本發(fā)明屬于化合物的制備及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于BODIPY染料的次氯酸跟熒光探針的合成及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

次氯酸（HOCl）是一種生物體內(nèi)的重要的活性氧（ROS），一般認(rèn)為，內(nèi)

源性的次氯酸是由H₂O₂和Cl^-在過氧化物酶催化下發(fā)生過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生，尤其在白細(xì)胞內(nèi)。次氯酸能破壞入侵的細(xì)菌和病原體，因此對(duì)人類免疫系統(tǒng)意義重大然而，過量的次氯酸也會(huì)破壞DNA和蛋白質(zhì)分子，最終導(dǎo)致一些疾病，如心血管疾病，動(dòng)脈粥樣硬化，腎病，骨關(guān)節(jié)炎和癌癥等。此外，HOCl及其共軛堿ClO^-是生活中常見的飲用水、游泳池消毒劑和漂白劑。正因?yàn)檫^量的次氯酸容易導(dǎo)致疾病并會(huì)對(duì)人們產(chǎn)生威脅，所以控制日常生活中水體里ClO^-濃度尤為重要，對(duì)次酸根的高選擇性和高靈敏度的實(shí)時(shí)檢測(cè)也因此非常有意義，引起了廣泛關(guān)注。

近些年，已報(bào)導(dǎo)了一些檢測(cè)ClO^-的熒光探針，其中大部分是利用ClO^-的強(qiáng)氧化性原理。一些功能團(tuán)如酰亞硝基，對(duì)甲氧基苯酚，硫醇，肟，異羥肟酸等可以很容易地被次氯酸根氧化，所以常用作熒光探針的識(shí)別基團(tuán)。但與此同時(shí)，這些探針的一些缺點(diǎn)也暴露出來，比如具有一定的細(xì)胞毒性，緩慢的反應(yīng)過程，較差的選擇性，較低的熒光量子產(chǎn)率，易受其他離子干擾等等，這些缺點(diǎn)也大大限制了這些探針在生物體內(nèi)的應(yīng)用。因此，急需設(shè)計(jì)一種能夠克服這些缺點(diǎn)的新型熒光探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型的基于C=N異構(gòu)化的新型BODIPY熒光探針及其制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是將該新型熒光探針用于實(shí)際水樣品中次氯酸根離子的有效識(shí)別和定量檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明目的之一技術(shù)方法是研究合成出一種BODIPY衍生物作為熒光探針，其分子式為C24H21BF2N6，結(jié)構(gòu)式如下：

上述熒光探針的制備方法如下：

（1）中間體化合物2的合成。

向250 mL圓底燒瓶中加入一定量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，在冰水浴下再加入三氯氧磷，攪拌 10min，撤掉冰浴，恢復(fù)到室溫?cái)嚢?30 min。然后，稱取316 mg（1 mmol）化合物1溶解在二氯乙烷（ClCH₂CH₂Cl）中，并注入燒瓶中，在一定溫度下繼續(xù)反應(yīng)。然后冷卻到室溫，慢慢倒入冰水浴下的飽和 NaHCO₃中，加入適量NaHCO₃直至溶液為弱堿性，繼續(xù)在室溫下攪拌 1 h。待反應(yīng)完成后，用二氯甲烷（3×50 mL）萃取，合并有機(jī)相，減壓旋干溶劑。得到的粗產(chǎn)物通過柱層析提純（洗脫液：石油醚/二氯甲烷）。得橙紅色固體，即化合物2。

其中，所述N,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入量為6-15 mL （78-195 mmol）；

所述三氯氧磷加入量為6-15.0 mL（64-160 mmol）；

加入的二氯乙烷體積為40-80 mL；

在一定溫度下繼續(xù)反應(yīng)的反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為40-55 度，3 h-6 h；

洗脫液比例為：石油醚/二氯甲烷 = （5-20）:1；

所述化合物2合成過程中的中間產(chǎn)物化合物1的合成方法參照文獻(xiàn)（M. Emrullaho?lu, M. ü?üncü, E. Karaku?, A BODIPY aldoxime-based chemodosimeter for highly selective and rapid detection of hypochlorous acid, Chem. Commun. 49(71) (2013) 7836-7838.）。

（2）探針的合成

稱取一定量的二氨基馬來腈和化合物2，溶解在乙醇里，加入幾滴醋酸后在室溫下攪拌反應(yīng)一定時(shí)間。粗產(chǎn)物用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，再用柱層析提純（洗脫液：石油醚/二氯甲烷），最后得到純化后的產(chǎn)物。

其中，所述二氨基馬來腈和化合物2的加入量分別為0.6-1.2 mmol， 0.7 mmol；所述溶劑乙醇的量為10-30 mL；

所述催化劑醋酸加入量為2-20滴；

所述攪拌反應(yīng)時(shí)間為0.5-5 h；

所述柱層析洗脫液石油醚/二氯甲烷體積比為（1-5）：1。

本發(fā)明目的之二技術(shù)方法將上述合成的熒光探針用于自來水、長(zhǎng)江水和次氯酸鈉消毒液里次氯酸根離子的檢測(cè)。

（1）用EtOH配制1 mM的探針母液置于-4 ^oC冰箱中備用；在檢測(cè)前用0.01 M的PBS緩沖液（pH 7.4,含 20% EtOH, v/v）稀釋到終濃度為5 μM的溶液。10 mM次氯酸鈉和其他離子的的儲(chǔ)備液用蒸餾水配制成，這些離子包括F^-, Cl^-, NO₂^-, ClO₄^-, HCO₃^-, H₂PO₄^-, SO₄^2-, S₂O₃^2-, CO₃^2-, Fe³⁺, Cu²⁺, H₂O₂, ONOO^-, ROO?, ?OH, NO?。向探針溶液中加入不同濃度的次氯酸根離子，分別測(cè)量溶液的熒光光譜；

（2）向探針溶液中分別加入一定體積的離子儲(chǔ)備液，使各離子終濃度為100 μM，分別測(cè)量其熒光和紫外光譜；

（3）將PBS緩沖液替換為實(shí)際生活中的水樣：自來水、長(zhǎng)江水和次氯酸鈉消毒水，測(cè)量其熒光光譜。再分別向三種水樣中加入一定體積的的標(biāo)準(zhǔn)濃度的次氯酸根離子，使其終濃度分別為5 μM，10 μM和20 μM。分別測(cè)量熒光得到熒光強(qiáng)度值。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明中所設(shè)計(jì)合成的熒光探針中所含的C=N鍵，因C=N異構(gòu)化作用會(huì)使染料熒光猝滅。被次氯酸根氧化后，C=N鍵斷裂，生成新的C=O鍵，從而恢復(fù)BODIPY本身的綠色熒光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ClO^-的熒光增強(qiáng)型識(shí)別，效果明顯。

（2）本發(fā)明中熒光探針能對(duì)ClO^-快速識(shí)別，熒光強(qiáng)度會(huì)隨著次氯酸根的加入有迅速而明顯的增強(qiáng)，且在10 s內(nèi)能達(dá)到穩(wěn)定，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。

（3）本發(fā)明中熒光探針對(duì)次氯酸根有很強(qiáng)的選擇性，即使在其他離子包括一些活性氧離子存在下，也能對(duì)次氯酸根進(jìn)行有效識(shí)別。

（4）本發(fā)明中熒光探針對(duì)次氯酸根離子檢測(cè)的靈敏度很高，測(cè)量的檢出限低至19.8 nM，優(yōu)勢(shì)明顯。

（5）本發(fā)明中熒光探針能應(yīng)用于實(shí)際生活中的水，如對(duì)自來水、長(zhǎng)江水和次氯酸鈉消毒水中的次氯酸根進(jìn)行有效的識(shí)別和檢測(cè)，不但能測(cè)量出三種水樣品中次氯酸鈉的濃度。還通過加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了測(cè)量方法的可靠性，加標(biāo)回收率在96.1%–103.6%之間，證明了該探針的確可應(yīng)用于環(huán)境水樣的檢測(cè)。

附圖說明

圖1為化合物1的¹H NMR圖；

圖2為化合物2的¹H NMR圖；

圖3為探針的¹H NMR圖；

圖4.為探針的¹³C NMR圖；

圖5為探針的質(zhì)譜圖；

圖6為探針溶液加入次氯酸根后的熒光光譜圖；

圖7為探針溶液的熒光強(qiáng)度隨加入的次氯酸根濃度變化圖；

圖8為探針溶液加入次氯酸根后的紫外光譜圖；

圖9為探針溶液加入次氯酸根后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線；

圖10為探針溶液加入不同離子后的熒光、紫外光譜圖；圖中1：空白, 2 ：F^-, 3： Cl^-, 4 ：NO₂^-, 5： ClO₄^-, 6： HCO₃^-, 7 ：H₂PO₄^-, 8： SO₄^2-, 9： S₂O₃^2-, 10： CO₃^2-, 11： Fe³⁺, 12： Cu²⁺, 13： ClO^-, 14： H₂O₂, 15 ：ONOO^-, 16： ROO?, 17： ?OH, 18： NO?.；

圖11 探針用于測(cè)量自來水、長(zhǎng)江水和稀釋后的次氯酸鈉水溶液熒光光譜圖。

具體實(shí)施方式：

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖說明對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例，基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：中間體化合物1的合成

如上述過程所示，向250 mL圓底燒瓶中加入80 mL干燥的二氯甲烷和0.58 mL苯甲酰氯，通氮?dú)膺M(jìn)行保護(hù)，慢慢滴加2,4-二甲基吡咯1.1 mL，滴加5滴三氟乙酸（TFA），加完后混合溶液在室溫下避光攪拌10 h。然后向反應(yīng)中加入1.08 g 2,3-二氯-5,6-二氰對(duì)苯醌（DDQ），繼續(xù)室溫下避光攪拌1 h。之后在冰浴件下，向反應(yīng)中逐滴滴加10 mL三乙胺，攪拌15 min后，再逐滴加入10 mL 三氟化硼乙醚（BF₃·Et₂O），撤冰浴，繼續(xù)在室溫下反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成后，用100 mL飽和NaHCO₃溶液淬滅反應(yīng)，蒸餾水（3×50 mL）洗滌后再用二氯甲烷（3×50 mL）萃取，合并有機(jī)相，加入無水MgSO₄干燥，減壓旋干溶劑。得到的粗產(chǎn)物通過柱層析提純（洗脫液：石油醚/二氯甲烷 = 15:1），得到橙紅色固體，即化合物1共515 mg，產(chǎn)率為33%。核磁氫譜圖如圖1：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.50 – 7.48 (m, 3H), 7.30 – 7.28 (m, 2H), 5.99 (s, 2H), 2.57 (s, 6H), 1.38 (s, 6H).

實(shí)施例2：基于BODIPY染料的熒光探針的合成

（1）化合物2的合成。

向250 mL圓底燒瓶中加入6 mL （78 mmol）的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，在冰水浴下再加入15.0 mL（160 mmol）三氯氧磷，攪拌 10min，撤掉冰浴，恢復(fù)到室溫?cái)嚢?30 min。然后，稱取316 mg（1 mmol）實(shí)施例1中合成的化合物1溶解在40 mL二氯乙烷（ClCH₂CH₂Cl）中，并注入燒瓶中，在40度下繼續(xù)反應(yīng)3 h。然后冷卻到室溫，慢慢倒入冰水浴下的飽和 NaHCO₃中，加入適量NaHCO₃直至溶液為弱堿性，繼續(xù)在室溫下攪拌 1 h。待反應(yīng)完成后，用二氯甲烷（3×50 mL）萃取，合并有機(jī)相，減壓旋干溶劑。得到的粗產(chǎn)物通過柱層析提純（洗脫液：石油醚/二氯甲烷= 5:1）。得橙紅色固體，即化合物251 mg，產(chǎn)率為73.2%。

（2）探針的合成

稱取65 mg （0.6 mmol）二氨基馬來腈和247 mg（0.7 mmol）實(shí)施例1中所得到的化合物2，溶解在10 mL乙醇里，加入2滴醋酸后在室溫下攪拌0.5 h。粗產(chǎn)物用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，再用柱層析提純（洗脫液：石油醚/二氯甲烷= 5：1），該化合條件下，幾乎得到很少的產(chǎn)物，且該洗脫液下難以將純凈的產(chǎn)物分離出。

實(shí)施例3：基于BODIPY染料的熒光探針的合成

（1）化合物2的合成。

向250 mL圓底燒瓶中加入15 mL （195 mmol）的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，在冰水浴下再加入6.0 mL（64 mmol）三氯氧磷，攪拌 10min，撤掉冰浴，恢復(fù)到室溫?cái)嚢?30 min。然后，稱取316 mg（1 mmol）實(shí)施例1中合成的化合物1溶解在60 mL二氯乙烷（ClCH₂CH₂Cl）中，并注入燒瓶中，在55度下繼續(xù)反應(yīng)6 h。然后冷卻到室溫，慢慢倒入冰水浴下的飽和 NaHCO₃中，加入適量NaHCO₃直至溶液為弱堿性，繼續(xù)在室溫下攪拌 1 h。待反應(yīng)完成后，用二氯甲烷（3×50 mL）萃取，合并有機(jī)相，減壓旋干溶劑。得到的粗產(chǎn)物通過柱層析提純（洗脫液：石油醚/二氯甲烷= 20:1）。得橙紅色固體，即化合物263 mg，產(chǎn)率為76.7%。

（2）探針的合成

稱取129.3 mg （1.2 mmol）二氨基馬來腈和247 mg（0.7 mmol）實(shí)施例1中所得到的化合物2，溶解在30 mL乙醇里，加入5滴醋酸后在室溫下攪拌5 h。粗產(chǎn)物用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，再用柱層析提純（洗脫液：石油醚/二氯甲烷= 1：1），最后得到純化后的產(chǎn)物215.6 mg，產(chǎn)率為70.8%。

實(shí)施例4：基于BODIPY染料的熒光探針的合成

（1）化合物2的合成。

向250 mL圓底燒瓶中加入12.0 mL（156 mmol）N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，在冰水浴下再加入12.0 mL（128.0 mmol）三氯氧磷，攪拌 10min，撤掉冰浴，恢復(fù)到室溫?cái)嚢?30 min。然后，稱取316 mg（1 mmol）實(shí)施例1中合成的化合物1溶解在 80 mL 的 （二氯乙烷）ClCH₂CH₂Cl 中，并注入燒瓶中，在50 度下繼續(xù)反應(yīng) 4h。然后冷卻到室溫，慢慢倒入冰水浴下的飽和 NaHCO₃中，加入適量NaHCO₃直至溶液為弱堿性，繼續(xù)在室溫下攪拌 1 h。待反應(yīng)完成后，用二氯甲烷（3×50 mL）萃取，合并有機(jī)相，減壓旋干溶劑。得到的粗產(chǎn)物通過柱層析提純（洗脫液：石油醚/二氯甲烷 = 10:1）。得橙紅色固體，即化合物2共286 mg，產(chǎn)率為83.3 %。核磁氫譜圖圖2；

（2）稱取97 mg （0.9 mmol）二氨基馬來腈和247 mg（0.7 mmol）實(shí)施例1中所得到的化合物2，溶解在20 mL乙醇里，加入5滴醋酸后在室溫下攪拌2 h。粗產(chǎn)物用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，再用柱層析提純（洗脫液：石油醚/二氯甲烷= 2：1），最后得到純化后的產(chǎn)物250 mg，產(chǎn)率為82.1%。其核磁圖和質(zhì)譜圖如下：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.43 (s, 1H), 7.57 – 7.54 (m, 3H), 7.32 -7.31 (m, 2H), 6.12 (s, 1H), 4.84 (s, 2H), 2.84 (s, 3H), 2.64 (s, 3H), 1.61 (s, 3H), 1.44 (s, 3H). ¹³C NMR (101 MHz, DMF) δ: 159.82, 155.84, 150.64, 146.31, 143.42, 141.38, 134.52, 133.23, 130.46, 129.82, 129.74, 128.43, 125.50, 125.06, 123.71, 114.98, 113.74, 106.08, 14.45, 14.34, 13.92, 12.19. MS: 443.62 [M+H] ⁺.

化合物2的¹H NMR圖如圖2；探針的¹H NMR圖如圖3；探針的¹³C NMR圖如圖4；探針的質(zhì)譜圖如圖5。

實(shí)施例5：探針加入次氯酸根離子后光譜性質(zhì)研究

（1）用EtOH配制1 mM的實(shí)施例4中合成的探針母液置于-4 ^oC冰箱中備用；在檢測(cè)前用緩沖液稀釋到終濃度為5 μM的溶液。10 mM次氯酸根的儲(chǔ)備液用蒸餾水配制成。

（2）向探針溶液中加入不同濃度的次氯酸根離子，使其終濃度為0-100 μM，分別測(cè)量溶液的熒光光譜。如圖6所示ClO^-的加入使得體系熒光強(qiáng)度在506 nm發(fā)射波長(zhǎng)處有一個(gè)明顯的峰值，且隨著離子濃度的增加，峰值也像預(yù)想的一樣越來越大，說明ClO^-濃度確實(shí)會(huì)影響探針溶液的熒光強(qiáng)度。當(dāng)ClO^-濃度達(dá)到探針1濃度的10倍時(shí)，熒光強(qiáng)度幾乎達(dá)到最大值不再增強(qiáng)。如圖7所示，次氯酸根濃度在0-40 μM范圍內(nèi)，體系在506 nm發(fā)射波長(zhǎng)處熒光呈線性增強(qiáng)，因此可由此熒光強(qiáng)度和次氯酸鈉濃度的線性為：熒光強(qiáng)度 = 20.91 [ClO^-] + 52.52, 線性系數(shù)R² = 0.9979，對(duì)次氯酸根的檢出限為19.8 nM。

（3）測(cè)量溶液的紫外光譜。圖8是紫外吸收光譜圖，發(fā)現(xiàn)探針在532 nm處有一個(gè)最強(qiáng)吸收峰。隨著次氯酸根濃度的增加，532 nm處的吸收峰值逐漸減弱直至消失，而同時(shí)也伴隨著波長(zhǎng)494 nm處的吸收迅速增強(qiáng)。這一藍(lán)移現(xiàn)象也引起了了溶液顏色從粉色到橙色的變化，同時(shí)也說明了探針與次氯酸鈉反應(yīng)產(chǎn)生了一種新的物質(zhì)。

（4）向探針溶液中加入不同濃度的次氯酸根離子，使次氯酸根終濃度分別為0、 15 μM，25 μM，50 μM，75 μM，100 μM，分別在加入后的0、10s、30s、50 s、70 s、90 s、120 s、150 s、180s、300 s、420 s、600 s時(shí)間測(cè)量并記錄熒光強(qiáng)度值。結(jié)果如圖9所示，可發(fā)現(xiàn)，探針溶液在加入次氯酸根后熒光強(qiáng)度急速增強(qiáng)，并在10 s內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定的最大值。因此，探針對(duì)次氯酸根有極快的響應(yīng)。

實(shí)施例6：探針對(duì)次氯酸根的選擇性研究

用EtOH配制1 mM的實(shí)施例4中合成的探針母液置于-4 ^oC冰箱中備用。濃度為10 mM其他離子的儲(chǔ)備液，包括F^-, Cl^-, NO₂^-, ClO₄^-, HCO₃^-, H₂PO₄^-, SO₄^2-, S₂O₃^2-, CO₃^2-, Fe³⁺, Cu²⁺, H₂O₂, ONOO^-, ROO?, ?OH, NO? , ClO^-離子和空白樣都用蒸餾水配制成。用0.01 M的PBS緩沖液（pH 7.4,含 20% EtOH, v/v）稀釋到終濃度為5 μM的溶液，并分別加入一定體積的離子儲(chǔ)備液，使各離子終濃度為100 μM，分別測(cè)量其熒光和紫外光譜，結(jié)果如圖10所示。由圖10a可得，加入次氯酸根后（13號(hào)），溶液的熒光明顯增強(qiáng)，發(fā)出綠色熒光；而其他離子則幾乎和空白樣一樣，幾乎無熒光。圖10b可知，次氯酸根的加入使得溶液在532 nm有明顯的吸收峰，而其他離子的加入幾乎和空白樣一樣，只在494 nm有一個(gè)吸收峰，且插圖中加入次氯醋根的溶液（13號(hào)）為橙色，而其他離子則為紫紅色。這些結(jié)果顯示，探針對(duì)次氯酸根有很好的選擇性，能在眾多常見離子和一些常見活性氧基團(tuán)中有效的識(shí)別出次氯酸根。

實(shí)施例7：探針在環(huán)境水樣中次氯酸根的檢測(cè)

（1）從長(zhǎng)江邊搜集長(zhǎng)江水，用濾紙過濾掉雜質(zhì)；從市場(chǎng)上買回次氯酸鈉消毒水，用蒸餾水稀釋 10000倍備用；從實(shí)驗(yàn)室搜集自來水直接使用。

（2）分別用三種水樣品與乙醇配置成體積比為4:1的混合溶液。用蒸餾水配制濃度為10 mM次氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液。用EtOH配制1 mM的實(shí)施例4中合成的探針母液置于-4 ^oC冰箱中備用。分別用三種混合溶液稀釋探針溶液到終濃度為5 μM，分別測(cè)量熒光光譜得到熒光強(qiáng)度值，如圖11所示。并根據(jù)實(shí)施例5中熒光強(qiáng)度和次氯酸鈉濃度的線性關(guān)系得到自來水、長(zhǎng)江水和次氯酸鈉消毒水里ClO^-濃度分別為2.34 μM, 0.06 μM和 119.4 mmol。

（3）再分別向三種水樣中加入一定體積的的標(biāo)準(zhǔn)濃度的次氯酸根離子，使其終濃度分別為5 μM，10 μM和20 μM。分別測(cè)量熒光得到熒光強(qiáng)度值。同樣通過熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到了加標(biāo)后樣品溶液中的ClO^-濃度，將該值與加入的標(biāo)準(zhǔn)值對(duì)比得到加標(biāo)離子的回收率。自來水中三種加標(biāo)濃度的次氯酸鈉回收率為103.6%，98.1%和101.5%；長(zhǎng)江水中三種加標(biāo)濃度的次氯酸鈉回收率為99.8%，96.1%和101.2%；稀釋后的次氯酸鈉消毒水中三種加標(biāo)濃度的次氯酸鈉回收率為99.2%，102.9%和99.15%。通過回收率可得該測(cè)量方法所得到的結(jié)果準(zhǔn)確率較高，該探針可用于實(shí)際水樣品中次氯酸鈉的識(shí)別和濃度檢測(cè)。