本發(fā)明涉及一種牛鏈球菌，尤其涉及一種能夠利用淀粉發(fā)酵產(chǎn)出混合酸的產(chǎn)乳酸牛鏈球菌，以及該菌的體外分離方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

牛鏈球菌(Streptococcus bovis)是瘤胃主要的乳酸產(chǎn)生菌，在飼喂高精料飼糧導(dǎo)致瘤胃乳酸中毒的重要誘因。從反芻動(dòng)物瘤胃中分離培養(yǎng)牛鏈球菌，研究其發(fā)酵產(chǎn)酸通路及主要影響因素將為尋找抑制其乳酸產(chǎn)生的方法(如：抑制型添加劑的研發(fā)等)提供理論參考，從而在生產(chǎn)上達(dá)到通過調(diào)控牛鏈球菌乳酸的產(chǎn)生來緩解反芻動(dòng)物瘤胃乳酸中毒的目的。另外，利用牛鏈球菌產(chǎn)生混合酸的特點(diǎn)，可以將分離的瘤胃源牛鏈球菌用于反芻動(dòng)物青貯飼料發(fā)酵，改進(jìn)單純使用乳酸菌作為發(fā)酵菌株的單一化的發(fā)酵模式。

目前，有關(guān)牛鏈球菌的研究主要集中在檢測瘤胃酸中毒情況下牛鏈球菌菌群數(shù)量變化情況。Wang,et al.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛鏈球菌的數(shù)量在瘤胃酸中毒后劇增，直接揭示了其在誘導(dǎo)瘤胃酸中毒中的關(guān)鍵作用(Wang H,Pan X,Wang C,et al.Effects of different dietary concentrate to forage ratio and thiamine supplementation on the rumen fermentation and ruminal bacterial community in dairy cows[J].Animal Production Science,2015,55(2):189-193)。國外，特別是歐洲國家借助于高效的細(xì)菌庫資源共享平臺(tái)，研究開發(fā)了諸如莫能菌素等有效殺滅瘤胃牛鏈球菌的抗生素制劑(McGuffey R K,Richardson L F,Wilkinson J I D.Ionophores for dairy cattle:current status and future outlook[J].Journal of Dairy Science,2001,84:E194-E203)，以及有效刺激反芻動(dòng)物產(chǎn)生抗牛鏈球菌抗體的疫苗等(Shu Q,Bird S H,Gill H S,et al.Immunological cross-reactivity between the vaccine and other isolates of Streptococcus bovis and Lactobacillus[J].FEMS Immunology&Medical Microbiology,1999,26(2):153-158)，為在生產(chǎn)中預(yù)防和治療瘤胃酸中毒提供了可行的解決方案。然而，由于牛鏈球菌能夠感染人類引起相關(guān)炎癥反應(yīng)，使得從國外引進(jìn)相關(guān)菌株存在一定風(fēng)險(xiǎn)，并且引進(jìn)成本較為高昂。

國內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室開展了從瘤胃中分離培養(yǎng)牛鏈球菌的工作，但相關(guān)成功案例報(bào)道并不多見，主要是因?yàn)椋?1)難營造嚴(yán)格厭氧環(huán)境：瘤胃源牛鏈球菌為厭氧菌，厭氧菌對(duì)分離、培養(yǎng)的厭氧環(huán)境要求較為嚴(yán)格，即使微量混入氧氣不會(huì)導(dǎo)致其死亡，但長期可能具有引起其分 化突變的可能，從而使得其厭氧下的部分功能喪失；(2)分選培養(yǎng)基沒有選擇性：分選培養(yǎng)基多以葡萄糖為能源，可以被幾乎瘤胃所有細(xì)菌利用，部分與牛鏈球菌拮抗的細(xì)菌具有更強(qiáng)的葡萄糖競爭能力，從而抑制甚至產(chǎn)生毒害物質(zhì)殺滅牛鏈球菌，導(dǎo)致牛鏈球菌的體外分離效率很低；(3)對(duì)牛鏈球菌菌斑特征的不熟悉，導(dǎo)致篩選過程中的漏選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)乳酸牛鏈球菌，該菌可以有很好地利用淀粉發(fā)酵產(chǎn)混合酸。

本發(fā)明的目的還在于提供一種產(chǎn)乳酸牛鏈球菌的分離方法，該方法簡單高效、選擇性較強(qiáng)，解決了厭氧且具發(fā)酵淀粉產(chǎn)生乳酸的牛鏈球菌菌株分離沒有特異性、分離效率低的難題。

本發(fā)明的目的還在于提供上述產(chǎn)乳酸牛鏈球菌及其分離方法的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種產(chǎn)乳酸牛鏈球菌，其核苷酸序列包括如序列表中所示SEQ NO.1。

本發(fā)明提供了一種如上所述的產(chǎn)乳酸牛鏈球菌的分離方法，主要包括如下步驟：

(1)制備富集培養(yǎng)基液：

以水為溶質(zhì)，向其中加入質(zhì)量比為1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K₂HPO₄，0.1％吐溫80，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.005％MgSO₄·H₂O，0.2％檸檬酸銨，0.5％C₂H₃NaO₂，并向其中加入刃天青鈉(終濃度為20mg/L)，作為厭氧指示劑，在將配置的富集培養(yǎng)基液高溫滅菌除氧后密封冷卻，調(diào)節(jié)pH為6.5到6.8。優(yōu)選地，將配置的富集培養(yǎng)基液放于高壓滅菌鍋中115到121℃高壓滅菌至少15分鐘充分除氧后取出密封冷卻。在富集培養(yǎng)基液組分中，以可溶性淀粉為唯一能源，使得無法利用淀粉的其他菌在富集培養(yǎng)基液中生長緩慢，而牛鏈球菌可以利用淀粉，迅速增殖，形成優(yōu)勢(shì)菌群。

(2)菌源稀釋

將無菌厭氧采集的菌源按照1：30～70的比例與步驟(1)中所制備獲得的富集培養(yǎng)基液混合于厭氧培養(yǎng)容器中，于37℃震蕩培養(yǎng)至少24小時(shí)后，豎立厭氧培養(yǎng)容器，繼續(xù)靜置培養(yǎng)至少24小時(shí)。

(3)制備固體分離培養(yǎng)基

以水為溶質(zhì)，向其中加入質(zhì)量比為1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K₂HPO₄，0.1％吐溫80，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.005％MgSO₄·H₂O，0.2％檸檬酸銨，0.5％C₂H₃NaO₂，并向其中加入1.5％瓊脂糖，將配置的分離培養(yǎng)基高溫滅菌除氧后在厭氧環(huán)境下冷卻，調(diào)節(jié)pH為6.5到6.8后澆板。優(yōu)選地，將配置的分離培養(yǎng)基放于高壓滅菌 鍋中115到121℃高壓滅菌至少15分鐘后立即取出轉(zhuǎn)移至厭氧工作站中冷卻，調(diào)節(jié)pH為6.5到6.8，并澆板。

(4)細(xì)菌的分離純化

吸棄步驟(2)中的培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)液，保留沉淀物。因?yàn)榕ｆ溓蚓w呈白色，且產(chǎn)乳酸后會(huì)發(fā)生聚集沉降。挑取少許沉淀，涂布于分離培養(yǎng)澆筑的培養(yǎng)板,優(yōu)選瓊脂培養(yǎng)板上，在厭氧條件下37到39℃避光培養(yǎng)24到36小時(shí)，挑選表面濕潤、有光澤、顏色為乳白色的圓滴狀菌落，進(jìn)行產(chǎn)乳酸生化管鑒定和革蘭氏染色鑒定，選擇鑒定結(jié)果為產(chǎn)乳酸陽性及革蘭氏陽性的菌落進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至新的平板中分離培養(yǎng)。優(yōu)選地，重復(fù)本步驟4次，分離得到純菌株。

本發(fā)明還提供了如上所述的產(chǎn)乳酸牛鏈球菌及其分離方法在開發(fā)牛鏈球菌疫苗以及新型飼料發(fā)酵菌劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案的有益效果是：

1)本發(fā)明提供的產(chǎn)乳酸牛鏈球菌的體外分離方法，能夠簡單高效、選擇性較強(qiáng)地分離和篩選牛鏈球菌菌株。其中，以可溶性淀粉為唯一能源，使得無法利用淀粉的其他菌在富集培養(yǎng)基中生長緩慢，而使得牛鏈球菌可以利用淀粉，迅速增殖，形成優(yōu)勢(shì)菌群，相比于以葡萄糖作為能源的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的分離方法對(duì)牛鏈球菌的選擇性更強(qiáng)；此外，在菌源稀釋步驟中，不同于現(xiàn)有技術(shù)中常用的“稀釋富集培養(yǎng)液，然后接種到平板上”的分選方法，本發(fā)明中采用了豎立靜置至少24小時(shí)的方法，通過豎立使得牛鏈球菌發(fā)生聚集下沉，并產(chǎn)生乳酸等形成粘液膠狀白色沉淀，長時(shí)間的靜置使得聚集下沉到底部，形成白色沉淀，以便進(jìn)一步分選鏈球菌是直接挑選白色沉淀物進(jìn)行分離培養(yǎng)，從而使得分選方法的目的性更強(qiáng)；另外，至少24小時(shí)的靜置，使得牛鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)生更多乳酸，pH進(jìn)一步降低到4.5左右，此時(shí)幾乎所有細(xì)菌都無法耐受此低pH而盡數(shù)死亡，但牛鏈球菌能耐受低pH，因此不會(huì)死亡，從而使得分離的選擇性更強(qiáng)。本發(fā)明提供的產(chǎn)乳酸牛鏈球菌的體外分離方法解決了發(fā)酵淀粉產(chǎn)生乳酸的厭氧牛鏈球菌菌株分離困難、分離效率低的難題；

2)分離得到的牛鏈球菌菌株純度和活力較高，能夠用于體外研究瘤胃酸中毒條件下其產(chǎn)酸通路的變化；另外，分離得到的菌株具有發(fā)酵淀粉產(chǎn)混合酸的能力，將為反芻動(dòng)物青貯飼料發(fā)酵提供新型發(fā)酵菌種，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖1是S1環(huán)境掃描電鏡圖。

圖2是S1革蘭氏染色圖。

圖3是S1產(chǎn)酸LC-MS/MS定性圖。

圖4是S1生長于富含葡萄糖培養(yǎng)基生長曲線圖。

圖5是S1PCR產(chǎn)物電泳圖。

圖6是S1測序峰圖。

圖7是S1系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

具體實(shí)施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。

實(shí)施例1

本實(shí)施例1提供了一種產(chǎn)乳酸牛鏈球菌的分離方法，具體包括以下步驟：

(1)菌源獲取

以飼料精粗比為7:3的飼糧飼喂揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場健康成年帶瘤胃瘺管薩能奶山羊15天，誘導(dǎo)其產(chǎn)生酸中毒，采用專利號(hào)為ZL201520957016.1的授權(quán)專利技術(shù)，厭氧無菌采集、過濾瘺管的薩能奶山羊瘤胃液，裝入無菌厭氧密封袋中并密封。

(2)制備富集培養(yǎng)基

稱取蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，牛肉提取物10.0g，可溶性淀粉10.0g，K₂HPO₄2.0g，吐溫80 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MgSO₄·H₂O 0.05g，檸檬酸銨2.0g，C₂H₃NaO₂ 5.0g后，將其溶于1L超純水中，并向其中滴加20μl 0.1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的刃天青鈉，放于高壓滅菌鍋中121℃高壓滅菌15分鐘后取出密封冷卻，調(diào)節(jié)pH為6.8。

(3)菌源稀釋、運(yùn)輸和保存

將無菌厭氧采集的瘤胃液按照1：50的比例與步驟(2)富集培養(yǎng)基混合于厭氧培養(yǎng)瓶中，置于37℃保溫運(yùn)輸,送入實(shí)驗(yàn)室并繼續(xù)放置于37℃保溫箱中震蕩培養(yǎng)24小時(shí)后，樹立厭氧培養(yǎng)瓶，繼續(xù)靜置培養(yǎng)24小時(shí)。

(4)制備分離培養(yǎng)基

稱取蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，牛肉提取物10.0g，可溶性淀粉10.0g，K₂HPO₄2.0g，吐溫80 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MgSO₄·H₂O 0.05g，檸檬酸銨2.0g，C₂H₃NaO₂5.0g后，將其溶于1L超純水中，并向其中加入15.0g瓊脂糖，放于高壓滅菌鍋中121℃高壓滅菌15分鐘后立即取出轉(zhuǎn)移至厭氧工作站中冷卻、調(diào)節(jié)pH為6.8，澆板。

(5)細(xì)菌的分離純化

取出靜置培養(yǎng)后的培養(yǎng)瓶，吸棄培養(yǎng)液，保留底部白色沉淀。因?yàn)榕ｆ溓蚓w呈白色，且產(chǎn)乳酸后會(huì)發(fā)生聚集沉降。用接種棒挑取少許白色沉淀，采用劃線法均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)板上，在厭氧工作站中37-39℃避光培養(yǎng)24-36小時(shí)，挑選表面濕潤、有光澤、顏色為乳白色的圓滴狀菌落，進(jìn)行產(chǎn)乳酸生化管鑒定和革蘭氏染色鑒定，選擇鑒定結(jié)果為產(chǎn)乳酸陽性及革蘭氏陽性的菌落進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至新的平板中分離培養(yǎng)，重復(fù)以上過程4次，分離得到純菌株。

(6)制備保存培養(yǎng)基

稱取蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g,牛肉提取物10.0g，可溶性淀粉5.0g，葡萄糖5.0g，K₂HPO₄ 2.0g，吐溫80 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MgSO₄·H₂O 0.05g，檸檬酸銨2.0g，C₂H₃NaO₂ 5.0g后，將其溶于1L超純水中，放于高壓滅菌鍋中121℃高壓滅菌15分鐘后，立即取出轉(zhuǎn)移至厭氧工作站中冷卻，調(diào)節(jié)pH為6.8，后與等體積的無菌液態(tài)甘油1:1等體積混勻，高速攪拌機(jī)均質(zhì)，分裝于細(xì)胞凍存管備用。

(7)純化后的細(xì)菌保存

用接種棒挑出純菌株的菌落，轉(zhuǎn)至含保存培養(yǎng)基的凍存管中，旋蓋密封，并渦旋震蕩30秒，投入液氮速凍，隨后再轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱長期保存。

實(shí)施例2

本實(shí)施例2中，對(duì)上面實(shí)施例1中分離的菌落進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定。

(1)形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)牛鏈球菌新菌株S1菌落為乳白色，濕潤，有光澤，圓滴狀。將生長在瓊脂平板上的菌落連同瓊脂一起挖出，放入2％戊二醛固定4小時(shí)，取出冷凍干燥后，采用培養(yǎng)基及菌體一起固定技術(shù)在環(huán)境掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，S1菌株呈球形，直徑在1μm左右，多個(gè)細(xì)胞首尾相連呈鏈狀(圖1)。其中，培養(yǎng)基及菌體一起固定技術(shù)(即：在瓊脂平板上的菌落連同瓊脂一起挖出，放入2％戊二醛固定4小時(shí)，而不是用戊二醛沖洗菌落)，避免了使用傳統(tǒng)方法將菌落挑選后涂布于樣品臺(tái)觀察時(shí)，在挑菌過程中機(jī)械性的挑選使得鏈狀連接斷裂。

(2)理化性質(zhì)鑒定

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行革蘭氏染色和理化特征鑒定。革蘭氏結(jié)果顯示呈陽性(圖2)；產(chǎn)酸結(jié)果顯示產(chǎn)乳酸、甲酸、乙酸等(圖3)。結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)牛鏈球菌的界定，初步得出S1菌株為能夠發(fā)酵淀粉產(chǎn)酸的牛鏈球菌菌株。

(3)增殖性能鑒定

將S1菌株接種到pH為6.8的含葡萄糖10.0g/L(不含可溶性淀粉)的富集培養(yǎng)液中，該菌株能夠利用葡萄糖快速增值，分批培養(yǎng)8小時(shí)達(dá)到增殖平臺(tái)期(圖4)。

(4)16S rRNA基因組鑒定

取處于對(duì)數(shù)生長期的S1菌株菌液2mL，用上海生工Ezup柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒提取該S1菌株DNA，用作菌株16S rRNA基因擴(kuò)增模板。通過Primer 6軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物為：F：ATACATAGCCGACCTGAGA(SEQ NO.2)，R：CCTACAATCCGAACTGAGAT(SEQ NO.3)，交由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系為25μL：10x Taq-buffer 2.5μL,dNTPs(2.5mmo l/L)1μL,Ex Taq酶0.2μL，F(xiàn)和R引物(10uM)各0.5μL,滅菌三蒸水19.8μL，因組模板0.5μL。其擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s，55℃復(fù)性45s，72℃延長1min，循環(huán)30次；72℃修復(fù)延伸10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增片段是否是目的片段。結(jié)果顯示為1500bp左右的目的片段(圖5)。確定為目的片段后，PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，純化方式依照說明書步驟進(jìn)行，純化后的PCR產(chǎn)物用PCR引物直接測序。測序譜峰圖中各峰穩(wěn)定，無重合峰出現(xiàn)，說明用于測序的菌株較為純凈(圖6)。測序結(jié)果序列經(jīng)過與現(xiàn)有的牛鏈球菌菌株比對(duì)發(fā)現(xiàn)，S1菌株與已報(bào)道的豬源ATCC27960(登錄號(hào)：AB002481.1)瘤胃源JB1(登錄號(hào)：AF104109.1)菌株同源性高(圖7)，共屬于鏈球菌屬，牛鏈球菌種。該S1菌株測序序列數(shù)據(jù)已被NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫收錄，登錄號(hào)為：KU853019.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU853019.1)。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例3中，對(duì)牛鏈球菌S1進(jìn)行了發(fā)酵可溶性淀粉產(chǎn)甲酸、乙酸和乳酸分析。

取2ml對(duì)于對(duì)數(shù)生長期的S1菌株，接種到含100ml富集培養(yǎng)基(只提供1g/L可溶性淀粉作為碳源，其他成分不變)的厭氧瓶中，37℃水浴，滴加NaOH保持發(fā)酵環(huán)境pH恒定為6.5，于搖床中培養(yǎng)13小時(shí)采集發(fā)酵液，測定甲酸、乳酸以及乙酸的產(chǎn)生量，結(jié)果顯示(表1)：該培養(yǎng)條件下產(chǎn)甲酸、乙酸和乳酸在總酸體系中分別占7.10％、18.66％和74.24％。為發(fā)酵可溶性淀粉產(chǎn)混合酸，具有利用其作為青貯飼料發(fā)酵劑的應(yīng)用前景。

表1：S1控pH發(fā)酵產(chǎn)甲酸、乳酸和乙酸量

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。