本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含鉬、鋅、鎳的食氣厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)醇的培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

合成氣是一種主要包含CO、H₂以及少量CO₂等其他組分的混合氣體，合成氣的來源較為廣泛，如煤、石油、天然氣、工業(yè)廢氣(如焦?fàn)t煤氣、煉廠氣)、城市固體廢棄物以及生物質(zhì)等。目前，化石能源的過度使用以及城市垃圾、秸稈等的燃燒造成大氣中CO、CO₂、CH₄等氣體含量的不斷攀升，損害人體健康，造成了全球范圍內(nèi)的溫室效應(yīng)，加劇了厄爾尼諾現(xiàn)象，導(dǎo)致氣候異常、海平面上升、農(nóng)作物產(chǎn)量下降等諸多嚴(yán)重的社會環(huán)境和經(jīng)濟問題。上述合成氣的處理一般采用吸收或燃燒等方法，處理效率低，能耗高。

現(xiàn)有技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，自然界中存在一類厭氧食氣微生物，能以合成氣(CO、CO₂以及H₂)作為唯一的碳源和能量源進行生長，并且將其轉(zhuǎn)化為多種有機酸和醇類物質(zhì)，包括乙酸、丁酸、2，3-丁二醇等高附加值化學(xué)品以及乙醇、丁醇、正己醇等生物燃料。因此，將合成氣作為碳源和能源應(yīng)用到微生物的工業(yè)發(fā)酵過程中，不僅可以形成一條可持續(xù)發(fā)展的能源和化學(xué)品開發(fā)的綠色通道，節(jié)省企業(yè)的運行成本，提高經(jīng)濟效益，還可以減少含碳?xì)怏w排放，加速地球碳循環(huán)，減輕溫室效應(yīng)，創(chuàng)造社會和環(huán)境效益。

然而目前，雖然文獻中有報道Co²⁺，Cu²⁺，F(xiàn)e²⁺，Mn²⁺，Mo⁶⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，SeO₄^-以及WO₄^-這幾種金屬離子的單獨的濃度變化對Clostridium ragsdalei合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中上述金屬離子的濃度可以改變發(fā)酵產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量，但是食氣厭氧菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)物合成能力較弱，醇類物質(zhì)的產(chǎn)量低下，尤其是正丁醇、正己醇等高級醇的產(chǎn)量，限制了微生物發(fā)酵技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)實際中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種含鉬、鋅、鎳的食氣厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)醇能力的培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法，來解決現(xiàn)有技術(shù)中利用合成氣發(fā)酵過程中產(chǎn)物合成能力較弱，醇類產(chǎn)量低下的問題。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種食氣厭氧菌利用合成氣發(fā)酵的培養(yǎng)體系，其特征在于，包括以下組分：微量元素、關(guān)鍵金屬元素和培養(yǎng)基；

所述的微量元素包括以下元素：鎂元素、鐵元素、鈷元素、硒元素和鎢元素；所述的微量元素的體積為培養(yǎng)基體積的0.3～0.4％；

所述的關(guān)鍵金屬離子包括鉬元素、鋅元素和鎳元素；

所述鉬元素在培養(yǎng)體系中的濃度≤0.42μM；

所述鋅元素在培養(yǎng)體系中的濃度為≥70μM；

所述鎳元素在培養(yǎng)體系中的濃度≥0.84μM；

所述的培養(yǎng)基包括以下體積分?jǐn)?shù)的組分：1～5％的大量元素溶液，0.2～0.8％的還原劑溶液，余量的營養(yǎng)水溶液。

優(yōu)選的，所述的鉬元素在培養(yǎng)體系中的濃度為0～0.20μM。

優(yōu)選的，所述的鋅元素在培養(yǎng)體系中的濃度為70～300μM。

優(yōu)選的，所述的鎳元素在培養(yǎng)體系中的濃度為1～20μM。

優(yōu)選的，所述的鉬元素在培養(yǎng)體系中的濃度為0～0.10μM，所述的鋅元素在培養(yǎng)體系中的濃度為100～150μM，所述的鎳元素在培養(yǎng)體系中的濃度為8～18μM。

優(yōu)選的，所述的大量元素溶液包括以下含量的組分：6～10wt％氯化鈉，8～12wt％氯化銨，0.5～1.5wt％氯化鉀，0.5～1.5wt％磷酸二氫鉀，1～3wt％硫酸鎂，0.2～0.6wt％氯化鈣和余量的水。

優(yōu)選的，所述的還原劑溶液包括以下含量的組分：0.8～1.0wt％的氫氧化鈉，2～6wt％的L-半胱氨酸鹽酸鹽和2～6wt％的九水硫化鈉，余量的水。

優(yōu)選的，所述營養(yǎng)水溶液中包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05～0.15％的酵母提取物和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0～4.0％的嗎啉乙磺酸。

本發(fā)明還提供了一種食氣厭氧菌利用合成氣發(fā)酵產(chǎn)醇的方法，包括以下步驟：

1)向所述培養(yǎng)體系中接入發(fā)酵菌種，得到有菌培養(yǎng)體系；

2)向所述步驟1)得到的有菌培養(yǎng)體系中通入合成氣后密封，振蕩培養(yǎng)，得到包括乙醇、正丁醇和正己醇的發(fā)酵產(chǎn)物。

優(yōu)選的，步驟2)中所述合成氣包括以下體積含量的組份：45～55％的CO、30～40％的CO₂和10～20％的H₂；所述通入合成氣的速度為1.5～2.5L/min。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過構(gòu)建包括微量元素、關(guān)鍵金屬元素和培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系，并利用所述培養(yǎng)體系對食氣厭氧菌進行發(fā)酵，尤其是培養(yǎng)體系中鉬元素、鋅元素和鎳元素濃度的協(xié)調(diào)調(diào)整，提高了食氣厭氧菌發(fā)酵的菌體最高濃度和發(fā)酵產(chǎn)醇類的能力，以Clostridium carboxidivorans P7為例，菌株的細(xì)胞濃度最大可達OD600nm～1.8Abs，最高乙醇產(chǎn)量為4.9g/L，正丁醇產(chǎn)量最高為1.98g/L，正己醇含量為0.42g/L。

附圖說明

圖1為對比例1中菌株發(fā)酵的OD₆₀₀值、乙醇、丁醇和正己醇的產(chǎn)量；

圖2為實施例1中菌株發(fā)酵乙醇的OD₆₀₀值、乙醇、丁醇和正己醇的產(chǎn)量；

圖3為實施例2中菌株發(fā)酵乙醇的OD₆₀₀值、乙醇、丁醇和正己醇的產(chǎn)量；

圖4為實施例3中菌株發(fā)酵乙醇的OD₆₀₀值、乙醇、丁醇和正己醇的產(chǎn)量；

圖5為實施例4中菌株發(fā)酵乙醇的OD₆₀₀值、乙醇、丁醇和正己醇的產(chǎn)量；

圖6為實施例5中菌株發(fā)酵乙醇的OD₆₀₀值、乙醇、丁醇和正己醇的產(chǎn)量；

圖7為實施例6中菌株發(fā)酵乙醇的OD₆₀₀值、乙醇、丁醇和正己醇的產(chǎn)量；

圖8為實施例7中菌株發(fā)酵乙醇的OD₆₀₀值、乙醇、丁醇和正己醇的產(chǎn)量。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種食氣厭氧菌利用合成氣發(fā)酵的培養(yǎng)體系，包括以下組分：微量元素、關(guān)鍵金屬元素和培養(yǎng)基；所述的微量元素包括以下元素：鎂元素，鐵元素，鈷元素，硒元素和鎢元素；所述的微量元素的體積為培養(yǎng)基體積的0.3～0.4％；關(guān)鍵金屬離子包括鉬元素、鋅元素、鎳元素；所述鉬元素在培養(yǎng)體系中的濃度≤0.42μM；所述鋅元素在培養(yǎng)體系中的濃度為≥70μM；所述鎳元素在培養(yǎng)體系中的濃度≥0.84μM；所述的培養(yǎng)基包括以下體積分?jǐn)?shù)的組分：1～5％的大量元素溶液，0.2～0.8％的還原劑溶液，余量的營養(yǎng)水溶液。

在本發(fā)明中，所述的微量元素包括以下元素：鎂元素，鐵元素，鈷元素，硒元素和鎢元素，優(yōu)選還包括氮元素。本發(fā)明對所述的微量元素的來源沒有限定，只要是能夠提供所述種類的微量元素的物質(zhì)即可，具體的本發(fā)明實施例中提供所述微量元素的物質(zhì)可為氨三乙酸，硫酸鎂，硫酸亞鐵銨，硒酸鈉/亞硒酸鈉，氯化鈷和鎢酸鈉；本發(fā)明中提供所述微量元素的物質(zhì)為市售分析純。本發(fā)明中，所述微量元素的添加體積優(yōu)選為培養(yǎng)基體積的0.1～0.5％，更優(yōu)選的為0.2～0.4，最優(yōu)選的為0.33％。

在本發(fā)明中，所述的關(guān)鍵金屬元素包括鉬元素、鋅元素和鎳元素；所述鉬元素在培養(yǎng)體系中的濃度≤0.42μM，優(yōu)選的為0～0.20μM，更優(yōu)選的為0～0.1μM，最優(yōu)選的為0μM，本發(fā)明對所述的鉬離子的來源沒有限定，只要是能提供鉬離子的物質(zhì)即可，具體的在本發(fā)明實施例中優(yōu)選的為鉬酸鈉，所述的鉬酸鈉為市售分析純。

本發(fā)明中所述的鋅元素在培養(yǎng)體系中的濃度≥70μM，優(yōu)選的為70～300μM，更優(yōu)選的為100～150μM；本發(fā)明對所述鋅元素的來源沒有特殊要求，只要溶解狀態(tài)下能解離出鋅元素即可，具體的在本發(fā)明實施例中鋅離子來源于鋅鹽，例如硫酸鋅或者氯化鋅，優(yōu)選的為硫酸鋅。

本發(fā)明中所述鎳離子在培養(yǎng)體系中的濃度≥0.84μM，優(yōu)選的為1～20μM，更優(yōu)選的為8～18μM，本發(fā)明對所述鎳元素的來源沒有特殊要求，只要溶解狀態(tài)下能解離出鎳元素即可，具體的在本發(fā)明實施例中鎳元素來源于鎳鹽，例如氯化鎳、硫酸鎳或硝酸鎳，優(yōu)選的為氯化鎳。

本發(fā)明中所述的關(guān)鍵金屬元素中鉬元素、鋅元素和鎳元素各自在培養(yǎng)體系中的濃度，以及上述三者在培養(yǎng)體系中的濃度比例，對于食氣厭氧菌利用合成氣發(fā)酵所能達到的OD₆₀₀值，乙醇，正丁醇和正己醇的產(chǎn)量均有較為關(guān)鍵的影響。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)體系還包括培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基包括以下體積分?jǐn)?shù)的組分：1～5％的大量元素溶液，0.2～0.8％的還原劑溶液，余量的營養(yǎng)水溶液。

在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基優(yōu)選包括體積分?jǐn)?shù)為1～5％的大量元素溶液，更優(yōu)選的為2～4％，最優(yōu)選的為3％。在本發(fā)明中，所述大量元素優(yōu)選包括鈉元素、氮元素、鉀元素、磷元素、硫元素、鎂元素、氯元素和鈣元素。本發(fā)明對所述大量元素的來源沒有特殊限定，只要能夠提供上述大量元素即可，具體的在本發(fā)明實施例中，所述大量元素溶液優(yōu)選包括以下質(zhì)量含量的組分：6～10wt％氯化鈉，8～12wt％氯化銨，0.5～1.5wt％氯化鉀，0.5～1.5wt％磷酸二氫鉀，1～3wt％硫酸鎂，0.2～0.6wt％氯化鈣和余量的水。

在本發(fā)明中，所述氯化鈉的含量優(yōu)選的為6～10wt％，更優(yōu)選的為7～9％，最優(yōu)選的為8％；所述氯化銨的含量優(yōu)選的為8～12wt％，更優(yōu)選的為9～11％，最優(yōu)選的為10％；所述氯化鉀的含量優(yōu)選的為0.5～1.5wt％，更優(yōu)選的為0.8～1.2％，最優(yōu)選的為1.0％；所述磷酸二氫鉀的含量優(yōu)選的為0.5～1.5wt％，更優(yōu)選的為0.8～1.2％，最優(yōu)選的為1.0％；所述硫酸鎂的含量優(yōu)選的為1～3wt％，更優(yōu)選的為1.5～2.5％，最優(yōu)選的為2％；所述氯化鈣的含量優(yōu)選的為0.2～0.6wt％，更優(yōu)選的為0.3～0.5％，最優(yōu)選的為0.4％；本發(fā)明大量元素溶液中還包括余量的水，本發(fā)明對大量元素母液中的水沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域常規(guī)的水即可，具體的在本發(fā)明實施例中可為無菌水、純凈水、蒸餾水或雙蒸水，本發(fā)明大量元素母液中的水作為溶劑，溶解上述各個組份；本發(fā)明中上述大量元素母液中除水以外的組分均為市售分析純。

在本發(fā)明中，所述的培養(yǎng)基包括還原劑溶液，所述還原劑溶液在所述培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選的為0.2～0.8％，更優(yōu)選的為0.4～0.6％，最優(yōu)選的為0.5％。在本發(fā)明中，所述的還原劑包括氫氧化鈉，L-半胱氨酸鹽酸鹽和九水硫化鈉；在所述還原劑溶液中，所述的氫氧化鈉的含量優(yōu)選的為0.8～1.0wt％，更優(yōu)選的為0.9wt％；所述L-半胱氨酸鹽酸鹽的含量優(yōu)選的為2～6wt％，更優(yōu)選的為3～5wt％，最優(yōu)選的為4wt％；所述九水硫化鈉的含量優(yōu)選的為2～6wt％，更優(yōu)選的為3～5wt％，最優(yōu)選的為4wt％；本發(fā)明所述還原劑中還包括余量的水，本發(fā)明對還原劑中的水沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域常規(guī)的水即可，具體的在本發(fā)明實施例中可為無菌水、純凈水、蒸餾水或雙蒸水，本發(fā)明大量元素母液中的水作為溶劑，溶解上述各個組份；本發(fā)明中上述還原劑中除水以外的組分均為市售分析純。

本發(fā)明所述的培養(yǎng)基中還包括剩余體積的營養(yǎng)水溶液，所述的營養(yǎng)水溶液中包括酵母提取物和嗎啉乙磺酸，本發(fā)明以營養(yǎng)水溶液的質(zhì)量為基準(zhǔn)，所述酵母提取物的質(zhì)量含量優(yōu)選的為0.05～0.15％，更優(yōu)選的為0.08～0.12，最優(yōu)選的為0.1％；所述嗎啉乙磺酸的質(zhì)量含量優(yōu)選的為1.0～4.0％，更優(yōu)選的為2.0～3.0％，最優(yōu)選的為2.5％。本發(fā)明對所述酵母提取物和嗎啉乙磺酸的來源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酵母提取物和嗎啉乙磺酸的市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明中所述的培養(yǎng)體系通過將微量元素、關(guān)鍵金屬元素和滅菌除氧后的培養(yǎng)基混合后得到。

本發(fā)明對所述培養(yǎng)基進行除氧和滅菌，得到滅菌和除氧后的培養(yǎng)基。為了便于培養(yǎng)基的除氧，本發(fā)明優(yōu)選對上述技術(shù)方案所述培養(yǎng)基進行密封，本發(fā)明對所述的密封手段和方法沒有特殊的限定，只要能夠保證密封效果即可，在本發(fā)明的具體實施例中優(yōu)選的將培養(yǎng)基置于血清瓶中，使用橡膠塞進行密封得到密封培養(yǎng)基，所述血清瓶優(yōu)選的容積為100ml，所述血清瓶中培養(yǎng)基的體積優(yōu)選的為20～30ml。

本發(fā)明優(yōu)選向所述密封的培養(yǎng)基中充入氮氣對培養(yǎng)基進行除氧，得到無氧培養(yǎng)基。本發(fā)明優(yōu)選的使用連接有針頭的氮氣瓶提供氮氣源，在充氮氣的過程中排出培養(yǎng)基中的空氣，所述的充入氮氣的速度優(yōu)選的為1.5～2.5L/min，更優(yōu)選的為2.0L/min，所述氮氣的純度為99.999％。

本發(fā)明中將得到的無氧培養(yǎng)基進行滅菌后得到滅菌除氧后的培養(yǎng)基，本發(fā)明優(yōu)選采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的高溫濕熱滅菌法，所述滅菌的溫度優(yōu)選的為115～125℃，更優(yōu)選的為118～123℃，最優(yōu)選的為121℃；所述滅菌的時間優(yōu)選的為15～40min，更優(yōu)選的為20min。

本發(fā)明在得到滅菌除氧后的培養(yǎng)基，將所述滅菌除氧后的培養(yǎng)基與微量元素、鉬酸根離子和鋅離子混合，得到培養(yǎng)體系。本發(fā)明優(yōu)選的在得到無菌無氧培養(yǎng)基后使其自然冷卻至40℃以下，更優(yōu)選為40℃～10℃，然后將冷卻后滅菌除氧的培養(yǎng)基與微量元素、鋅離子和鉬酸根離子混合。

本發(fā)明提供了一種利用合成氣低溫發(fā)酵生產(chǎn)己醇的方法，包括以下步驟：

1)向上述技術(shù)方案所述培養(yǎng)體系中接入發(fā)酵菌種得到有菌培養(yǎng)體系；

2)向所述步驟1)得到的有菌培養(yǎng)體系中通入合成氣后密封，振蕩培養(yǎng)，得到包括乙醇、正丁醇和正己醇的發(fā)酵產(chǎn)物。

本發(fā)明在得到培養(yǎng)體系后，向所述培養(yǎng)體系中接入發(fā)酵菌種，得到有菌培養(yǎng)體系。本發(fā)明優(yōu)選在無菌無氧條件下向所述培養(yǎng)體系中接入發(fā)酵菌種，在本發(fā)明實施例中，優(yōu)選的所述接種在無菌厭氧操作箱中進行。在本發(fā)明中，所述發(fā)酵菌種的接種體積優(yōu)選的為培養(yǎng)體系體積的8～12％，更優(yōu)選的為10％。

在本發(fā)明中，所述接種用發(fā)酵菌種的OD₆₀₀的吸光值優(yōu)選的為0.6～1.5，更優(yōu)選的為0.8～1.2，最優(yōu)選的為1.0。本發(fā)明中所述接種用發(fā)酵菌種為處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。本發(fā)明中所述的發(fā)酵菌種為食氣厭氧菌，優(yōu)選的為Clostridium carboxidivorans P7，所述的Clostridium carboxidivorans P7購買自德國布倫瑞克的萊布尼茲研究所的德國微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，編號為DSM15243。

本發(fā)明在得到有菌培養(yǎng)體系后，向所述有菌培養(yǎng)體系中通入合成氣后密封，振蕩培養(yǎng)，得到含有乙醇、正丁醇和正己醇的產(chǎn)物。在本發(fā)明中，所述的合成氣優(yōu)選的包括以下體積含量的組份：45～55％的CO、30～40％的CO₂和10～20％的H₂，更優(yōu)選的包括50％的CO、35％的CO₂和15％的H₂；本發(fā)明對所述合成氣的來源沒有特殊的限定，具體的在本發(fā)明實施例中采用市售的合成氣。

在本發(fā)明中，所述合成氣的通入速度優(yōu)選的為1.5～2.5L/min，更優(yōu)選的為1.8～2.2L/min，最優(yōu)選的為2.0L/min；本發(fā)明中所述通入合成氣的壓力優(yōu)選的為0.15～0.25MPa，更優(yōu)選的為0.20MPa，本發(fā)明在通入合成氣后控制有菌培養(yǎng)體系的壓力在0.15～0.25MPa；本發(fā)明在完成通入合成氣后再次密封有菌培養(yǎng)體系。

本發(fā)明在向有菌培養(yǎng)體系通入合成氣密封后，對所述有菌培養(yǎng)體系進行振蕩培養(yǎng)。本發(fā)明中對所述密封的方法沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域常規(guī)的密封手段實現(xiàn)密封即可，具體的在本發(fā)明實施例中所述的密封采用橡膠塞進行；

在本發(fā)明中，所述振蕩培養(yǎng)的溫度優(yōu)選的為25～35℃，更優(yōu)選為28～38℃，最優(yōu)選的為30～37℃；所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速優(yōu)選的為100～250rpm，更優(yōu)選的為150～200rpm，最優(yōu)選的為180rpm；所述振蕩培養(yǎng)的時間優(yōu)選的為1～9天，更優(yōu)選的為3～6天，最優(yōu)選的為4～5天。

本發(fā)明在有菌培養(yǎng)體系培養(yǎng)過程中，優(yōu)選的定時取樣進行微生物生長情況和微生物發(fā)酵產(chǎn)物的檢測，以更好的確定發(fā)酵結(jié)束的時間；在本發(fā)明中所述的發(fā)酵產(chǎn)物包括乙醇、正丁醇和正己醇。所述微生物發(fā)酵產(chǎn)物的檢測方法為本領(lǐng)域常規(guī)的氣相色譜法。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的提高食氣厭氧菌利用合成氣發(fā)酵產(chǎn)醇能力的方法進行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

對比例1

將20ml的大量元素母液，477.5ml營養(yǎng)水溶液和2.5ml的還原劑配制成500ml培養(yǎng)基，其中大量元素母液包括以下質(zhì)量含量的組分：8％氯化鈉，10％氯化銨，1％氯化鉀，1％的磷酸二氫鉀，2％的硫酸鎂、0.4％的氯化鈣和余量的水；營養(yǎng)水溶液包括以下質(zhì)量的組分：0.5g的酵母提取物，2.5g的嗎啉乙磺酸和余量的水；還原劑包括以下質(zhì)量含量的組分：0.9％的氫氧化鈉，4％的L-半胱氨酸鹽酸鹽、4％的九水硫化鈉和余量的水。

將配制好的培養(yǎng)基分裝到100mL容量的血清瓶中，裝液量為20mL。用橡膠塞將瓶口密封，使用接有針頭的氮氣瓶以2L/min的速度向血清瓶中充入99.999％的氮氣用以去除血清瓶中殘留的氧氣，充氣時長達到5min后結(jié)束充氣，在121℃高溫滅菌20min。滅菌后，冷卻至40℃，再加入0.1ml的微量元素，不添加鉬元素、鋅元素和鎳元素，完成培養(yǎng)體系構(gòu)建，微量元素為包括氨三乙酸，硫酸鎂，硫酸亞鐵銨，氯化鈷，硒酸鈉和鎢酸鈉的溶液。

接入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Clostridium carboxidivorans菌株P(guān)7培養(yǎng)液5ml，(OD₆₀₀nm吸光值為0.8，再以2L/min流速，0.2MPa壓力持續(xù)通入模擬合成氣5min(合成氣的組成：50％CO、35％CO₂、15％H₂)用以清除血清瓶中的氮氣，使細(xì)菌完全處于合成氣的氣體環(huán)境下進行發(fā)酵，最后將合成氣加壓至0.2MPa密封。在37℃溫度條件下，180rpm下振蕩培養(yǎng)4天，每隔24h取樣檢測細(xì)胞濃度和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量。

結(jié)果如圖1所示，在培養(yǎng)的第四天，菌株的細(xì)胞濃度OD₆₀₀nm最大可達0.2Abs，最高乙醇產(chǎn)量為1.67g/L，檢測不到正丁醇和正己醇的產(chǎn)量。

實施例1

將15ml的大量元素母液，482.5ml營養(yǎng)水溶液和2.5ml的還原劑配制成500ml培養(yǎng)基，其中大量元素母液包括以下質(zhì)量含量的組分：8％氯化鈉，10％氯化銨，1％氯化鉀，1％的磷酸二氫鉀，2％的硫酸鎂、0.4％的氯化鈣和余量的水；營養(yǎng)水溶液包括以下質(zhì)量的組分：0.5g的酵母提取物，2.5g的嗎啉乙磺酸和余量的水；還原劑包括以下質(zhì)量含量的組分：0.9％的氫氧化鈉，4％的L-半胱氨酸鹽酸鹽、4％的九水硫化鈉和余量的水。

將配制好的培養(yǎng)基分裝到100mL容量的血清瓶中，裝液量為30mL。用橡膠塞將瓶口密封，使用接有針頭的氮氣瓶以2.5L/min的速度向血清瓶中充入99.999％的氮氣用以去除血清瓶中殘留的氧氣，充氣時長達到5min后結(jié)束充氣，在121℃高溫滅菌20min。滅菌后，冷卻至35℃，再加入0.1ml的微量元素、終濃度為0μM的鉬元素、終濃度為7μM的鋅元素和終濃度為0.84μM的鎳元素完成培養(yǎng)體系構(gòu)建，微量元素為包括氨三乙酸，硫酸鎂，硫酸亞鐵銨，氯化鈷，亞硒酸鈉和鎢酸鈉的溶液的溶液。

接入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Clostridium carboxidivorans菌株P(guān)7培養(yǎng)液4ml，(OD600nm吸光值為1.1，再以2L/min流速，0.2MPa壓力持續(xù)通入模擬合成氣5min(合成氣的組成：50％CO、35％CO₂、15％H₂)用以清除血清瓶中的氮氣，使細(xì)菌完全處于合成氣的氣體環(huán)境下進行發(fā)酵，最后將合成氣加壓至0.2MPa密封。在37℃溫度條件下，190rpm下振蕩培養(yǎng)4天，每隔24h取樣檢測細(xì)胞濃度和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量。如圖2所示，在培養(yǎng)的第四天，菌株的細(xì)胞濃度OD₆₀₀nm最大可達0.915Abs，檢測到的乙醇產(chǎn)量2.93g/L，正丁醇產(chǎn)量0.77g/L，正己醇的產(chǎn)量0.13g/L。

實施例2

將10ml的大量元素母液，487.5ml營養(yǎng)水溶液和2.5ml的還原劑配制成500ml培養(yǎng)基，其中大量元素母液包括以下質(zhì)量含量的組分：8％氯化鈉，10％氯化銨，1％氯化鉀，1％的磷酸二氫鉀，2％的硫酸鎂、0.4％的氯化鈣和余量的水；營養(yǎng)水溶液包括以下質(zhì)量的組分：0.5g的酵母提取物，2.5g的嗎啉乙磺酸和余量的水；還原劑包括以下質(zhì)量含量的組分：0.9％的氫氧化鈉，4％的L-半胱氨酸鹽酸鹽、4％的九水硫化鈉和余量的水。

將配制好的培養(yǎng)基分裝到100mL容量的血清瓶中，裝液量為30mL。用橡膠塞將瓶口密封，使用接有針頭的氮氣瓶以2.5L/min的速度向血清瓶中充入99.999％的氮氣用以去除血清瓶中殘留的氧氣，充氣時長達到5min后結(jié)束充氣，在121℃高溫滅菌30min。滅菌后，冷卻至45℃，再加入0.15ml的微量元素、終濃度為0μM的鉬元素、終濃度為70μM的鋅元素和終濃度為8.4μM的鎳元素，完成培養(yǎng)體系構(gòu)建，微量元素為包括氨三乙酸，硫酸鎂，硫酸亞鐵銨，氯化鈷，亞硒酸鈉和鎢酸鈉的溶液的溶液。

接入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Clostridium carboxidivorans菌株P(guān)7培養(yǎng)液2ml，(OD600nm吸光值為1.5，再以2L/min流速，0.2MPa壓力持續(xù)通入模擬合成氣5min(合成氣的組成：50％CO、35％CO₂、15％H₂)用以清除血清瓶中的氮氣，使細(xì)菌完全處于合成氣的氣體環(huán)境下進行發(fā)酵，最后將合成氣加壓至0.2MPa密封。在37℃溫度條件下，170rpm下振蕩培養(yǎng)4天，每隔24h取樣檢測細(xì)胞濃度和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量。如圖3所示，在培養(yǎng)的第四天，菌株的細(xì)胞濃度OD₆₀₀nm最大可達1.8Abs，最高乙醇產(chǎn)量為4.9g/L，正丁醇產(chǎn)量最高為0.916g/L，正己醇的產(chǎn)量為0.42g/L。

實施例3

將15ml的大量元素母液，484ml營養(yǎng)水溶液和1.0ml的還原劑配制成500ml培養(yǎng)基，其中大量元素母液包括以下質(zhì)量含量的組分：8％氯化鈉，10％氯化銨，1％氯化鉀，1％的磷酸二氫鉀，2％的硫酸鎂、0.4％的氯化鈣和余量的水；營養(yǎng)水溶液包括以下質(zhì)量的組分：0.5g的酵母提取物，2.5g的嗎啉乙磺酸和余量的水；還原劑包括以下質(zhì)量含量的組分：0.9％的氫氧化鈉，4％的L-半胱氨酸鹽酸鹽、4％的九水硫化鈉和余量的水。

將配制好的培養(yǎng)基分裝到100mL容量的血清瓶中，裝液量為20mL。用橡膠塞將瓶口密封，使用接有針頭的氮氣瓶以2.0L/min的速度向血清瓶中充入99.999％的氮氣用以去除血清瓶中殘留的氧氣，充氣時長達到5min后結(jié)束充氣，在121℃高溫滅菌20min。滅菌后，冷卻至35℃，再加入0.1ml的微量元素、終濃度為0μM的鉬元素、終濃度為140μM的鋅元素和終濃度為16.8μM的鎳元素，完成培養(yǎng)體系構(gòu)建，微量元素為包括氨三乙酸，硫酸鎂，硫酸亞鐵銨，氯化鈷，硒酸鈉和鎢酸鈉的溶液的溶液。

接入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Clostridium carboxidivorans菌株P(guān)7培養(yǎng)液4ml，(OD600nm吸光值為1.0，再以3L/min流速，0.2MPa壓力持續(xù)通入模擬合成氣5min(合成氣的組成：50％CO、35％CO₂、15％H₂)用以清除血清瓶中的氮氣，使細(xì)菌完全處于合成氣的氣體環(huán)境下進行發(fā)酵，最后將合成氣加壓至0.2MPa密封。在37℃溫度條件下，180rpm下振蕩培養(yǎng)4天，每隔24h取樣檢測細(xì)胞濃度和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量。結(jié)果如圖4所示，在培養(yǎng)的第四天，菌株的細(xì)胞濃度OD₆₀₀nm最大可達1.05Abs，最高乙醇產(chǎn)量為4.46g/L，正丁醇產(chǎn)量最高為1.98g/L，正己醇最高產(chǎn)量為0.26g/L,。

實施例4

將20ml的大量元素母液，477.5ml營養(yǎng)水溶液和2.5ml的還原劑配制成500ml培養(yǎng)基，其中大量元素母液包括以下質(zhì)量含量的組分：8％氯化鈉，10％氯化銨，1％氯化鉀，1％的磷酸二氫鉀，2％的硫酸鎂、0.4％的氯化鈣和余量的水；營養(yǎng)水溶液包括以下質(zhì)量的組分：0.5g的酵母提取物，2.5g的嗎啉乙磺酸和余量的水；還原劑包括以下質(zhì)量含量的組分：0.9％的氫氧化鈉，4％的L-半胱氨酸鹽酸鹽、4％的九水硫化鈉和余量的水。

將配制好的培養(yǎng)基分裝到100mL容量的血清瓶中，裝液量為20mL。用橡膠塞將瓶口密封，使用接有針頭的氮氣瓶以2L/min的速度向血清瓶中充入99.999％的氮氣用以去除血清瓶中殘留的氧氣，充氣時長達到5min后結(jié)束充氣，在121℃高溫滅菌20min。滅菌后，冷卻至40℃，再加入0.1ml的微量元素、終濃度為0.42μM的鉬元素、終濃度為70μM的鋅元素和終濃度為16.8μM的鎳元素完成培養(yǎng)體系構(gòu)建，微量元素為包括氨三乙酸，硫酸鎂，硫酸亞鐵銨，氯化鈷，硒酸鈉和鎢酸鈉的溶液。

接入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Clostridium carboxidivorans菌株P(guān)7培養(yǎng)液5ml，(OD600nm吸光值為0.7，再以2L/min流速，0.2MPa壓力持續(xù)通入模擬合成氣5min(合成氣的組成：50％CO、35％CO₂、15％H₂)用以清除血清瓶中的氮氣，使細(xì)菌完全處于合成氣的氣體環(huán)境下進行發(fā)酵，最后將合成氣加壓至0.2MPa密封。在37℃溫度條件下，180rpm下振蕩培養(yǎng)4天，每隔24h取樣檢測細(xì)胞濃度和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量。如圖5所示，在培養(yǎng)的第四天，菌株的細(xì)胞濃度OD₆₀₀nm最大可達0.908Abs，最高乙醇產(chǎn)量為2.82g/L，正丁醇產(chǎn)量最高為0.68g/L，正己醇含量為0.04g/L。

實施例5

將20ml的大量元素母液，477.5ml營養(yǎng)水溶液和2.5ml的還原劑配制成500ml培養(yǎng)基，其中大量元素母液包括以下質(zhì)量含量的組分：8％氯化鈉，10％氯化銨，1％氯化鉀，1％的磷酸二氫鉀，2％的硫酸鎂、0.4％的氯化鈣和余量的水；營養(yǎng)水溶液包括以下質(zhì)量的組分：0.5g的酵母提取物，2.5g的嗎啉乙磺酸和余量的水；還原劑包括以下質(zhì)量含量的組分：0.9％的氫氧化鈉，4％的L-半胱氨酸鹽酸鹽、4％的九水硫化鈉和余量的水。

將配制好的培養(yǎng)基分裝到100mL容量的血清瓶中，裝液量為20mL。用橡膠塞將瓶口密封，使用接有針頭的氮氣瓶以2L/min的速度向血清瓶中充入99.999％的氮氣用以去除血清瓶中殘留的氧氣，充氣時長達到5min后結(jié)束充氣，在121℃高溫滅菌20min。滅菌后，冷卻至40℃，再加入0.1ml的微量元素、終濃度為0.42μM的鉬元素、終濃度為140μM的鋅元素和終濃度為8.4μM的鎳元素完成培養(yǎng)體系構(gòu)建，微量元素為包括氨三乙酸，硫酸鎂，硫酸亞鐵銨，氯化鈷，硒酸鈉和鎢酸鈉的溶液。

接入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Clostridium carboxidivorans菌株P(guān)7培養(yǎng)液5ml，(OD600nm吸光值為0.7，再以2L/min流速，0.2MPa壓力持續(xù)通入模擬合成氣5min(合成氣的組成：50％CO、35％CO₂、15％H₂)用以清除血清瓶中的氮氣，使細(xì)菌完全處于合成氣的氣體環(huán)境下進行發(fā)酵，最后將合成氣加壓至0.2MPa密封。在37℃溫度條件下，180rpm下振蕩培養(yǎng)4天，每隔24h取樣檢測細(xì)胞濃度和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量。如圖6所示，培養(yǎng)的第四天的樣品進行檢測，菌株的細(xì)胞濃度OD₆₀₀nm最大可達0.843Abs，最高乙醇產(chǎn)量為2.78g/L，正丁醇產(chǎn)量最高為0.54g/L，正己醇含量為0.02g/L。

實施例6

將20ml的大量元素母液，477.5ml營養(yǎng)水溶液和2.5ml的還原劑配制成500ml培養(yǎng)基，其中大量元素母液包括以下質(zhì)量含量的組分：8％氯化鈉，10％氯化銨，1％氯化鉀，1％的磷酸二氫鉀，2％的硫酸鎂、0.4％的氯化鈣和余量的水；營養(yǎng)水溶液包括以下質(zhì)量的組分：0.5g的酵母提取物，2.5g的嗎啉乙磺酸和余量的水；還原劑包括以下質(zhì)量含量的組分：0.9％的氫氧化鈉，4％的L-半胱氨酸鹽酸鹽、4％的九水硫化鈉和余量的水。

將配制好的培養(yǎng)基分裝到100mL容量的血清瓶中，裝液量為20mL。用橡膠塞將瓶口密封，使用接有針頭的氮氣瓶以2L/min的速度向血清瓶中充入99.999％的氮氣用以去除血清瓶中殘留的氧氣，充氣時長達到5min后結(jié)束充氣，在121℃高溫滅菌20min。滅菌后，冷卻至35℃，再加入0.1ml的微量元素、終濃度為0.83μM的鉬元素、終濃度為0μM的鋅元素和終濃度為8.4μM的鎳元素完成培養(yǎng)體系構(gòu)建，微量元素為包括氨三乙酸，硫酸鎂，硫酸亞鐵銨，氯化鈷，硒酸鈉和鎢酸鈉的溶液。

接入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Clostridium carboxidivorans菌株P(guān)7培養(yǎng)液5ml，(OD600nm吸光值為0.7，再以2L/min流速，0.2MPa壓力持續(xù)通入模擬合成氣5min(合成氣的組成：50％CO、35％CO₂、15％H₂)用以清除血清瓶中的氮氣，使細(xì)菌完全處于合成氣的氣體環(huán)境下進行發(fā)酵，最后將合成氣加壓至0.2MPa密封。在37℃溫度條件下，180rpm下振蕩培養(yǎng)4天，每隔24h取樣檢測細(xì)胞濃度和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量。如圖7所示，培養(yǎng)的第四天的樣品進行檢測，菌株的細(xì)胞濃度OD₆₀₀nm最大可達0.872Abs，最高乙醇產(chǎn)量為2.76g/L，正丁醇產(chǎn)量最高為0.56g/L，正己醇含量為0.01g/L。

實施例7

將20ml的大量元素母液，477.5ml營養(yǎng)水溶液和2.5ml的還原劑配制成500ml培養(yǎng)基，其中大量元素母液包括以下質(zhì)量含量的組分：8％氯化鈉，10％氯化銨，1％氯化鉀，1％的磷酸二氫鉀，2％的硫酸鎂、0.4％的氯化鈣和余量的水；營養(yǎng)水溶液包括以下質(zhì)量的組分：0.5g的酵母提取物，2.5g的嗎啉乙磺酸和余量的水；還原劑包括以下質(zhì)量含量的組分：0.9％的氫氧化鈉，4％的L-半胱氨酸鹽酸鹽、4％的九水硫化鈉和余量的水。

將配制好的培養(yǎng)基分裝到100mL容量的血清瓶中，裝液量為20mL。用橡膠塞將瓶口密封，使用接有針頭的氮氣瓶以2L/min的速度向血清瓶中充入99.999％的氮氣用以去除血清瓶中殘留的氧氣，充氣時長達到5min后結(jié)束充氣，在121℃高溫滅菌20min。滅菌后，冷卻至40℃，再加入0.1ml的微量元素、終濃度為0.83μM的鉬元素、終濃度為7μM的鋅元素和終濃度為16.8μM的鎳元素完成培養(yǎng)體系構(gòu)建，微量元素為包括氨三乙酸，硫酸鎂，硫酸亞鐵銨，氯化鈷，硒酸鈉和鎢酸鈉的溶液。

接入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Clostridium carboxidivorans菌株P(guān)7培養(yǎng)液5ml，(OD600nm吸光值為0.7，再以2L/min流速，0.2MPa壓力持續(xù)通入模擬合成氣5min(合成氣的組成：50％CO、35％CO₂、15％H₂)用以清除血清瓶中的氮氣，使細(xì)菌完全處于合成氣的氣體環(huán)境下進行發(fā)酵，最后將合成氣加壓至0.2MPa密封。在37℃溫度條件下，180rpm下振蕩培養(yǎng)4天，每隔24h取樣檢測細(xì)胞濃度和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量。如圖8所示，培養(yǎng)的第四天的樣品進行檢測，菌株的細(xì)胞濃度OD₆₀₀nm最大可達0.832Abs，最高乙醇產(chǎn)量為3.12g/L，正丁醇產(chǎn)量最高為0.55g/L，正己醇含量為0.04g/L。

由以上實施例可知，本發(fā)明通過構(gòu)建包括培養(yǎng)基、微量元素和關(guān)鍵金屬元素的培養(yǎng)體系，并利用所述培養(yǎng)體系對食氣厭氧菌進行發(fā)酵，尤其是對培養(yǎng)體系中鉬元素、鋅元素和鎳元素的濃度協(xié)調(diào)調(diào)整，提高了食氣厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)醇類的能力，以Clostridium carboxidivorans P7為例，在本發(fā)明所述的發(fā)酵系統(tǒng)中，不僅微生物的生長狀況較好，OD₆₀₀nm最大達到1.8，顯著高于Clostridium carboxidivorans P7的普通培養(yǎng)體系，同時乙醇、正丁醇和正己醇的產(chǎn)量也有明顯提升。本發(fā)明所述的培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法使得細(xì)胞濃度與醇類物質(zhì)合成能力均得到大幅度提升，而且，這三種元素的濃度比例十分關(guān)鍵，在鉬離子濃度低于0.42μM、鋅離子濃度不低于70μM和鎳離子濃度不低于0.84μM的情況下，乙醇產(chǎn)量可達4.9g/L、正丁醇產(chǎn)量可達1.98g/L、正己醇產(chǎn)量可達0.42g/L，其中乙醇和正丁醇產(chǎn)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鉬離子濃度高于0.42μM、鋅離子濃度低于70μM和鎳離子濃度低于0.84μM的情況。由此可見，本發(fā)明培養(yǎng)體系中鉬元素、鋅元素和鎳元素的濃度調(diào)整，有利于提高食氣厭氧菌的生產(chǎn)醇類物質(zhì)的能力，提高發(fā)酵產(chǎn)物中乙醇和正丁醇的產(chǎn)量，并且豐富了發(fā)酵產(chǎn)物中醇類物質(zhì)的種類，使得食氣厭氧菌能夠生產(chǎn)正己醇。綜上所述，本發(fā)明提供的方法提高了食氣厭氧菌利用合成氣產(chǎn)醇類物質(zhì)的能力。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。