本發(fā)明屬于環(huán)境生物
技術領域：
，具體涉及一株抗銻細菌XKS1及其應用。
背景技術：
：近年來，隨著銻礦采集規(guī)模的不斷擴大，以及銻工業(yè)中廢棄物的排放，導致礦區(qū)周邊的土壤受到嚴重的污染。作為環(huán)境污染物，銻及銻化物已被證實是一類具有基因毒性的物質，并對人體具有致癌作用（Huangetal.,1998;Takahashietal.,2002;Beyersmannetal.,2008）。此外，銻還能導致肺損傷、血尿、纖維母細胞死亡、姐妹染色單體互換、循環(huán)系統(tǒng)疾病等（Huangetal.,1998）。銻已被美國環(huán)境保護署和歐共體理事會列為優(yōu)先治理污染物，也是日本環(huán)境廳密切監(jiān)測的污染物。近年來，我國銻的污染狀況越來越嚴重，逐漸受到社會各界的廣泛關注。同時，銻礦的采冶活動同時會導致與銻伴生的重金屬元素如砷、汞等進入礦區(qū)表生環(huán)境，污染了礦區(qū)農田，不僅影響農作物生長，降低農作物質量。對礦區(qū)的土壤也造成了很大的破壞。研究如何修復礦區(qū)土壤已成為亟待解決的難題。雖然銻對于人類來說具有很高的毒性，但一些微生物卻能夠在濃度極高的環(huán)境下生長，甚至可以利用這種元素作為能源物質，或者是將毒性較高的Sb(Ⅲ)氧化為毒性較弱的Sb(Ⅴ)，由此，污染土壤的微生物修復理論及修復技術便應運而生（騰應等，2007）。微生物可以通過菌體對銻的外排、高毒性的Sb（Ⅲ）的氧化成低毒性的Sb（Ⅴ）、微生物對銻的甲基化、菌體吸附等方式降低銻對菌體及環(huán)境的毒性?？逛R1971年，Lyalthova，首次報道了1株銻氧化細菌，該菌株能夠把三價的銻氧化成五價的銻為自身提供能量（Lyalthova,1971)。之后陸續(xù)有少量關于抗銻微生物的報道，總之，到目前為止己經報道的抗銻微生物的種類相對還較少，因此，篩選具有銻抗性的微生物是實現銻污染修復的重要環(huán)節(jié)。目前關于抗銻微生物的篩選及應用方面的相關研究報道不多，劉成佐（2012）篩選到一株耐銻微生物，經鑒定為青霉菌，其耐銻濃度為600mg/L。本發(fā)明專利中的菌種為假單胞菌（Pseudomonassp.）中的一株細菌，其抗銻效果明顯高于已經報道的青霉菌。且該假單胞菌具有植物促生功能，能夠產生IAA、鐵載體和ACC脫氨酶，對植物具有一定的促生效果；同時對As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2+等多種重金屬具有很強的抗性，具有潛在的應用價值。技術實現要素：本發(fā)明目的在于提供一株具有高度抗銻的細菌，經16SrDNA測序分析，結果形態(tài)學觀察，初步鑒定為假單胞菌（Pseudomonassp.），菌株編號為XKS1，該菌同時具有抗As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2等多種重金屬，以及促進植物生長的特性。本發(fā)明的假單胞菌（Pseudomonassp.）XKS1，是從湖南省冷水江市錫礦山銻礦區(qū)冶煉廠附近的植物根際土壤中分離篩選的菌種，最高能夠耐受銻濃度為3200mg/L的重金屬脅迫。菌株于2016年8月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC（單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101），保藏編號為CGMCCNo.12894，經檢測存活。在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h后，其菌落特征是：淡黃色，圓形，直徑約0.95mm，表面光滑，中央稍突起，不透明，邊緣完整。其菌體細胞特征為：桿菌，革蘭氏染色呈陰性，無芽孢。將該菌株的16SrDNA序列通過PCR擴增，獲得1400bp左右長度的擴增產物，擴增產物經測序公司進行序列測定，將所測序列與GenBank數據庫中的序列進行BLAST比對，結果表明，該菌株與假單胞菌（Pseudomonassp.）中乙酸鈣不動桿菌和嗜油不動桿菌同源性最高，相似度在98%以上。結合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及16SrDNA序列分析，該菌株確定為假單胞菌（Pseudomonassp.）。該菌株在含有不同濃度Sb（酒石酸銻鉀）的CDM固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間，觀察其生長情況，結果表明，該菌抗Sb能力極強，對三價銻耐受性達3200mg/L。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的菌種是從湖南省冷水江錫礦山銻礦區(qū)冶煉廠附近的植物根際土壤中分離篩選出的一株高抗銻（Sb）細菌，經鑒定該為假單胞菌（Pseudomonassp.）。本發(fā)明菌株除了具有很強的抗重金屬銻的特性，而且該菌株對As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2+等重金屬具有很強的抗性，特別是對As3+的耐受濃度達到3000mg/L以上。同時該菌還具有植物促生功能，能夠產生IAA、鐵載體和ACC脫氨酶這三種植物促生因子，并對Sb污染土壤中的植物生長有促進作用，例如對油菜生長具有一定的促進效果。目前關于抗銻細菌的多種抗重金屬能力及促生效果方面的研究在國內外還未見相關報道。因此，從礦區(qū)污染地篩選耐受重金屬的高抗促生微生物，對促進當地植被生長、緩解植物對重金屬的毒害具有重要意義。該菌在重金屬污染的礦區(qū)土壤的生物修復中具有廣闊的應用潛力。附圖說明圖1本發(fā)明假單胞菌（Pseudomonassp.）的培養(yǎng)物。圖2本發(fā)明假單胞菌（Pseudomonassp.）的16SrDNA基因序列。具體實施方式下面通過具體實施方式的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。實施例1抗銻細菌的分離篩選及抗Sb能力采集湖南省冷水江市錫礦山銻礦區(qū)冶煉廠附近的植物根際土壤樣品，稱取上述新鮮土壤樣品100g，加入適量的酒石酸銻鉀（[C8H4K2O12Sb2·3(H2O)]），使土樣中銻的最終濃度為1000mg/kg，放于28℃恒溫培養(yǎng)箱富集培養(yǎng)一周。取上述土樣10g放于裝有10粒玻璃珠、并盛有90mL0.85%NaCl無菌溶液中，30℃，180rmin-1搖床中搖30min，使樣品充分散開。取0.1mL涂布到CDM培養(yǎng)基上（CDM培養(yǎng)基配方：MgSO4·7H2O2.0g，NH4Cl1.0g，Na2SO41.0g，K2HPO40.013g，CaCl2·2H2O0.067g，Na-lactate5.0g，瓊脂15.0g，加蒸餾水至1000mL，pH7.2），其中CDM培養(yǎng)基中以酒石酸銻鉀為脅迫因子，使最終培養(yǎng)基中銻的濃度為50μM，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，每天觀察其生長狀況。將上述初步分離出的菌株進行進一步的分離純化獲得純種菌株，將分離后的菌種接到斜面上，4℃保存進行后續(xù)實驗。將篩選所得的菌株接種于LB培養(yǎng)基中（LB培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂15g，加蒸餾水至1000mL，pH7.2），活化24h，取2mL轉入裝有100mLLB液體培養(yǎng)基的250mL三角中，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)，以未接種的LB液體培養(yǎng)基為對照，選擇600nm的波長，用酶標儀測定不同培養(yǎng)時間細菌懸浮液的光密度值(OD600)。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600為縱坐標，繪制細菌的生長曲線，以了解菌株的生長周期，為后期進一步研究菌株對Sb、As等重金屬的耐受性、抗性及促生效果的研究適宜生長周期的菌體。向CDM培養(yǎng)基中添加Sb儲備液，使培養(yǎng)基中的Sb的終濃度分別為1、2、4、6、8和10mmol/L及以上濃度，根據實驗結果依次提高重金屬濃度，將斜面保存的抗Sb菌株在LB培養(yǎng)液中活化24h，在固體培養(yǎng)基上分離純化出單菌落，再轉接到含相應濃度Sb的固體培養(yǎng)基上，觀察菌株生長情況，能夠抑制菌株生長的最低濃度為該菌株的最低抑菌濃度(Minimuminhibitoryconcentration,MIC)。通過上述分離篩選，獲得若干抗Sb細菌，大多數株菌在48h進入穩(wěn)定期，菌株對數期為6h-36h。其中，本發(fā)明菌株（編號為XKS1）生長較快，在36h后就進入穩(wěn)定期，因此后續(xù)實驗取培養(yǎng)24h的菌體進行研究。通過測定Sb對分離菌株最低抑菌濃度，發(fā)現菌株XKS1對Sb的抗性非常高，最低抑菌濃度達27mM，折合成質量濃度大致為3200mg/L。實施例2NXH1菌株的鑒定將該菌株進行形態(tài)學、培養(yǎng)特征以及16SrDNA的序列測序分析。16SrDNA分子鑒定按照以下步驟進行：挑取篩選菌株的單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床振蕩培養(yǎng)，在24h取出培養(yǎng)液，5000r/min離心1min取上清液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司提供），提取菌落DNA；通用引物27F和1492R對提取的細菌DNA進行PCR擴增；27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R序列為5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成；將PCR產物進行序列測序，測序結果在NCBI數據庫中BLAST進行序列分析，并進行同源性比較。NXH1菌株的菌落形態(tài)特征如下：桿菌，革蘭氏染色呈陰性，無芽孢，菌落特征如下：在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h后，其菌落特征是：淡黃色，圓形，直徑約0.95mm，表面光滑，中央稍突起，不透明，邊緣完整，見圖1。該菌16SrDNA基因序列長度為1411bp，將基因序列提交到Genbank上，進行同源性比較，然后采用MEGA6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定菌株的種屬。結果表明該序列與假單胞菌（Pseudomonassp.）中各菌的16SrDNA基因序列相似度最高，達98%以上，同時結合菌落形態(tài)特征、菌體顯微特征確定XKS1菌株為假單胞菌（Pseudomonassp.），其16SrDNA基因序列如圖2所示。該菌于2016年8月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC（單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101），保藏編號為CGMCCNo.12894。實施例3：假單胞菌XKS1對多種重金屬的耐受性分別配制含有不同濃度As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2重金屬的CDM固體培養(yǎng)基，Cd2+、Cr6+、Hg2重金屬濃度從100mg/L起，依次為100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1200mg/L、1600mg/L，As3+濃度從100mg/L起，依次為100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1200mg/L、1600mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L，以不加重金屬的處理作為對照。將假單胞菌（Pseudomonassp.）XKS1菌株接種到不含重金屬的CDM培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)24h，取0.1mL分別接種于含有不同種類、不同濃度重金屬的培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)24h，觀察菌體在含有各種類、不同濃度重金屬的培養(yǎng)基中生長情況，結果見表1。從表中可以看出，XKS1菌株對上述幾種重金屬均具有較強的耐受性，對As3+、Cd2+、Cr6+、Hg2的耐受濃度分別為3000mg/L，1200mg/L，1600ml/L和800mg/L。表1假單胞菌（Pseudomonassp.）XKS1在不同重金屬濃度下的生長情況注：“+”表示生長良好；“-”表示不生長；“+/-”表示能長，但生長不良實施例4假單胞菌（Pseudomonassp.）XKS1的植物促生特性具有植物促生作用的微生物往往通過向環(huán)境中分泌吲哚乙酸（Indole-3-aceticacid,IAA）、產生鐵載體和ACC脫氨酶，起到促進植物生長的效果。通過以下實驗操作，可以驗證不動桿菌NXH1具有植物促生特性。產生IAA的功能鑒定方法如下：在培養(yǎng)微生物的特定液體培養(yǎng)基加入0.5g/LL-色氨酸（約2.5mmol/L）后高溫滅菌，用牙簽將株菌株挑入液體培養(yǎng)基，放在恒溫培養(yǎng)搖床內30℃培養(yǎng)24小時，吸取2mL菌液，2mL菌液中加入2mLSalkowski試劑（12gFeCl3，430mL98%H2SO4，570mLH2O）顯色。呈粉紅色的菌液則為陽性，說明此菌株產IAA。產生鐵載體的功能鑒定方法如下：配制CAS檢測培養(yǎng)基，在超凈臺中將分離純化的菌株點在CAS檢測培養(yǎng)基上，在30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；通過觀察細菌分泌鐵載體形成的橙色暈圈的大小做定性篩選，橙色暈圈越大，說明菌株產鐵載體能力越強。ACC脫氨酶鑒定方法如下：配制DF培養(yǎng)基（DF培養(yǎng)基配方：KH2PO44g，Na2HPO46g，MgSO4·7H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸2mL，檸檬酸2g，(NH4)2SO42g，蒸餾水定容至1L，pH7.2），用干凈牙簽將待測菌株挑入固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，放在恒溫培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)24h，再將菌株用干凈牙簽將待測菌株挑入轉接到無氮且含ACC的ADF培養(yǎng)基(以3mmol/LACC代替DF培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4為唯一氮源)中，放在30℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h后觀察結果，在ADF培養(yǎng)基上能夠長出菌落的菌株，可以初步確定具有ACC脫氨酶活性。CAS檢測培養(yǎng)基配制方法如下：溶液a：將0.012gCAS（鉻天青S）溶于10ml蒸餾水中，再加入含有10mmol/LHCl2ml的1mmol/LFeCl3溶液；溶液b：取0.015gHDTMA（十六烷基三甲基溴化銨）溶于8mL蒸餾水中；染料溶液c：將溶液a緩慢加入溶液b中，輕輕晃動，使得兩溶液互相混合均勻，得到染液c；將10×MM9鹽溶液：(Na2HPO430g，KH2HPO41.5g，NaCl2.5g，NH4Cl5g，雙蒸水500ml)20mL和哌嗪二乙醇磺酸6.04g加入有150ml的雙蒸水的潔凈三角瓶中，混勻后用50%的NaOH調節(jié)pH到6.8，并加入瓊脂粉3.2g，并得到培養(yǎng)基d。將染料溶液c、培養(yǎng)基d和1mmol·L-1CaCl2、1mmol·L-1MgSO4·7H2O,20%的葡萄糖分別滅菌（115℃，20min）,10%的酸水解酪蛋白過濾除菌后，都置于50℃水浴鍋保溫待用。分別量取上述0.2ml1mmol/LCaCl24ml，1mmol/LMgSO4·7H2O6ml，10%的酪蛋白氨基酸及2ml20%的葡萄糖，加入培養(yǎng)基d中再沿瓶壁加入染液c，充分混勻，即得藍色定性檢測培養(yǎng)基，然后按每皿30ml傾注于培養(yǎng)皿中，置于無菌操作臺待用。通過上述實驗，結果表明：假單胞菌（Pseudomonassp.）XKS1能夠產生IAA、鐵載體和ACC脫氨酶，具有潛在的植物促生功能。實施例5假單胞菌（Pseudomonassp.）XKS1對油菜生長的影響以北京某地區(qū)的農田土為盆栽基質。土壤風干后過20目篩，測定含水量，以烘干土重20Kg稱取對應風干土重，把應加入的銻的量配置成250mL溶液，與上述土壤充分混勻，使土壤中含銻濃度為20mg/Kg、50mg/Kg、100mg/Kg、250mg/Kg、500mg/Kg，以田間持水量70%加入相應的去離子水，置于避光條件下平衡2個月，不加銻的為銻濃度為0mg/kg的處理為對照，平衡后的土壤裝盆，備用。實驗前先選取一定數量顆粒飽滿，大小均勻的油菜種子放于10%雙氧水溶液中浸泡15min，然后用ddH2O沖洗干凈，消毒后的種子均勻的灑在鋪有三層紗布的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，待種子露白時選取發(fā)芽勢接近的種子播種于上述不同銻污染土壤中，每盆播種30粒，播種后每盆用噴壺接入約108CFU/g培養(yǎng)的菌液10mL，以不接菌的處理為對照，每個處理設3個重復。定期澆水，保持每天8h的光照，植株在溫室下生長14d后測量植物株高、根長。由表2可以看出：在不同銻濃度的土壤中，添加假單胞菌XKS1的各處理油菜株高及根長均高于未加菌的處理，說明假單胞菌XKS1在減輕銻對植物毒害、促進植物生長方面具有潛在應用價值。表2假單胞菌XKS1對油菜株高及根長的影響Sb(mg/kg)不加菌株高加菌株高不加菌根長加菌根長012.4314.073.435.972013.2314.904.385.875013.7715.734.155.8510013.1714.083.684.9325012.7613.713.775.4850011.6812.823.385.38當前第1頁1 2 3