶瓷膜截留，小于孔徑的物質(zhì)（多糖、單糖和無機鹽）透過陶瓷膜，得到3500L第一次透過液和500L第一次截留液，收集第一次透過液；
第二次膜分離：
將第一次透過液通過分子質(zhì)量100 ku陶瓷膜設備，進行過濾，過濾壓力：進口壓力為0.8MPa，出口壓力0.5Mpa；過濾時保持上清液溫度為：40℃，上清液流速為1.3m3/h；所述陶瓷膜在壓力作用使上清液含大于孔徑的物質(zhì)（多糖）被陶瓷膜截留，小于孔徑的物質(zhì)（單糖和無機鹽）透過陶瓷膜，得到3340L第二次透過液和160L第二次截留液，收集第二次截留液，即為蟲草多糖提取液。
步驟5 真空干燥
將上述的蟲草多糖提取液進行真空干燥，干燥溫度為62℃，時間為30h，真空度為0.06Mpa，得到蟲草多糖干粉。
兩次膜分離后蟲草多糖的損失情況見表3：
表3 兩次膜分離對蟲草多糖的影響
由表3可見，第一次膜分離后得到的透過液多糖的濃度為12.9g/L，損失率為0.28%，第二次膜分離后得到的截留液多糖的濃度為280g/L，損失率為0.6%；即得到的蟲草多糖提取液中蟲草多糖含量為280g/L，計算可得，蟲草多糖膜分離的提取率為99.13%。
本發(fā)明采用苯酚—硫酸法測定液體樣品中的多糖濃度；
本發(fā)明所述的蟲草多糖膜分離的提取率，計算公式為：
多糖膜分離的提取率（%）=（膜分離前的多糖總量-膜分離過程中損失的多糖量）×100% /膜分離前的多糖總量。
實施例4 打漿步驟中打漿次數(shù)單因素分析實驗
采用實施例2的方法，只改變打漿步驟中的打漿次數(shù)進行實施例4-7；實施例4-7采用的打漿次數(shù)見表4；
表4 實施例4-7采用的打漿次數(shù)
實施例2、4-7 的打漿后得到的打漿破碎液中蟲草多糖含量見表5；
表5 打漿破碎液中蟲草多糖含量
由表5可見，打漿次數(shù)優(yōu)選為9次。
實施例8 水浴浸提步驟中料水比、水浴溫度和浸提時間的正交試驗
采用實施例2的方法，改變料水比、水浴溫度和浸提時間，進行正交實驗，提取蟲草多糖，正交試驗因素具體見表6，正交試驗結(jié)果與分析具體表7、表8；
表6 正交試驗因素水平表
表7正交試驗結(jié)果與分析
表8 方差分析表
從表7和表8可以看出，影響因素A-C中，對水浴浸提得到的蟲草多糖浸提液中蟲草多糖含量的影響程度由大到小為提取溫度＞提取時間＞料水比；經(jīng)試驗，料水比優(yōu)選1：1，浸提時間優(yōu)選6h，水浴溫度優(yōu)選90℃，此時，浸提液中的蟲草多糖含量為62.88 kg，浸提液總量為4000L。
實施例9 一種蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖的工藝
從蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖，包括如下步驟：
步驟1 打漿
蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵的配方為20%馬鈴薯、2%大豆粉、1%蔗糖、0.3% KH2PO4、0.15% MgSO4·7H2O、0.001%維生素B1、水補齊余量；上述百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)；發(fā)酵完成后，得到發(fā)酵液。
調(diào)節(jié)發(fā)酵罐壓力至0.03MPa，調(diào)節(jié)打漿機壓力為零，利用壓力差將經(jīng)過發(fā)酵的蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液1000L壓到打漿機；加入與發(fā)酵液等體積的水，開啟打漿機打漿，打漿至勻漿狀；
打漿時的轉(zhuǎn)速為20000 r/min，每打漿1.5min間歇1.5min，打漿次數(shù)為9次，得菌體破碎液。
步驟2 水浴浸提
調(diào)節(jié)打漿機壓力至0.03MPa，調(diào)節(jié)提取罐壓力為零，利用壓力差將上述菌體破碎液壓到提取罐內(nèi)。向提取罐內(nèi)注入蒸餾水，菌體破碎液與蒸餾水的料水比為：體積比1：1，混合后，使提取罐置于熱水浴中浸提，水浴溫度為90℃，浸提時間為6小時，冷卻后得到浸提液。
步驟3 離心
將上述浸提液連續(xù)通過兩個串聯(lián)的管式離心機離心，離心機轉(zhuǎn)速為15000rpm，離心機處理量為1.3 m3/h；
離心后，棄去沉淀，收集上清液。
步驟4 膜分離
上清液通過離心機出液管接到中間儲罐中進入膜分離處理程序；
采用兩次膜分離：
第一次膜分離：
將上清液4000L通過分子質(zhì)量2000 ku的陶瓷膜設備，進行過濾，過濾壓力：進口壓力為0.6MPa，出口壓力0.4MPa；過濾時保持上清液溫度為：38℃，上清液流速為1.1m3/h；
所述陶瓷膜在壓力作用下使上清液中的大于孔徑的物質(zhì)（雜蛋白和殘留的菌體）被陶瓷膜截留，小于孔徑的物質(zhì)（多糖、單糖和無機鹽）透過陶瓷膜，得到3670L第一次透過液和330L第一次截留液，收集第一次透過液；
第二次膜分離：
將第一次透過液通過分子質(zhì)量100 ku陶瓷膜設備，進行過濾，過濾壓力：進口壓力為0.6MPa，出口壓力0.4Mpa；過濾時保持上清液溫度為：38℃，上清液流速為1.1m3/h；所述陶瓷膜在壓力作用使上清液含大于孔徑的物質(zhì)（多糖）被陶瓷膜截留，小于孔徑的物質(zhì)（單糖和無機鹽）透過陶瓷膜，得到3535L第二次透過液和165L第二次截留液，收集第二次截留液，即為蟲草多糖提取液。
蟲草多糖膜分離的提取率為99.45%。
步驟5 真空干燥
將上述的蟲草多糖提取液進行真空干燥，干燥溫度為60℃，時間為25h，真空度為0.06Mpa，得到蟲草多糖干粉，其中蟲草多糖含量為94.5%。
實施例10 一種蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液中提取蟲草多糖的工藝
采用實施例9的工藝提取蟲草多糖，只改變水浴浸提步驟，改變后的水浴浸提步驟如下：
調(diào)節(jié)打漿機壓力至0.03MPa，調(diào)節(jié)提取罐壓力為零，利用壓力差將上述菌體破碎液壓到提取罐內(nèi)。向提取罐內(nèi)注入蒸餾水，菌體破碎液與蒸餾水的料水比為：體積比1：1，混合后，向浸提罐中加入5L的海藻糖和9L的大豆卵磷脂；
使提取罐置于熱水浴中浸提，水浴溫度為90℃，浸提時間為6小時，冷卻后得到浸提液。
本實施例得到蟲草多糖干粉：蟲草多糖含量為96.8%。
除特殊說明的外，本發(fā)明所述的百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)。
以上所述為本發(fā)明最佳實施方式的舉例，其中未詳細述及的部分均為本領域普通技術人員的公知常識。本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求的內(nèi)容為準，任何基于本發(fā)明的技術啟示而進行的等效變換，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。