本發(fā)明涉及水產(chǎn)食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種具有抗氧化活性的蛋白肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解得到多肽，使其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水區(qū)的活性官能基團(tuán)暴露，隨著肽鍵的裂解，小分子蛋白肽和氨基酸增加，從而可以提供質(zhì)子或電子源，保持較高的氧化還原電位，使其具有清除活性自由基的能力。氧化對(duì)需氧生物特別是脊椎動(dòng)物和人類是一個(gè)重要的代謝過程，但是它卻導(dǎo)致了自由基的形成?；钚匝踝杂苫?ROS)被認(rèn)為能引起氧化應(yīng)激。在食品體系中，脂類或蛋白質(zhì)可能會(huì)受到ROS的攻擊經(jīng)歷氧化過程，從而導(dǎo)致食品產(chǎn)生不愉快味道，顏色發(fā)暗，同時(shí)也可能產(chǎn)生潛在的毒性終產(chǎn)物?？寡趸嚯牡膽?yīng)用能防止食品成分由于捐獻(xiàn)電子給活性氧自由基以及中和活性氧自由基的負(fù)面作用而變質(zhì)?？寡趸脑卺t(yī)學(xué)、化妝品、生物、食品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
化學(xué)合成抗氧化肽不同程度上損傷人體的肝臟、腎臟等器官，部分國(guó)家和地區(qū)已經(jīng)明確限量或禁止使用。因此，研發(fā)高效、安全的天然抗氧化劑成為熱點(diǎn)。食用級(jí)抗氧化肽的安全性要求更高，抗氧化性較其他體內(nèi)抗氧化生物分子更為顯著，可以穩(wěn)定脂質(zhì)或含脂質(zhì)產(chǎn)品。天然的抗氧化多肽因分子量小、易吸收、活性強(qiáng)等特點(diǎn)。目前天然抗氧化肽主要是通過酶解大豆蛋白、奶酪、乳清蛋白、動(dòng)物膠、面筋等各種食物蛋白獲得。最近幾年發(fā)展到海洋產(chǎn)品如海藻、蝦皮、兩棲動(dòng)物裸露皮膚分泌物、真菌等。
有關(guān)天然抗氧化活性肽的制備方法，現(xiàn)有技術(shù)的不足在于大多數(shù)蛋白肽酶解過程中通過添加酸或堿調(diào)節(jié)pH，明顯地影響產(chǎn)品的風(fēng)味，同時(shí)產(chǎn)品的灰分較高。
目前還沒有以魚肉為原料制備抗氧化肽的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是在于提供一種具有抗氧化活性的蛋白肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述蛋白肽的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述蛋白肽的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種具有抗氧化活性的蛋白肽及其制備方法，包括以下步驟:
(1)超聲處理去脂的魚肉漿液；
(2)加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過程無需添加酸或堿調(diào)節(jié)pH值；
(3)對(duì)酶解液離心并取上清液進(jìn)行超濾；
(4)濾液過柱層析分離，收集洗脫峰，洗脫液通過反向高效液相色譜進(jìn)行分離即得。
可選的，所述魚肉為淡水魚肉或海水魚肉。在本發(fā)明的實(shí)施例中選用鳙魚和鱈魚。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(1)所述去脂的魚肉漿液通過以下方法制備得到：洗凈魚肉，用打漿機(jī)將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入0.8-2.0倍魚肉重量的水，在85-95℃下水浴10-15min，再用分散均質(zhì)機(jī)在8000-10000rpm下勻漿1-3min，得魚肉漿液；通過6000-8000g離心10-15min，去上層脂肪，得到去脂的魚肉漿液。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，去脂的魚肉漿液的制備方法包括但不限于上述方法。
步驟(1)超聲處理方法為將去脂的魚肉漿液溫度調(diào)至50-65℃，30-45kH的超聲頻率處理15-25min。
本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，魚肉漿液溫度調(diào)至50-65℃進(jìn)行超聲處理，效果最好，能夠較好地改變魚肉蛋白的組織結(jié)構(gòu)，使下面酶解步驟在較短酶解時(shí)間和較小的用酶量就能夠獲得優(yōu)質(zhì)的蛋白肽。
步驟(2)酶解加入的復(fù)合蛋白酶為堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶，三者質(zhì)量比為(2-3):(1-2):(1-2)，且加入的復(fù)合蛋白酶總質(zhì)量與魚肉質(zhì)量比為1：300-500。
優(yōu)選地，所述堿性蛋白酶為Alcalase 2.4L堿性蛋白酶。
步驟(2)中酶解條件為55-65℃酶解2-5h。
步驟(2)酶解后將酶解液在95-100℃下保溫3-5min，冷卻至室溫。
步驟(3)離心條件為5000-7000g 10-15min；采用2000D的超濾膜進(jìn)行超濾。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，是利用孔徑為2000道爾頓的陶瓷膜對(duì)步驟(2)所得的上清液進(jìn)行超濾，收集濾液，再經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，流速為0.8mL/min，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第1個(gè)洗脫峰；再用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，反相HPLC的分離條件是以5-90％乙腈溶液(0-5min乙腈溶液為5％，5-40min乙腈溶液從5％到40％，40-50min乙腈溶液從40％到90％)作為洗脫液，流速為5-8mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液。
制備方法制備得到的蛋白肽屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在制得的蛋白肽中，氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu(SEQ ID NO.1)和Lys-Gln-Ser-Asp-Val(SEQ ID NO.2)的肽的含量大于40％。
通過進(jìn)一步功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)上述肽具有優(yōu)異的抗氧化活性。進(jìn)而本發(fā)明提供一種具有抗氧化活性的蛋白肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本發(fā)明上述方法制得的蛋白肽或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示肽的抗氧化用途屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
含有本發(fā)明上述方法制得的蛋白肽或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示肽的食品、保健品、化妝品或藥物屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
(1)本發(fā)明開發(fā)的生產(chǎn)工藝中沒有添加酸或堿進(jìn)行pH的調(diào)整，產(chǎn)品保持較好的功能特性，較易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
(2)本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽中Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量40％以上。具有很好的抗氧化功能，其清除DPPH自由基能力可達(dá)92％以上。
(3)本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽是以天然產(chǎn)物為原料、經(jīng)過食品級(jí)復(fù)合蛋白酶酶解獲得的產(chǎn)物，將其作為食品、化妝品的配料，安全，無毒。
(4)本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽制備方法簡(jiǎn)單，易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，有效地解決了目前抗氧化多肽難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的問題。
(5)本發(fā)明開發(fā)的抗氧化肽具有較好的風(fēng)味和熱穩(wěn)定性，能廣泛應(yīng)用于功能食品。
具體實(shí)施方式
除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
除有特別說明，本發(fā)明中用到的各種試劑、原料均為可以從市場(chǎng)上購(gòu)買的商品或者可以通過公知的方法制得的產(chǎn)品。
實(shí)施例1鳙魚魚肉抗氧化活性肽的制備
(1)將鳙魚魚肉100克洗凈，用打漿機(jī)將魚肉打成漿,得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入1.5倍魚肉重量的水150克，在95℃中水浴20min，再用分散均質(zhì)機(jī)在10000rpm下勻漿2min，得到魚肉漿液250克。通過6000g離心10～min，去上層脂肪，得到去脂的魚肉漿液230克。將去脂魚肉漿液的溫度調(diào)整到55℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為35kH)處理15分鐘。
(2)調(diào)節(jié)步驟(1)魚肉漿液的溫度為55℃，然后按照復(fù)合蛋白酶與魚肉質(zhì)量比為1：300的比例加入復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶:菠蘿蛋白酶＝2:1：1)0.33克，在55℃下酶解2小時(shí)，然后在95℃下保溫3min，冷卻至室溫，再在5000g條件下離心15min，收集上清液；
(3)利用孔徑為2000道爾頓的陶瓷膜對(duì)步驟(2)所得的上清液進(jìn)行超濾，收集濾液，再經(jīng)過Sephadex G-25(長(zhǎng)60cm，直徑4.6cm)凝膠色譜分離，洗脫液為去離子水，流速為0.8mL/min，洗脫峰在280nm下進(jìn)行測(cè)量，收集第1個(gè)洗脫峰，再用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，反相HPLC的分離條件是以5～90％乙腈溶液作為洗脫液，流速為1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液；
(4)將步驟(3)得到的抗氧化活性肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚肉抗氧化活性肽。
通過LC-MS/MS對(duì)所得的魚肉抗氧化活性肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量為40.3％。
實(shí)施例2鳙魚魚肉抗氧化活性肽的制備
(1)將鳙魚魚肉500克洗凈，用打漿機(jī)將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入2.0倍魚肉重量的水1000克，在90℃中水浴20min，再用分散均質(zhì)機(jī)在12000rpm下勻漿2min，得到魚肉漿液1500克。通過8000g離心10min，去上層脂肪，得到去脂的魚肉漿液1430克。將去脂魚肉漿液的溫度調(diào)整到60℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為45kH)處理20分鐘。
(2)調(diào)節(jié)(1)魚肉漿液的溫度為60℃，然后按照復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶:菠蘿蛋白酶＝2:2：1)與魚肉質(zhì)量比為1：400加入復(fù)合蛋白酶1.25克，在65℃下酶解3小時(shí)，然后在95℃下保溫4min，冷卻至室溫，再在5000g條件下離心15min，收集上清液；
(3)利用孔徑為2000道爾頓的陶瓷膜對(duì)步驟(2)所得的上清液進(jìn)行超濾，收集濾液，再經(jīng)過Sephadex G-25(長(zhǎng)60cm，直徑4.6cm)凝膠色譜分離，洗脫液為去離子水，流速為0.8mL/min，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第1個(gè)洗脫峰，再用RP-HPLC反相高校液相色譜進(jìn)行1次分離，反相HPLC的分離條件是為5～90％乙腈溶液作為洗脫液，流速為1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液；
(4)將步驟(3)得到的抗氧化活性肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得魚肉抗氧化活性肽。
通過LC-MS/MS對(duì)所得的魚肉抗氧化活性肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量為41.6％。
實(shí)施例3鱈魚肉抗氧化活性肽的制備
(1)將鱈魚魚肉1000克洗凈，用打漿機(jī)將魚肉打成漿，得魚肉漿；然后向魚肉漿中加入2.0倍魚肉重量的水2000克，在90℃中水浴15min，用分散均質(zhì)機(jī)在12000rpm勻漿2min，得到魚肉漿液3000克。通過6000g離心15min，去上層脂肪，得到去脂的魚肉漿液2880克。將去脂魚肉漿液的溫度調(diào)整到60℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為40kH)處理15分鐘。
(2)調(diào)節(jié)步驟(1)魚肉漿液的溫度為65℃，然后按照復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶:菠蘿蛋白酶＝3:1：1)與魚肉質(zhì)量比為1：400加入2.5克，在65℃下酶解4小時(shí)，然后在95℃下保溫5min，冷卻至室溫，再在5000g條件下離心15min，收集上清液；
(3)利用孔徑為2000道爾頓的陶瓷膜對(duì)步驟(2)所得的上清液進(jìn)行超濾，收集濾液，再經(jīng)過Sephadex G-25((長(zhǎng)60cm，直徑4.6cm)凝膠色譜分離，洗脫液為去離子水，流速為0.8mL/min，洗脫峰在280nm下進(jìn)行測(cè)量，收集第1個(gè)洗脫峰，再用RP-HPLC反相高校液相色譜進(jìn)行1次分離，反相HPLC的分離條件是為5～90％乙腈溶液作為洗脫液，流速為1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液；
(4)將步驟(3)得到的抗氧化活性肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚肉抗氧化活性肽，
通過LC-MS/MS對(duì)所得的魚肉抗氧化活性肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量為40.9％。
實(shí)施例4本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽的抗氧化活性的測(cè)定試驗(yàn)
試驗(yàn)樣品：實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3制備的魚肉抗氧化活性肽。
按照如下方法進(jìn)行：
(1)清除DPPH自由基能力：取1mg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30min，然后在517nm下檢測(cè)體系吸光值。吸光值越低，體系的清除DPPH自由基能力越強(qiáng)?？瞻讓?duì)照即是將樣品溶液1.5mL換成去離子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)還原力測(cè)定：取1mg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸緩沖液(pH 6.6)2.5mL和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混勻，然后在50℃水浴加熱20min。取出迅速冷卻，加入10％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均勻，然后在3000g下離心10min。取上清液2.5mL，加入去離子水2.5mL和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯化鐵溶液0.5mL，充分混勻，在室溫下反應(yīng)10min，用700nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。還原力即可用700nm波長(zhǎng)處吸光值表示。
(3)氧化自由基吸收能力(ORAC)：不同濃度的抗氧化活性肽溶液10μL與75mM磷酸鹽緩沖液90μL(pH 7.4)及200nM的熒光試劑50μL充分混合，然后在37℃溫育15min，再加入80mM的AAPH溶液50μL。用酶標(biāo)儀每分鐘讀取熒光值共進(jìn)行100min。熒光的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別是485nm和538nm。用磷酸緩沖溶液代替樣品作為空白。以Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，使用的濃度為0，2，4，8，12，16μM，繪制熒光淬滅曲線，并計(jì)算熒光淬滅曲線下的積分面積(AUC)。AUC的計(jì)算公式如下：
其中：f0是0min時(shí)熒光值，fi是第i min時(shí)的熒光值。
ORAC值用樣品曲線的斜率與Trolox曲線的斜率之比，ORAC值得單位表示為μM Trolox/mg肽。
(4)清除ABTS自由基的測(cè)定
稱取17mg過硫酸鉀加26mL水得過硫酸鉀溶液，取上述過硫酸鉀溶液2.6mL，加入10mg ABTS，配制成ABTS母液，暗處放置12-16h后，取上述母液0.8mL，0.2M pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至在734nm下讀數(shù)為0.70±0.02。取1.0mg/mL的樣品溶液0.04mL與4mL稀釋后的ABTS溶液混合震蕩30s后避光放置6min在734nm下檢測(cè)其吸光值，吸光值越小代表自由基清除能力越強(qiáng)?？瞻子谜麴s水代替樣品。清除ABTS自由基能力計(jì)算公式如下：
ABTS自由基清除率％＝(1-A1-734/A2-734)×100
其中A1-734為樣品在734nm下的讀數(shù)，A2-734為對(duì)照品在734nm下的讀數(shù)。
(5)Fe2+螯合能力的測(cè)定
取蛋白質(zhì)濃度為1mg/mL的酶解產(chǎn)物待測(cè)液1.0mL與3.7mL濃度為99.5％的無水乙醇及0.1mL 2mM FeCl2混勻，加入5mM的啡咯嗪0.2mL啟動(dòng)反應(yīng)，在室溫下靜置20分鐘后在562nm出處檢測(cè)吸光值，吸光值越小表示金屬螯合能力越強(qiáng)。對(duì)照組中以0.1mL去離子水代替酶解產(chǎn)物溶液。亞鐵離子螯合能力的計(jì)算公式如下：
Fe2+螯合率％＝(1-A1/A2)×100
其中A1為對(duì)照的吸光值，A2為樣品的吸光值。
結(jié)果(見表1)本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽具有較好的抗氧化能力，在1mg/mL的條件下，其清除DPPH自由基能力達(dá)到92％以上，還原力達(dá)到0.88以上，其ORAC為18.5以上,ABTS自由基清除率85％以上，F(xiàn)e2+螯合能力91％以上。是一種較理想的抗氧化肽。
表1本發(fā)明魚肉抗氧化活性肽的分子量及抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果
以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。