本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種蠶絲絲素纖維止血材料的制備方法。

背景技術(shù)：

日常生活中，意外的創(chuàng)傷或者是手術(shù)都會(huì)引起身體不同部位不同程度的出血。成年人出血量超過(guò)800～1000毫升就會(huì)引起休克；若大動(dòng)脈嚴(yán)重出血?jiǎng)t傷者可能在一分鐘內(nèi)就死亡。因此，止血是搶救出血傷員的首要措施。優(yōu)秀的止血材料不僅要及時(shí)有效的幫助患者止血，還要有良好的生物相容性，降解性等。開(kāi)發(fā)價(jià)格低廉，制備工藝簡(jiǎn)單，止血效果更佳的材料有巨大的社會(huì)效益。

研究證實(shí)鈣離子(凝血因子Ⅳ)與凝血過(guò)程中的諸多環(huán)節(jié)有關(guān)。凝血因子I(纖維蛋白原)是在凝血酶的作用下變成纖維蛋白聚合體的，然后纖維蛋白聚合體在鈣離子的作用下變成穩(wěn)定的纖維蛋白實(shí)現(xiàn)凝血。而在凝血酶的形成過(guò)程中，凝血因子III、凝血因子V、鈣離子都起到了促進(jìn)作用。另外，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高濃度的鈣離子對(duì)促進(jìn)血小板收縮形成血栓也有促進(jìn)作用。

我國(guó)是蠶桑大國(guó)，蠶絲年產(chǎn)量在10萬(wàn)噸以上。通過(guò)脫膠我們可以從蠶絲獲得絲素蛋白，其質(zhì)量占蠶絲高達(dá)70％～80％。絲素蛋白是一種天然的高分子纖維蛋白，利用絲素蛋白的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)生物醫(yī)用材料前景非常廣闊。目前，已經(jīng)有一些用絲素蛋白來(lái)制備止血材料的研究，但是這研究都是用粉劑類(lèi)的絲素蛋白或者絲素肽改性來(lái)制備的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用脫膠絲素纖維制備止血材料的有效方法，該方法制備的蠶絲絲素纖維止血材料工藝簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、原料豐富、止血性能優(yōu)異、生物相容性好、可體內(nèi)降解。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下措施實(shí)現(xiàn)的：

一種蠶絲絲素纖維止血材料的制備方法，包括以下步驟：

(1)蠶繭剪成小片進(jìn)行乙醚抽提；

(2)將抽提后繭片放入含有0.1-0.5％Na₂CO₃和0.1-0.5％肥皂的沸水溶液中脫膠；然后洗滌，擰干，低溫烘干得脫膠絲素；

(3)將脫膠絲素放入質(zhì)量濃度≤40％CaCl₂溶液中浸泡；將充分吸收CaCl₂溶液的絲素預(yù)冷凍；然后進(jìn)行冷凍干燥，得到絲素止血材料。

優(yōu)選的，上述蠶絲絲素止血材料的制備方法，包括以下步驟：

(1)新鮮蠶繭剪成小片，以乙醚為提取劑進(jìn)行索氏提取去除繭片上的脂肪、血脂，取繭片裝入圓筒狀濾紙中，接好冷凝管、抽提管和平底燒瓶，保證密閉性后，將濾紙包好的蠶繭放入提取管中，從上端加入乙醚，并設(shè)置溫度為60℃，虹吸抽提2小時(shí)，抽提完成后取出繭片，自然風(fēng)干；

(2)放入預(yù)先配置的(0.25％Na₂CO₃或0.25％肥皂)沸水溶液中脫膠30min，脫膠重復(fù)兩次；脫膠完成后的繭片用去離子水充分洗滌，擰干，低溫烘干(50-80℃，6-12h)得脫膠絲素；脫膠是否徹底，用苦味酸胭脂紅溶液檢驗(yàn)；取少量絲素用苦味酸胭脂紅溶液染色幾分鐘，幾分鐘后洗去試劑，若絲素呈金黃色則脫膠干凈，若呈紅色，則脫膠不徹底；

(3)室溫下，將步驟(2)中得到的脫膠絲素纖維按1∶100的固液比放入預(yù)先配制的CaCl₂溶液中微溶10min，而后將吸收CaCl₂溶液后的絲素放入-80℃冰箱預(yù)冷凍；

(4)將步驟(3)中預(yù)冷凍的絲素纖維經(jīng)冷凍干燥制得蠶絲絲素纖維止血材料。

所述乙醚濃度為分析純。

上述CaCl₂溶液濃度為10％-40％。

上述預(yù)冷凍時(shí)間為2-48h，上述冷凍干燥條件為-50℃，24-48h。

本發(fā)明中，絲素纖維上有大量的極性基團(tuán)，在氯化鈣溶液中，絲素纖維的極性基團(tuán)(如羥基)與鈣離子鰲合形成螯合物，絲素纖維分子及肽鏈間的次價(jià)鍵遭到破壞，絲素纖維因此在氯化鈣溶液中發(fā)生微溶解，鈣離子也因此固定、附著于絲素纖維上，很好的保持絲素的自然形態(tài)，使其質(zhì)地均勻。

有益效果

1.本發(fā)明方法所制備的絲素止血材料以脫膠蠶絲為原料，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉。且本發(fā)明制備的絲素止血材料無(wú)菌、無(wú)細(xì)胞毒性、無(wú)致敏和刺激作用，能夠快速大量止血，適用于體外和體內(nèi)的止血。

2.本發(fā)明的的制備過(guò)程沒(méi)有使用有毒有害的化學(xué)試劑，操作簡(jiǎn)便，耗能少，基本無(wú)廢水和廢渣的排放，有很好的實(shí)用價(jià)值。

3.本發(fā)明的絲素止血材料很好的保持了絲素自然形態(tài)(與天然蠶絲相近)，質(zhì)地均勻，以及優(yōu)異的力學(xué)性能、良好的吸水保水性能，還具有良好的生物安全性、無(wú)毒、無(wú)污染、可生物降解、抗菌等優(yōu)點(diǎn)。

4.本發(fā)明中，脫膠絲素在在氯化鈣溶液中會(huì)發(fā)生溶解現(xiàn)象，絲素的溶解是一個(gè)分階段的過(guò)程，絲素纖維在氯化鈣溶液中，纖維之間的弱結(jié)構(gòu)先被破壞，絲素纖維間的連接被破壞發(fā)生溶脹、分纖，正因?yàn)槔w維的溶脹，纖維的纖維內(nèi)部及纖維之間生成了微孔穴。利用蠶絲纖維的微溶解生成的微孔隙，在空隙中填充、固著功能性材料可以獲得多功能的新型蠶絲材料。利用CaCl₂溶液微溶絲素纖維，在絲素纖維上加入鈣離子的同時(shí)絲素纖維的空隙提高自身吸水能力從而得到有優(yōu)良止血能力的蠶絲絲素纖維止血材料。

5.本發(fā)明制備的材料相較于其他絲素蛋白止血材料的優(yōu)勢(shì)：

①本方法制備過(guò)程更加簡(jiǎn)便環(huán)保，無(wú)需將絲素纖維溶解成再生絲素蛋白。鈣離子本身為止血因子，相比于其他材料添加凝血酶等輔助材料更為可靠和有效。

②本方法制備的止血材料具有較好的吸水性能，因而有良好的止血性能。

③本方法制備的材料為絲素纖維，更容易加工成固定形狀規(guī)格的產(chǎn)品以適應(yīng)于實(shí)際的醫(yī)用止血需求，比如編織成絲素止血紗布等。

④本方法制備的材料具有良好的生物相容性和體內(nèi)降解性能，改良后可以用于體內(nèi)的止血需求，無(wú)需將材料取出。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明制得的絲素止血材料，右圖為左圖的局部放大圖。

圖2組織切片圖，從左到右依次為第1、2、3周的情況，能夠看出細(xì)胞長(zhǎng)入和降解情況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行詳細(xì)描述，下面的描述是為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1

一種蠶絲絲素纖維止血材料的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

(1)稱取蠶繭(25g)，去除蠶蛹后將繭殼剪成1平方厘米大小的碎片，取繭片裝入圓筒狀濾紙中，接好冷凝管、抽提管和平底燒瓶，保證密閉性后，將濾紙包好的蠶繭放入提取管中，從上端加入乙醚，并設(shè)置溫度為60℃，虹吸抽提2小時(shí)，抽提完成后取出繭片，自然風(fēng)干；

(2)加入沸騰的0.5％Na₂CO₃溶液中(浴比為1∶50)煮沸30分鐘。撈出蠶繭并用去離子水反復(fù)搓洗直至無(wú)滑膩感。重復(fù)2次，再用苦味酸奶胭脂紅溶液檢測(cè)，直至絲膠完全脫去。在室溫條件下晾干獲得纖維狀絲素蛋白。

(3)脫膠所得絲素按1∶100的固液比分別放入預(yù)先準(zhǔn)備好的質(zhì)量濃度為10％CaCl₂溶液中常溫浸泡10min；而后將充分吸收10％CaCl₂溶液后的絲素放入-80℃冰箱，冷凍的時(shí)長(zhǎng)設(shè)置4H：冷凍完畢，絲素用冷凍干燥法干燥(-50℃，24h)得到絲素止血材料。

制得的絲素止血材料各項(xiàng)性能檢測(cè)：

1.吸水(止血)性能測(cè)試：

家兔耳靜脈止血模型建立及測(cè)試方法：

(1)家兔耳靜脈出血模型的建立

家兔耳部用剃毛器脫毛后酒精消毒。在無(wú)菌條件下用消毒手術(shù)刀在家兔耳緣末1/3處切開(kāi)一條1cm長(zhǎng)的創(chuàng)口，并且這一條創(chuàng)口要保證經(jīng)過(guò)耳緣靜脈。注意兔子的耳朵并不切透，防止血液從內(nèi)測(cè)流出。待血液充滿創(chuàng)面后，進(jìn)行后續(xù)凝血測(cè)試。

(2)材料在家兔耳靜脈出血模型中的止血能力

止血材料樣品剪成2cm×2cm小塊，稱重M₁后備用。6只供試家兔隨機(jī)分為醫(yī)用紗布對(duì)照組、10％組、20％組三組，每組兩只兔子四個(gè)耳緣靜脈出血實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

將準(zhǔn)備好的材料分別覆蓋好稱重過(guò)的醫(yī)用棉球M₂后，在出血模型上采用壓迫止血法。每隔十秒拿開(kāi)棉花，觀察各材料的止血效果。當(dāng)無(wú)更多血液從材料滲出是，記錄時(shí)間T₁，此后每隔五秒觀察一次，直至完全止血，記錄時(shí)間T₂，用T₁和T₂的平均值作為最終止血時(shí)間^[82]。隨后，精確稱量吸入血液棉球與吸入血液的材料總質(zhì)量M₃.出血量用M表示，則：

M＝M₃-M₁-M₂

測(cè)得本材料在該家兔耳靜脈止血模型的止血時(shí)間為54.67秒，傷口出血量為0.044克。

2.本發(fā)明的絲素止血材料很好的保持了絲素自然形態(tài)，質(zhì)地均勻，如圖1所示，右圖是左圖的局部放大圖。

本發(fā)明的絲素止血材料具備優(yōu)異的力學(xué)性能，約為天然蠶絲力學(xué)性能的70-80％，為2.1-2.4cN/dtex。

3.本材料容易加工成固定形狀規(guī)格的產(chǎn)品以適應(yīng)于實(shí)際的醫(yī)用止血需求，如編織成絲素止血紗布用于手術(shù)止血或者做成止血繃帶等。

4.本材料具有良好的生物相容性和體內(nèi)降解性能，用于體內(nèi)的止血需求。

(1)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將HEK293細(xì)胞(Human Embryonic Kidney 293cells)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化吹打均勻成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔加入200微升，使每孔底細(xì)胞密度為5000-10000個(gè)/孔為：陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組，每組各設(shè)置12孔。置于5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24H后，棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液。加入受試物：DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)、5g/L浸提溶液續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72H后加入20μL、5g/L的MTT溶液，4H后重新加入200μL的DMSO溶液，震蕩10min，測(cè)量細(xì)胞懸液OD(490nm)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率：

RGR＝a/b×100％，

式中，RGR為相對(duì)增值率％，a為試驗(yàn)組(陽(yáng)性對(duì)照組)吸光度，b為陰性對(duì)照組吸光度。

細(xì)胞相對(duì)增值率(RGR)計(jì)算及細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用5分制法進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(jí)：0級(jí)：RGR≥100％，I級(jí)：RGR在75％-99％，II級(jí)：RGR在50％-74％，III級(jí)：RGR在25％-49％，Ⅳ級(jí)RGR在1％-24％，V級(jí)RGR＜1％。0級(jí)和I級(jí)被認(rèn)為沒(méi)有細(xì)胞毒性，II級(jí)為輕度細(xì)胞毒性，III級(jí)和Ⅳ級(jí)為中度細(xì)胞毒性，V級(jí)為明顯細(xì)胞毒性。

測(cè)試結(jié)果顯示：本材料細(xì)胞毒性為0-1級(jí)。

(2)皮下埋植實(shí)驗(yàn)

所有實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)動(dòng)物保護(hù)條例以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行。

①試驗(yàn)前材料處理

實(shí)驗(yàn)所需的燒杯、小玻璃瓶、PBS溶液、蒸餾水先放入高溫滅菌鍋里滅菌20min，滅菌后放入無(wú)菌工作臺(tái)備用。

絲素止血材料8毫克3份，做好標(biāo)記。絲素材料擠壓至不可反彈的球狀，用直尺量好尺寸，拍照作記錄。把每個(gè)材料先用蒸餾水清洗干凈，用75％的酒精浸泡15s后用PBS清洗干凈，處理過(guò)后放入小玻璃瓶里，蓋上蓋子，做好標(biāo)記(整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌工作臺(tái)中進(jìn)行)。

②手術(shù)步驟

試驗(yàn)鼠腹腔注射乙醚麻醉后，剔除背部部分鼠毛，暴露皮膚。75％的酒精消毒后，于每只大鼠背部各選取一合適位置切開(kāi)皮膚(約0.5cm)，鈍器解剖法沿切口部位向里制備適宜大小的皮下囊，將每個(gè)囊埋植試驗(yàn)樣品后，針線縫合。最后將試驗(yàn)鼠放于貼附標(biāo)簽的籠子里分別飼養(yǎng)。

③術(shù)后觀察

A.取材及大體觀察

術(shù)后每天對(duì)動(dòng)物手術(shù)切口、周?chē)螒B(tài)及術(shù)后反應(yīng)進(jìn)行觀察。并于1周、2、3周三個(gè)個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)鼠頸椎脫臼法處死，切下包有材料的皮下組織。取材時(shí)觀察創(chuàng)面愈合狀況、有無(wú)明顯的炎癥反應(yīng)等。

B.石蠟切片的制備

取材：小鼠處死后切下已經(jīng)被結(jié)締組織包裹的材料。

固定：固定液浸漬下的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細(xì)胞和組織中的物質(zhì)成分、終止細(xì)胞的一切代謝過(guò)程、防止細(xì)胞自溶或組織變化，盡可能保持材料活體時(shí)的結(jié)構(gòu)。固定能使組織硬化，有利于切片的進(jìn)行，而且也有媒浸作用，有利于組織著色。本實(shí)驗(yàn)使用波恩(Bouin)固定液，固定時(shí)間為24小時(shí)。

脫水：按50％、70％、80％、95％、100％、100％酒精的順序，每組10分鐘梯度脫水。

透明：按1/2二甲苯、純二甲苯、純二甲苯各十分鐘的順序?qū)γ撍牧线M(jìn)行透明。

浸蠟包埋：將透明后材料放入預(yù)先加熱到60℃的石蠟包埋機(jī)中，包埋時(shí)間為一小時(shí)，然后更換純蠟再包埋一小時(shí)。最后將浸蠟完成的材料放入特制的小盒中，補(bǔ)足石蠟，在冷卻臺(tái)上冷卻24H。

切片：將已經(jīng)固定和修整好的蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)，裝好刀片，設(shè)定切片厚度為4um，調(diào)整好刀口與石蠟塊的距離即可開(kāi)始切片。當(dāng)蠟帶長(zhǎng)到20cm左右時(shí)用毛筆輕輕挑起，用刀片切取較好條段于載玻片(涂抹均勻甘油后滴加蒸餾水以利于蠟段展開(kāi))備用。放置蠟帶時(shí)，注意蠟帶的光滑面朝下，皺面朝上。

烘片：切片置于烘片臺(tái)烘干水分，后置于38℃烘箱過(guò)夜烘干。

C.HE染色

染色前處理：用二甲苯脫蠟5-10min，換新鮮二甲苯，再處理5-10min。然后分別依次置于無(wú)水乙醇、90％乙醇、70％乙醇和蒸餾水中5min，2min，2min，2min。

蘇木精染色：染色5-10min后，浸入流動(dòng)的自來(lái)水中約10min，除去多余的蘇木精染色液，蒸餾水洗滌一次，95％乙醇處理5s。

伊紅染色：染色1min后，70％乙醇清洗2次。

脫水、透明及封片：先后用不同瓶裝的95％乙醇各脫水2min后，再用不同瓶裝的二甲苯透明兩次，每次5min，最后用中性樹(shù)膠封片。

D.組織切片觀察

通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)不同材料有無(wú)細(xì)胞長(zhǎng)入、材料降解情況等進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)植入部位沒(méi)有炎癥反應(yīng)，絲素纖維在小鼠體內(nèi)發(fā)生降解，見(jiàn)圖2，從左到右依次為第1、2、3周的情況，能夠看出細(xì)胞長(zhǎng)入和降解情況。

實(shí)施例2

一種蠶絲絲素纖維止血材料的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

(1)稱取一定量的蠶繭(20g)，去除蠶蛹后將繭殼剪成1平方厘米大小的碎片，取繭片裝入圓筒狀濾紙中，接好冷凝管、抽提管和平底燒瓶，保證密閉性后，將濾紙包好的蠶繭放入提取管中，從上端加入乙醚，并設(shè)置溫度為60℃，虹吸抽提2小時(shí)，抽提完成后取出繭片，自然風(fēng)干。

(2)加入沸騰的0.5％Na₂CO₃溶液中(浴比為1∶50)煮沸30分鐘。撈出蠶繭并用去離子水反復(fù)搓洗直至無(wú)滑膩感。重復(fù)2次，再用苦味酸奶胭脂紅溶液檢測(cè)，直至絲膠完全脫去。在室溫條件下晾干獲得纖維狀絲素蛋白。

(3)脫膠所得絲素按1∶100的固液比分別放入預(yù)先準(zhǔn)備好的質(zhì)量濃度為20％CaCl₂溶液中常溫浸泡10min；而后將充分吸收20％CaCl₂溶液后的絲素放入-80℃冰箱，冷凍的時(shí)長(zhǎng)設(shè)置2H；冷凍完畢，絲素用冷凍干燥法干燥(-50℃，36h)得到絲素止血材料。

制得的絲素止血材料各項(xiàng)性能檢測(cè)：

1.吸水(止血)性能測(cè)試：測(cè)得材料在家兔耳靜脈止血模型的止血時(shí)間為63.75秒，傷口出血量為0.098克。

2.本發(fā)明的絲素止血材料很好的保持了絲素自然形態(tài)，質(zhì)地均勻，以及優(yōu)異的力學(xué)性能，為1.9-2.2cN/dtex。

3.本材料容易加工成固定形狀規(guī)格的產(chǎn)品以適應(yīng)于實(shí)際的醫(yī)用止血需求，如編織成絲素止血紗布用于手術(shù)止血或者做成止血繃帶等。

4.本材料具有良好的生物相容性和體內(nèi)降解性能，用于體內(nèi)的止血需求(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞毒性為1級(jí)，皮下埋植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絲素纖維在小鼠體內(nèi)發(fā)生降解)。

實(shí)施例3

一種蠶絲絲素纖維止血材料的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

(1)稱取蠶繭(30g)，去除蠶蛹后將繭殼剪成1平方厘米大小的碎片，取繭片裝入圓筒狀濾紙中，接好冷凝管、抽提管和平底燒瓶，保證密閉性后，將濾紙包好的蠶繭放入提取管中，從上端加入乙醚，并設(shè)置溫度為60℃，虹吸抽提2小時(shí)，抽提完成后取出繭片，自然風(fēng)干；

(2)加入沸騰的0.5％Na₂CO₃溶液中(浴比為1∶50)煮沸30分鐘。撈出蠶繭并用去離子水反復(fù)搓洗直至無(wú)滑膩感。重復(fù)2次，再用苦味酸奶胭脂紅溶液檢測(cè)，直至絲膠完全脫去。在室溫條件下晾干獲得纖維狀絲素蛋白。

(3)脫膠所得絲素按1∶100的固液比分別放入預(yù)先準(zhǔn)備好的質(zhì)量濃度為40％CaCl₂溶液中常溫浸泡10min；而后將充分吸收40％CaCl₂溶液后的絲素放入-80℃冰箱，冷凍的時(shí)長(zhǎng)設(shè)置12H；冷凍完畢，絲素用冷凍干燥法干燥(-50℃，45h)得到絲素止血材料。

制得的絲素止血材料各項(xiàng)性能檢測(cè)：

1.吸水(止血)性能測(cè)試：測(cè)得材料在家兔耳靜脈止血模型的止血時(shí)間為80.64秒，傷口出血量為0.153克，相對(duì)于專(zhuān)利申請(qǐng)201310248965.8是否能體現(xiàn)本材料吸水性能的優(yōu)勢(shì)？可以給出更多體現(xiàn)本材料吸水保水優(yōu)勢(shì)的指標(biāo)和參數(shù)。

2.本發(fā)明的絲素止血材料很好的保持了絲素自然形態(tài)，質(zhì)地均勻，以及優(yōu)異的力學(xué)性能，為1.7-1.9cN/dtex。

3.本材料容易加工成固定形狀規(guī)格的產(chǎn)品以適應(yīng)于實(shí)際的醫(yī)用止血需求，如編織成絲素止血紗布用于手術(shù)止血或者做成止血繃帶等。

4.本材料具有良好的生物相容性和體內(nèi)降解性能，用于體內(nèi)的止血需求(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞毒性為1級(jí)，皮下埋植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絲素纖維在小鼠體內(nèi)發(fā)生降解)。