本發(fā)明涉及肌醇的制備方法，尤其涉及體外多酶催化將淀粉或纖維素以及它們的衍生物轉(zhuǎn)化為肌醇的方法，屬于肌醇的酶催化生產(chǎn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肌醇又名環(huán)已六醇，是水溶性維生素B族中的一種。肌醇是人、動物與微生物生長的必需物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)。目前全球的需求量大概在每年5,000噸左右，由于目前肌醇的高售價，使得肌醇的市場前景還未得到充分的開發(fā)，例如2013年全球飼料產(chǎn)量為9.6億噸，如果都加入0.2-0.5％的肌醇，那么飼料工業(yè)所需肌醇的產(chǎn)量應(yīng)該達到每年190-480萬噸。在這種情況下，目前中國國內(nèi)，甚至全世界的產(chǎn)量都遠遠不能滿足需求。

目前肌醇的生產(chǎn)主要還是傳統(tǒng)的高溫加壓水解植酸(六磷酸肌醇)。該工藝設(shè)備材質(zhì)要求嚴格，一次性投資大，操作壓力只能控制在一定的范圍內(nèi)，限制了原材料利用率的提高，且粗產(chǎn)品精制工藝復雜，損失較多，生產(chǎn)成本較高，而且該工藝會產(chǎn)生大量的磷酸污染物，對水源，環(huán)境污染嚴重。近些年，為了減少能耗和污染開發(fā)了常壓水解法。目前研究肌醇生產(chǎn)的熱點在化學合成法和微生物酶解法，然而均不同程度的存在成本高、產(chǎn)率低等問題。

因此，亟待開發(fā)一種低成本，低污染，高產(chǎn)率的生產(chǎn)肌醇的新方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種肌醇的酶催化轉(zhuǎn)化方法，通過體外多酶催化淀粉或纖維素以及它們的衍生物和葡萄糖生產(chǎn)肌醇的方法，該方法具有肌醇產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率高，生產(chǎn)成本低，無污染等優(yōu)點。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明首先公開了一種肌醇的制備方法，包括以下步驟：

(1)以淀粉或淀粉衍生物為底物，加入葡聚糖磷酸化酶(α-Glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1)，葡萄糖磷酸變位酶(Phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2)，肌醇-3-磷酸合成酶(Inositol-3-phophate synthase，EC 5.5.1.4)和肌醇單磷酸酶(Inositol monophosphatase，EC 3.1.3.25)建立多酶反應(yīng)體系，進行酶催化反應(yīng)；(2)將反應(yīng)產(chǎn)物進行分離、純化，即得。

其中，步驟(1)所述底物的濃度為10g/L；所述葡聚糖磷酸化酶的用量為0.05U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為1U/mL，所述肌醇-3-磷酸合成酶的用量為0.05U/mL，所述肌醇單磷酸酶的用量為2U/mL；所述酶催化反應(yīng)的條件是在40-80℃反應(yīng)10-100小時；優(yōu)選為，在60℃反應(yīng)40小時。

在所述多酶反應(yīng)體系中加入淀粉去分支酶和麥芽糖磷酸化酶(EC2.4.1.8)，或者，淀粉去分支酶和葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.25)，能夠有效提高肌醇的得率和轉(zhuǎn)化率；優(yōu)選的，所述淀粉去分支酶的用量為1U/mL，所述麥芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)或葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的用量為1U/mL；其中，所述去分支酶為異淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.68)或普魯蘭酶(pullulanase，EC 3.2.1.41)中的任意一種或兩種；

更優(yōu)選的，所述底物的濃度為10g/L；所述葡聚糖磷酸化酶的用量為5U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為1U/mL，所述肌醇-3-磷酸合成酶的用量為5U/mL，所述肌醇單磷酸酶的用量為2U/mL，所述淀粉去分支酶的用量為1U/mL，所述麥芽糖磷酸化酶或葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的用量為1U/mL；

所述酶催化反應(yīng)在40-100℃反應(yīng)10-100小時；優(yōu)選的，所述酶催化反應(yīng)在40-80℃反應(yīng)40小時；最優(yōu)選的，所述酶催化反應(yīng)在80℃反應(yīng)40小時。

為了進一步提高肌醇的得率，將冗余的葡萄糖轉(zhuǎn)化為肌醇，在所述多酶反應(yīng)體系中加入聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC2.7.1.63)和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為1U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為10mM；其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。

所述多酶反應(yīng)體系還含有以下各成分：緩沖液、無機磷酸根、二價鎂離子和鋅離子或錳離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液100mM，無機磷酸根10mM，二價鎂離子5mM，鋅離子或錳離子0.5mM；其中，所述緩沖液優(yōu)選為HEPES緩沖液，更優(yōu)選的，HEPES緩沖液的pH值7.2。

反應(yīng)結(jié)束后，殘余的淀粉殘渣將是純的直鏈淀粉，此時可加入少量的α淀粉酶(EC 3.2.1.1)促進淀粉殘渣的水解，進一步提高肌醇的產(chǎn)量。優(yōu)選的，α淀粉酶的用量為0.1U/ml。

本發(fā)明以淀粉或淀粉衍生物為底物，加入葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸變位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，配制多酶反應(yīng)體系，多酶催化途徑包括：由葡聚糖磷酸化酶將淀粉或淀粉衍生物中的一個葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸變位酶將葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-3-磷酸合成酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇-3-磷酸，由肌醇單磷酸酶將肌醇-3-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇。由于由肌醇-3-磷酸合成酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇-3-磷酸和由肌醇單磷酸酶將肌醇-3-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇的兩個酶催化反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，所以該酶催化體系能夠得到很高的轉(zhuǎn)化率。而高得率和高轉(zhuǎn)化率可以大大降低最終肌醇的分離成本。

由于淀粉是直鏈淀粉(20-30％)和支鏈淀粉(70-80％)的混合物。支鏈淀粉中的支鏈是以α-1,6糖苷鍵與主鏈相連的，而葡聚糖磷酸化酶并不能分解α-1,6糖苷鍵。為了提高肌醇的轉(zhuǎn)化率，本發(fā)明在多酶反應(yīng)體系中加入了能夠分解淀粉中α-1,6糖苷鍵的去分支酶—異淀粉酶或普魯蘭酶。由于葡聚糖磷酸化酶水解淀粉的最終產(chǎn)物是麥芽糖，為了利用麥芽糖， 本發(fā)明還在反應(yīng)體系中加入麥芽糖磷酸化酶，將麥芽糖分解為葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖；更優(yōu)選的，本發(fā)明在多酶反應(yīng)體系中再加入聚磷酸和聚磷酸葡萄糖激酶，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，由肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶轉(zhuǎn)化為肌醇，最終將淀粉及其衍生物中所有的葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為肌醇，從而提高肌醇的得率和轉(zhuǎn)化率。在這里，麥芽糖磷酸化酶可被葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)替換，該酶可以將短鏈的寡聚糖聚合成為長鏈的寡聚糖，而該長鏈的寡聚糖又可被葡聚糖磷酸化酶重新利用，從而能夠提高淀粉的利用率。

本發(fā)明所述淀粉優(yōu)選為可溶性淀粉；所述淀粉衍生物包括部分水解淀粉、淀粉糊精、麥芽糊精、麥芽多糖或麥芽糖中的任意一種或多種。

本發(fā)明還公開了另一種肌醇的制備方法，包括以下步驟：

(1)以纖維素或纖維素衍生物為底物，加入纖維素酶，纖維多糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase，EC 2.4.1.49)、纖維二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20)、葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.2)、肌醇-3-磷酸合成酶(EC 5.5.1.4)和肌醇單磷酸酶(EC 3.1.3.25)建立多酶反應(yīng)體系，進行酶催化反應(yīng)；(2)將反應(yīng)產(chǎn)物分離、純化，即得。

本發(fā)明以纖維素為底物，加入纖維素酶，纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，配制多酶反應(yīng)體系，該多酶催化途徑包括：由纖維素酶水解纖維素生成纖維多糖和纖維二糖；由纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶將纖維多糖或纖維二糖的一個葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸變位酶將葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-3-磷酸合成酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇-3-磷酸，由肌醇單磷酸酶將肌醇-3-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇。

其中，步驟(1)優(yōu)選為，先將10g/L纖維素或纖維素衍生物和5U/ml纖維素酶在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，然后4^oC離心，去上清，得到纖維素酶和纖維素的混合物；該處理能夠去除商業(yè)化纖維素酶中幾乎所有的葡萄糖苷酶，這樣可以避免葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成大量的葡萄糖，從而使主要的水解產(chǎn)物是纖維二糖和纖維多糖。

在多酶反應(yīng)體系中，所述纖維素酶和纖維素的混合物的濃度為10g/L；所述纖維多糖磷酸化酶的用量為5U/mL，所述纖維二糖磷酸化酶的用量為5U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為1U/mL，所述肌醇-3-磷酸合成酶的用量為5U/mL，所述肌醇單磷酸酶的用量為2U/mL；所述酶催化反應(yīng)是在20-100℃反應(yīng)10-100小時；優(yōu)選為，在40-80℃反應(yīng)72小時；最優(yōu)選為，在50℃反應(yīng)72小時。

為了進一步提高肌醇的得率，步驟(1)中的多酶反應(yīng)體系加入聚磷酸葡萄糖激酶(EC 2.7.1.63)和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為5U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為10mM；其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。

為了提高酶催化反應(yīng)的效率和產(chǎn)品的收率，所述多酶反應(yīng)體系還含有 以下各成分：緩沖液、無機磷酸根、二價鎂離子和鋅離子或錳離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液100mM，無機磷酸根10mM，二價鎂離子5mM，鋅離子或錳離子0.5mM；其中，所述緩沖液優(yōu)選為100mM HEPES緩沖液；進一步優(yōu)選的，所述HEPES緩沖液的pH值是7.2。

本發(fā)明在多酶反應(yīng)體系中再加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸，將纖維素水解后的最終產(chǎn)物葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，再由肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶催化轉(zhuǎn)化為肌醇，最終將纖維素及其衍生物中所有的葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為肌醇。

本發(fā)明所述纖維素衍生物包括纖維素經(jīng)過預(yù)處理后的產(chǎn)物，纖維多糖或纖維二糖中的任意一種；

其中，纖維素預(yù)處理方法有多種，例如酸水解法、酶水解法、物理法等；本發(fā)明所述纖維素經(jīng)過預(yù)處理后的產(chǎn)物，優(yōu)選為纖維素經(jīng)過濃磷酸處理后的產(chǎn)物。

本發(fā)明多酶反應(yīng)體系中的任何一種酶還可以為任何一種具有同等功能的酶所替換，優(yōu)選為通過蛋白質(zhì)工程改造所獲得的具有同等功能的突變酶。

本發(fā)明體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇試驗中，在一個反應(yīng)體系中，以可溶性淀粉為原料，加入葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸變位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，進行催化反應(yīng)，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率為16％。在上述反應(yīng)體系中另外加入異淀粉酶，麥芽糖磷酸化酶，聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鈉，同時提高葡聚糖磷酸化酶和肌醇-3-磷酸合成酶的用量，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率達到72％，轉(zhuǎn)化率顯著提高。

本發(fā)明體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇實驗中，在一個反應(yīng)體系中，以微晶形的纖維素(Avicel)為底物，加入纖維素酶、纖維多糖磷酸化酶，纖維二糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸變位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，進行催化反應(yīng)，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率為14％；以重生的非晶形的纖維素為底物，加入纖維素酶、纖維多糖磷酸化酶，纖維二糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸變位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，進行催化反應(yīng)，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率為48％。在上述反應(yīng)體系中另外加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鈉，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率達到65％，轉(zhuǎn)化率顯著提高。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明在一個多酶反應(yīng)體系中，以淀粉或纖維素以及它們的衍生物為原料，通過體外多酶催化轉(zhuǎn)化為肌醇，并通過過程優(yōu)化，添加能促進淀粉或纖維素水解的酶以及利用副產(chǎn)物(葡萄糖)的酶，使轉(zhuǎn)化效率顯著提高，高得率和高轉(zhuǎn)化率又大大降低肌醇的分離成本。本發(fā)明方法具有簡便，原料利用率高、肌醇產(chǎn)率高，生產(chǎn)成本低，污染低等優(yōu)點，可以實現(xiàn)肌醇的規(guī)?；a(chǎn)。

本發(fā)明所涉及到的術(shù)語及定義

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。

術(shù)語“酶催化反應(yīng)”意指在生物催化劑-酶作用下進行的化學反應(yīng)。

術(shù)語“葡萄糖多聚物”意指葡萄糖分子聚合而成的淀粉或纖維素。

術(shù)語“葡萄糖寡聚物”意指部分水解的淀粉、淀粉糊精、麥芽多糖、麥芽糖、纖維多糖或纖維二糖等。

附圖說明

圖1為轉(zhuǎn)化淀粉生成肌醇的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，IA，異淀粉酶；PA，普魯蘭酶；αGP，葡聚糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；IPS，肌醇-3-磷酸合成酶；IMP，肌醇單磷酸酶；MP，麥芽糖磷酸化酶(該酶可被葡聚糖轉(zhuǎn)移酶替換)；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；

圖2為SDS-PAGE檢測4個關(guān)鍵酶；其中，第1列，葡聚糖磷酸化酶；第2列，葡萄糖磷酸變位酶；第3列，肌醇-3-磷酸合成酶；第4列，肌醇單磷酸酶；

圖3為利用HPLC分析肌醇；其中，圖3a為用HPLC方式區(qū)分肌醇、葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸；圖3b為用HPLC定量分析肌醇的濃度，通過肌醇峰的強度可以定量得到肌醇的濃度；

圖4為利用HPLC檢測以可溶性淀粉為底物，經(jīng)過酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物，箭頭所指表示肌醇的特征峰；

圖5為利用HPLC檢測以麥芽糊精為底物，經(jīng)過酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物，箭頭所指表示肌醇的特征峰；

圖6為轉(zhuǎn)化纖維素生成肌醇的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，Cellulase，纖維素酶；CDP，纖維多糖磷酸化酶；CBP，纖維二糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；IPS，肌醇-3-磷酸合成酶；IMP，肌醇單磷酸酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；

圖7為SDS-PAGE檢測轉(zhuǎn)化纖維素生成肌醇的2個關(guān)鍵酶；其中，第1列，纖維二糖磷酸化酶，第2列，纖維多糖磷酸化酶；

圖8為利用HPLC檢測以微晶形纖維素(Avicel)為底物，經(jīng)過酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物，箭頭所指表示肌醇的特征峰。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。

實驗材料

可溶性淀粉，soluble starch，ACROS公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號：424490020；

麥芽糊精，ALDRICH公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號419672；

pET20b載體，Novagen，Madison，WI；

大腸桿菌表達菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；

本發(fā)明中的大部分酶(除了肌醇單磷酸酶，聚磷酸葡萄糖激酶和葡聚糖轉(zhuǎn)移酶)能在Sigma公司購買得到；但是都可以按照基因工程方法通過原核表達獲得；

纖維素酶從Sigma公司購買，產(chǎn)品編號為C2730；

麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購買，產(chǎn)品編號為M8284；

α淀粉酶從Sigma公司購買，產(chǎn)品編號為10065；

Avicel，微晶形纖維素，從Sigma公司購買，產(chǎn)品編號為11365。

實驗例1體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

通過一個體外多酶催化體系將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇(圖1)。這些關(guān)鍵酶包括：(1)葡聚糖磷酸化酶(αGP，EC 2.4.1.1)，從淀粉上釋放出葡萄糖-1-磷酸；(2)葡萄糖磷酸變位酶(PGM，EC 5.4.2.2)，催化葡萄糖-1-磷酸到葡萄糖-6-磷酸；(3)肌醇-3-磷酸合成酶(IPS，EC 5.5.1.4)，其催化葡萄糖-6-磷酸為肌醇-3-磷酸；(4)肌醇單磷酸酶(IMP，EC 3.1.3.25)，其將肌醇-3-磷酸脫磷成為肌醇。由于最后兩個酶反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，所以該酶催化體系能夠得到很高的轉(zhuǎn)化率。

在本發(fā)明中，葡聚糖磷酸化酶來源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的編號為TM1168，葡萄糖磷酸變位酶也來源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的編號為TM0769，肌醇-3-磷酸合成酶來源于Archaeoglobus fulgidus，基因在KEGG上的編號為AF1794，肌醇單磷酸酶也來源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的編號為TM1415，這些基因組DNA都可從ATCC的官方網(wǎng)站(www.atcc.org)上獲得。這四個基因分別用不同的引物從相應(yīng)的基因組DNA中通過PCR獲取，并通過Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體((Novagen,Madison,WI)中，獲得相應(yīng)的表達載體pET20b-TmαGP，pET20b-AfIPS，pET20b-TmPGM和pET20b-TmIMP。這四個質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并進行蛋白質(zhì)表達與純化，蛋白質(zhì)純化的結(jié)果如圖2所示。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，0.05U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，0.05U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的可溶性淀粉，在60℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個小時。

根據(jù)保持時間的不同，HPLC可以用來區(qū)分反應(yīng)液中的肌醇、葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸或葡萄糖-6-磷酸(圖3a)；并且可以對肌醇進行定量，如圖3b所示，肌醇的濃度與HPLC中肌醇特征峰的強度是成正比的；HPLC的流動相為5mM的稀硫酸。

反應(yīng)結(jié)束后，最終肌醇(圖4)的終濃度是1.6g/L，轉(zhuǎn)化率為16％。

實驗例2體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，0.05U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，0.05U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的可溶性淀粉，在40℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個小時。

反應(yīng)結(jié)束后，最終肌醇的終濃度是0.9g/L，轉(zhuǎn)化率為9％。

實驗例3體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，0.05U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，0.05U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的可溶性淀粉，在80℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個小時。

反應(yīng)結(jié)束后，最終肌醇的終濃度是3.6g/L，轉(zhuǎn)化率為36％。

實驗例4通過過程優(yōu)化和添加促進淀粉水解的酶，利用體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

由于淀粉是有分支鏈，單純采用葡聚糖磷酸化酶并不能完全將淀粉水解，因為葡聚糖磷酸化酶只會作用于α-1，4糖苷鍵，而分支鏈是以α-1，6糖苷鍵與主鏈連接的。這需要加入異淀粉酶(isoamylase，EC 3.2.1.68)水解α-1，6糖苷鍵。最后，淀粉被這兩種酶水解的最終產(chǎn)物是麥芽糖和葡萄糖，為了將這些最終產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為肌醇，還需要加入麥芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)和聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC 2.7.1.63)。

在本發(fā)明中，異淀粉酶來源于Sulfolobus tokodaii，基因在KEGG上的編號為ST0928，該菌株的基因組DNA是德國Albert-Ludwigs-Freiburg的Georg Fuchs教授友情提供。聚磷酸葡萄糖激酶來源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的編號為Tfu1811，該菌株的基因組 DNA是美國康奈爾大學的David Wilson教授友情提供。葡聚糖轉(zhuǎn)移酶來源于Thermococcus litoralis，基因在KEGG上的編號為OCC_10078，該菌株的基因組DNA可從ATCC的官方網(wǎng)站(www.atcc.org)上獲得。這三個基因分別用不同的引物從相應(yīng)的基因組DNA中通過PCR獲取，并通過Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應(yīng)的表達載體pET20b-StIA，pET20b-TfuPPGK和pET20b-Ti4GT，這三個質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，并進行蛋白質(zhì)表達與純化。

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購買，產(chǎn)品編號為M8284。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，1U/mL的異淀粉酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸鈉，10g/L的可溶性淀粉，在80℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個小時。最終肌醇(圖4)的終濃度為7.2g/L，轉(zhuǎn)化率達到了72％。

實驗例5通過過程優(yōu)化和添加促進淀粉水解的酶，利用體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實驗例4，普魯蘭酶(pullulanase，EC 3.2.1.41)從Sigma公司購買，產(chǎn)品編號為P1067；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購買，產(chǎn)品編號為M8284。

由于從sigma公司購買的普魯蘭酶不能在高溫(80℃)下反應(yīng)，因此先在37℃用普魯蘭酶處理可溶性淀粉，隨后再加入其他的酶，再在80℃反應(yīng)。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，1U/mL的普魯蘭酶，10mM聚磷酸鈉，10g/L的可溶性淀粉，在37℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)10個小時后加入5U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，在80℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個小時。最終肌醇(圖4)的終濃度為7.3g/L，轉(zhuǎn)化率達到了73％。

隨后在反應(yīng)體系中加入少量的α淀粉酶促進殘渣淀粉的水解，提高肌醇的產(chǎn)量，α淀粉酶的用量為0.1U/ml，反應(yīng)先在37℃反應(yīng)6小時，隨后 繼續(xù)在80℃反應(yīng)24小時，最終肌醇(圖4)的終濃度為8.8g/L，轉(zhuǎn)化率達到了88％。

實驗例6體外多酶催化將麥芽糊精轉(zhuǎn)化為肌醇

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1；異淀粉酶、聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實驗例4，麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購買，產(chǎn)品編號為M8284；

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，1U/mL的異淀粉酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸鈉，10g/L的麥芽糊精(ALDRICH公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號419672)，在80℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個小時。最終肌醇(圖5)的終濃度為7.8g/L，轉(zhuǎn)化率達到了78％。

實驗例7體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

通過一個體外多酶催化體系將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇的示意圖見圖6。

纖維素酶是來自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1。

纖維多糖磷酸化酶(Cthe_2989)和纖維二糖磷酸化酶(Cthe_0275)都是來源于Clostridium thermocellum。這兩個基因分別用不同的引物從相應(yīng)的基因組DNA(基因組DNA可從ATCC的官方網(wǎng)站(www.atcc.org/)上獲得)中通過PCR獲取，并通過Simple Cloning(You,C.,et al.(2012))的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應(yīng)的表達載體pET20b-CthCDP和pET20b-CthCBP。這兩個質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，并進行蛋白質(zhì)表達與純化，蛋白質(zhì)純化的結(jié)果如圖7所示。

本實驗采用微晶形纖維素(Avicel)為底物。首先將商業(yè)化的纖維素酶(5U/ml)和纖維素(10g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，在4℃離心，去上清。沉淀為纖維素和能與纖維素結(jié)合的纖維素酶的混合物。該處理能夠去除商業(yè)化纖維素酶中幾乎所有的葡萄糖苷酶，這樣可以避免葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成大量的葡萄糖，從而使主要的水解產(chǎn)物是纖維二糖和纖維多糖。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的如上所述的纖維素和纖維素酶的混合物，在50℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個小時。最終肌醇的終濃度是1.4g/L，轉(zhuǎn)化率為14％，如圖8所示。

實驗例8體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

纖維素酶是來自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶、肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實驗例7。

本實驗采用重生的非晶形的纖維素(Regenerated Amorphous cellulose(RAC)，這是Avicel經(jīng)過濃磷酸處理后的產(chǎn)物)(Zhang,Y.H.P.,et al.(2006)."A Transition from Cellulose Swelling to Cellulose Dissolution by o-Phosphoric Acid:Evidence from Enzymatic Hydrolysis and Supramolecular Structure."Biomacromolecules 7(2):644-648.)為底物。首先將商業(yè)化的纖維素酶(5U/ml)和該纖維素(10g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，在4℃離心，去上清。沉淀為纖維素和能與纖維素結(jié)合的纖維素酶的混合物。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的如上所述的纖維素和纖維素酶的混合物，在50℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個小時。最終肌醇的終濃度是4.8g/L，轉(zhuǎn)化率為48％。

實驗例9體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

纖維素酶是來自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶、肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實驗例7。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的如實驗例8的纖維素和纖維素酶的混合物，在40℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個小時。最終肌醇的終濃度是2.3g/L，轉(zhuǎn)化率為23％。

實驗例10體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

纖維素酶是來自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶、肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實驗例7。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的 如實驗例8的纖維素和纖維素酶的混合物，在80℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個小時。最終肌醇的終濃度是1.9g/L，轉(zhuǎn)化率為19％。

實驗例11體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

由于纖維素水解后的最終產(chǎn)物為葡萄糖，為了將其轉(zhuǎn)化為肌醇，還需要加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸。

纖維素酶是來自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實驗例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實驗例4；纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶的制備同實驗例7。

在一個0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無機磷酸根，5mM的二價鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的如實驗例8的纖維素和纖維素酶的混合物，5U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸鈉，在50℃進行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個小時。最終肌醇(圖8)的終濃度為6.5g/L，轉(zhuǎn)化率達到了65％。