本申請(qǐng)是2011年5月10日遞交的pct國際申請(qǐng)pct/us2011/035908于2013年1月10日進(jìn)入中國國家階段的中國專利申請(qǐng)?zhí)枮?01180034249.9、發(fā)明名稱為“用于在植物中表達(dá)基因產(chǎn)物的組合物、生物體、體系和方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)：本申請(qǐng)要求2010年5月10日遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/395,197和2010年8月5日遞交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/400,976的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)全部內(nèi)容通過該引用被整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及使用在單子葉植物，雙子葉植物，或單子葉植物和雙子葉植物二者中可操作的啟動(dòng)子在植物中表達(dá)基因產(chǎn)物的組合物、生物體、體系和方法。
背景技術(shù)：
：：生物技術(shù)有望變革從農(nóng)業(yè)到現(xiàn)代醫(yī)藥的一切事物。舉例來說，遺傳工程改造(geneticallyengineering)植物的方法被探索，以通過更大的干旱抵抗力和昆蟲抵抗力，以及提高的產(chǎn)量來提高生產(chǎn)力。此外，作為用于人用藥和獸用藥(veterinarymedicine)的蛋白質(zhì)(例如抗體)和其他化合物的生產(chǎn)的潛在的生物工廠(biofactory)，植物正在被仔細(xì)檢測。然而，對(duì)于驅(qū)動(dòng)植物中被關(guān)注的基因產(chǎn)物的表達(dá)，存在數(shù)量有限的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子的一些僅在一些植物中對(duì)于驅(qū)動(dòng)表達(dá)有效。其他的啟動(dòng)子在一些組織和/或細(xì)胞中對(duì)驅(qū)動(dòng)表達(dá)有效，但對(duì)于其他組織和/或細(xì)胞則無效。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：相應(yīng)地，對(duì)于在植物中可操作的啟動(dòng)子的需求已經(jīng)出現(xiàn)，所述在植物中可操作的啟動(dòng)子包括在單子葉植物，雙子葉植物或單子葉植物和雙子葉植物二者中可操作的啟動(dòng)子和/或在多種組織和/或細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及使用在單子葉植物，雙子葉植物，或單子葉植物和雙子葉植物二者中可操作的啟動(dòng)子在植物中表達(dá)基因產(chǎn)物的組合物、生物體、體系和方法。舉例來說，組合物可以包括核酸(例如，分離的和/或純化的核酸)，所述核酸包括表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子)。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以包括與選自(a)seqidno：1的核苷酸1-1786，(b)seqidno：1的核苷酸1450-1786，(c)seqidno：1，(d)seqidno：17，(e)seqidno：18，(f)seqidno：26，(g)seqidno：27，(h)seqidno：32和/或(i)seqidno：33的序列至少約85％一致的核酸序列；其中所述表達(dá)控制序列在至少一種單子葉植物和至少一種雙子葉植物中具有啟動(dòng)子活性。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)控制序列可以在至少兩種單子葉植物和至少兩種雙子葉植物中具有啟動(dòng)子活性。在一些實(shí)施方案中，核酸可以包括表達(dá)控制序列(例如seqidno：1)和外源核酸，其中所述表達(dá)控制序列在至少一種單子葉植物和至少一種雙子葉植物中可操作來驅(qū)動(dòng)外源核酸的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)一些實(shí)施方案，根據(jù)權(quán)利要求3的分離的核酸，其中所述外源核酸包括轉(zhuǎn)基因。分離的核酸可以包括外源核酸，(a)當(dāng)被表達(dá)或被轉(zhuǎn)錄時(shí)，所述外源核酸改變所述植物細(xì)胞中的碳代謝和/或(b)在一些實(shí)施方案中，所述外源核酸編碼有效抵御至少一種莖鉆蛀昆蟲的殺蟲劑。根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開涉及表達(dá)載體。舉例來說，在5’至3’方向上，表達(dá)載體可以包括，甘蔗桿狀病毒(scbv)啟動(dòng)子(例如，(a)seqidno：1的核苷酸1-1786，(b)seqidno：1的核苷酸1450-1786，(c)seqidno：1，(d)seqidno：17，(e)seqidno：18，(f)seqidno：26，(g)seqidno：27，(h)seqidno：32，和/或(i)seqidno：33)；外源核酸(例如轉(zhuǎn)基因)；以及3’終止序列，其中所述scbv啟動(dòng)子在至少一種單子葉植物和至少一種雙子葉植物中具有足以表達(dá)所述外源核酸的啟動(dòng)子活性。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)載體可以位于細(xì)胞中(例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)載體可以包括-3至+4位置(例如，在seqidno：18的核苷酸1819-1825處)為aaaatgg的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體可以包括具有從約1至約200核苷酸的長度的接頭(例如，在所述表達(dá)控制序列和所述外源核酸之間)。在一些實(shí)施方案中，本公開還涉及包括表達(dá)載體的細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，所述表達(dá)載體包括表達(dá)控制序列(例如scbv啟動(dòng)子)。舉例來說，細(xì)胞可以包括表達(dá)載體，所述表達(dá)載體具有scbv啟動(dòng)子(例如，具有與seqidno：1至少約85％一致的核苷酸序列)；外源核酸；以及3’終止序列，其中所述scbv啟動(dòng)子在至少一種單子葉植物和至少一種雙子葉植物中具有足以表達(dá)所述外源核酸的啟動(dòng)子活性。在一些實(shí)施方案中，外源核酸可以包括轉(zhuǎn)基因。舉例來說，(a)當(dāng)被表達(dá)或被轉(zhuǎn)錄時(shí)，外源核酸可以改變所述植物細(xì)胞中的碳代謝和/或(b)外源核酸可以編碼有效抵御至少一種莖鉆蛀昆蟲的殺蟲劑。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是植物細(xì)胞(例如，位于植物中)。細(xì)胞可以包括選自單子葉植物細(xì)胞和雙子葉植物細(xì)胞的植物細(xì)胞(或植物)。單子葉植物可以選自甘蔗、芒草、芒草與甘蔗雜種、柳枝稷、燕麥、小麥、大麥、玉米、稻米、香蕉、絲蘭、洋蔥、蘆筍、高粱及其雜種。雙子葉植物可以選自咖啡、番茄、胡椒、煙草、利馬豆(limabean)、擬南芥、橡膠、橙、葡萄柚、馬鈴薯、南瓜(squash)、豌豆以及甜菜。在一些實(shí)施方案中，植物可以包括表達(dá)載體，所述表達(dá)載體具有啟動(dòng)子(例如，具有與seqidno：1至少約85％一致的核苷酸序列)，可操作地連接于所述啟動(dòng)子的外源核酸，以及3’終止序列，其中所述啟動(dòng)子在至少一種單子葉植物和至少一種雙子葉植物中具有足以表達(dá)所述外源核酸的啟動(dòng)子活性。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及在植物中組成型地表達(dá)外源核酸的方法。舉例來說，方法可以包括用植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(cytosol)接觸表達(dá)盒或表達(dá)載體，其中所述表達(dá)盒或表達(dá)載體包括(i)所述外源核酸，(ii)可操作來驅(qū)動(dòng)所述外源核酸的表達(dá)的表達(dá)控制序列(例如，具有與seqidno：1至少約85％一致的核苷酸序列的scbv啟動(dòng)子)，以及(iii)可操作地連接于所述外源核酸的3’終止序列，并且其中所述植物選自由單子葉植物和雙子葉植物組成的組。根據(jù)一些實(shí)施方案，接觸的步驟可以包括用包括所述表達(dá)盒的顆粒以生物彈射的方式轟擊(biolisticallybombard)所述細(xì)胞和/或?qū)⑺黾?xì)胞與包括所述表達(dá)盒的土壤桿菌屬(agrobacterium)細(xì)胞共培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及在植物中介導(dǎo)組成型表達(dá)核酸的方法。舉例來說，方法可以包括用表達(dá)核酸轉(zhuǎn)化植物(例如，植物、植物細(xì)胞、葉盤(leafdisc)、胚性愈傷組織(embryoniccallus))，所述表達(dá)核酸(例如，表達(dá)載體)包括表達(dá)控制序列(例如，具有與seqidno：1至少約85％一致的核苷酸序列的啟動(dòng)子)，外源核酸以及3’終止序列，其中所述植物選自由單子葉植物和雙子葉植物組成的組。根據(jù)一些實(shí)施方案，轉(zhuǎn)化的步驟可以包括用包括所述表達(dá)盒的顆粒以生物彈射的方式轟擊所述植物和/或?qū)⑺鲋参锱c包括所述表達(dá)盒的土壤桿菌屬細(xì)胞共培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，方法可以包括從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(例如，胚性愈傷組織)再生植物，以形成所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)后代(progeny)。根據(jù)一些實(shí)施方案，方法可以包括培養(yǎng)和/或培育轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的后代。根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開涉及包括表達(dá)控制序列的分離的核酸(例如分離的和/或純化的核酸)。舉例來說，表達(dá)控制序列可以包括seqidno：33的核苷酸632-716的序列；其中所述表達(dá)控制序列在至少一種單子葉植物和至少一種雙子葉植物中具有啟動(dòng)子活性。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以具有足夠的長度(例如，多于約0.3kb，多于約0.4kb，多于約0.5kb，多于約0.6kb，多于約0.7kb，和/或多于約0.8kb)，以使在至少一種單子葉植物和至少一種雙子葉植物中作為表達(dá)控制序列是可操作的。舉例來說，表達(dá)控制序列可以是至少約0.75kb。在一些實(shí)施方案中，核酸(例如，分離的和/或純化的核酸)可以包括表達(dá)控制序列，所述表達(dá)控制序列具有選自由seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33及其組合組成的組的序列；其中所述表達(dá)控制序列在至少一種單子葉植物和至少一種雙子葉植物中具有啟動(dòng)子活性。舉例來說，核酸可以包括(例如，在5’至3’方向上)表達(dá)控制序列，從約1至約75個(gè)核苷酸長度的接頭，以及起始密碼子，所述表達(dá)控制序列包括seqidno:30序列和seqidno:31序列，所述seqidno:30序列和seqidno:31序列由約630個(gè)核苷酸的間隔區(qū)(spacer)分隔，其中所述表達(dá)控制序列在至少一種單子葉植物和至少一種雙子葉植物中具有啟動(dòng)子活性。在一些實(shí)施方案中，接頭可以具有與seqidno：32的核苷酸778-805的序列至少約85％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，和/或至少約99％的一致性。根據(jù)一些實(shí)施方案，間隔區(qū)可以具有與seqidno：32的核苷酸96-726的序列至少約85％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，和/或至少約99％的一致性。表達(dá)控制序列可以在其5’端包括具有與seqidno:32的核苷酸1-44的序列至少約85％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，和/或至少約99％的一致性的序列。在一些實(shí)施方案中，本公開還涉及用于表達(dá)期望量的關(guān)注的基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))的表達(dá)體系。舉例來說，表達(dá)體系可以包括具有兩個(gè)或更多個(gè)表達(dá)控制序列的核酸、表達(dá)盒、細(xì)胞和/或植物，所述表達(dá)控制序列的每個(gè)可操作地連接于編碼關(guān)注的基因產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))的編碼序列(例如，轉(zhuǎn)基因)。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)體系可以包括具有兩個(gè)或更多個(gè)表達(dá)盒的植物，所述表達(dá)盒的每個(gè)包括表達(dá)控制序列(例如，啟動(dòng)子)，編碼關(guān)注的基因產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))的編碼序列，和/或一個(gè)或更多個(gè)終止子，其中每個(gè)表達(dá)控制序列(例如，啟動(dòng)子)與其他一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列不同，和/或編碼關(guān)注的基因產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))的所述編碼序列的每個(gè)拷貝與編碼序列的其他一個(gè)或多個(gè)拷貝基本上一致和/或一致。表達(dá)控制序列(例如，啟動(dòng)子)可以包括在植物中可操作的任意啟動(dòng)子，舉例來說，所述啟動(dòng)子包括玉米泛素1(ubiquitin1)啟動(dòng)子(具有或不具有熱激元件(heatshockelement，hse))，甘蔗富含脯氨酸的蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子，甘蔗延伸因子1α啟動(dòng)子，甘蔗茉莉酸酯誘導(dǎo)啟動(dòng)子，甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子，甘蔗o-轉(zhuǎn)甲基酶啟動(dòng)子，和/或其組合。表達(dá)體系可以包括具有2、3、4、5或更多個(gè)啟動(dòng)子的植物，所述啟動(dòng)子的每個(gè)獨(dú)立地選自由玉米泛素1啟動(dòng)子(具有或不具有熱激元件)，甘蔗富含脯氨酸的蛋白質(zhì)啟動(dòng)子，甘蔗延伸因子1α啟動(dòng)子，甘蔗茉莉酸酯誘導(dǎo)啟動(dòng)子，甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子，甘蔗o-轉(zhuǎn)甲基酶啟動(dòng)子，和/或其組合組成的組，并且所述啟動(dòng)子的每個(gè)可操作地連接于(例如，反式)編碼關(guān)注的基因產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))的編碼序列(例如，轉(zhuǎn)基因)，其中編碼關(guān)注的基因產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))的編碼序列的每個(gè)拷貝與其他一個(gè)或多個(gè)拷貝基本上一致和/或一致。在一些實(shí)施方案中，關(guān)注的編碼序列可以包括在本公開中引用的任意編碼序列。附圖說明本公開的一些實(shí)施方案可以通過部分地參考本公開和所附附圖而被理解，其中：圖1圖示說明用于根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的載體；圖2圖示說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的載體；圖3圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的gus表達(dá)，與在35s啟動(dòng)子的控制下的gus表達(dá)相比較；圖4圖示說明示出根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因植物葉中的gus活性的柱狀圖；圖5圖示說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的載體；圖6a圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的甘蔗幼葉中的gus表達(dá)；圖6b圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的甘蔗幼葉(卷(roll))中的gus表達(dá)；圖6c圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的甘蔗莖中的gus表達(dá)；圖6d圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的甜高粱(sweetsorghum)幼葉中的gus表達(dá)；圖6e圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的煙草葉中的gus表達(dá)；圖6f圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的利馬豆種子中的gus表達(dá)；圖6g圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的甘蔗幼葉中的gfp表達(dá)；圖6h圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的甘蔗幼葉(卷)中的gfp表達(dá)；圖6i圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的甘蔗莖中的gfp表達(dá)；圖6j圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的甜高粱幼葉中的gfp表達(dá)；圖6k圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的煙草葉中的gfp表達(dá)；以及圖6l圖示說明在根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的控制下的利馬豆種子中的gfp表達(dá)。圖7a圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的甘蔗莖桿(stalk)中的gus表達(dá)；圖7b圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的甘蔗葉中的gus表達(dá)；圖7c圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的甘蔗根中的gus表達(dá)；圖8a圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的甘蔗莖稈中的gus表達(dá)；圖8b圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的甘蔗莖稈中的gus表達(dá)；圖8c圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的甘蔗莖稈中的gus表達(dá)；圖8d圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的甘蔗莖稈中的gus表達(dá)；圖9a圖示說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的載體(seqidno：19)；圖9b圖示說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體b)的載體(seqidno：20)；圖9c圖示說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體c)的載體(seqidno：21)；圖9d圖示說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體d)的載體(seqidno：22)；圖9e圖示說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體e)的載體(seqidno：23)；圖9f圖示說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體f)的載體(seqidno：24)；圖10a圖示說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子；圖10b圖示說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體b)；圖10c圖示說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體c)；圖10d圖示說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體d)；圖10e圖示說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體e)；圖10f圖示說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體f)；圖11a圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的甘蔗葉中的eyfp表達(dá)；圖11b圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒(包括缺失b)轉(zhuǎn)化的甘蔗葉中的eyfp表達(dá)；圖11c圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒(包括缺失c)轉(zhuǎn)化的甘蔗葉中的eyfp表達(dá)；圖11d圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒(包括缺失d)轉(zhuǎn)化的甘蔗葉中的eyfp表達(dá)；圖11e圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒(包括缺失e)轉(zhuǎn)化的甘蔗葉中的eyfp表達(dá)；以及圖11f圖示說明用根據(jù)本公開的實(shí)施例的實(shí)施方案的表達(dá)盒(包括缺失f)轉(zhuǎn)化的甘蔗葉中的eyfp表達(dá)。序列表簡要說明本公開的一些實(shí)施方案可以通過部分地參考本公開和所附序列表而被理解，其中：seqidno：1說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子；seqidno：2說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子，gus編碼序列，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：3說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子，增強(qiáng)的yfp編碼序列，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：4說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括35s啟動(dòng)子，gus編碼序列，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：5說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括35s啟動(dòng)子，增強(qiáng)的yfp編碼序列，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：6說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括e35s啟動(dòng)子，增強(qiáng)的yfp編碼序列，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：7說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括玉米泛素啟動(dòng)子(無hse(熱激元件)的mubi1)，gus編碼序列，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：8說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括玉米泛素啟動(dòng)子(無hse的mubi1)，增強(qiáng)的yfp編碼序列，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：9說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括玉米泛素啟動(dòng)子，gus編碼序列，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：10說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括泛素啟動(dòng)子，增強(qiáng)的yfp編碼序列，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：11說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的p-2pcr引物；seqidno：12說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的p-w3fpcr引物；seqidno：13說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的p-w4fpcr引物；seqidno：14說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的p-w1rpcr引物；seqidno：15說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的scbv/prom/fpcr引物；seqidno：16說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的scbv/prom/rpcr引物；seqidno：17說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子；seqidno：18說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子；seqidno：19說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子的載體(野生型psk-scbv21-eyfp-nos)；seqidno：20說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體b)的載體；seqidno：21說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體c)的載體；seqidno：22說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體d)的載體；seqidno：23說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體e)的載體；seqidno：24說明具有根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的啟動(dòng)子(缺失突變體f)的載體；seqidno：25說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子(缺失b)；seqidno：26說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子(缺失c)；seqidno：27說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子(缺失d)；seqidno：28說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子(缺失e)；seqidno：29說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子(缺失f)；seqidno：30說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(tss1)；seqidno：31說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(tss2)；seqidno：32說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的具有tss1和tss2的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子；seqidno：33說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的具有tss2的甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子；seqidno：34說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的正向pcr引物f1；seqidno：35說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的正向pcr引物f2；seqidno：36說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的反向pcr引物r1；seqidno：37說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的反向pcr引物r2；seqidno：38說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子，牛溶菌酶編碼序列，35s終止子，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：39說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括玉米泛素啟動(dòng)子(不具有熱激元件)，牛溶菌酶編碼序列，以及35s終止子的表達(dá)盒；seqidno：40說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括玉米泛素啟動(dòng)子(不具有熱激元件)，牛溶菌酶編碼序列，高粱花葉病毒蛋白質(zhì)的3’非翻譯區(qū)，以及35s終止子的表達(dá)盒；seqidno：41說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括玉米泛素啟動(dòng)子(不具有熱激元件)，高粱花葉病毒蛋白質(zhì)的5’非翻譯區(qū)，牛溶菌酶編碼序列，高粱花葉病毒蛋白質(zhì)的3’非翻譯區(qū)，以及35s終止子的表達(dá)盒；seqidno：42說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括玉米泛素啟動(dòng)子(不具有熱激元件)，牛溶菌酶編碼序列，35s終止子，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：43說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括甘蔗富含脯氨酸的啟動(dòng)子(不具有5’utr(非翻譯區(qū)))，牛溶菌酶編碼序列，高粱花葉病毒蛋白質(zhì)的3’非翻譯區(qū)，以及35s終止子的表達(dá)盒；seqidno：44說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括甘蔗富含脯氨酸的啟動(dòng)子(不具有5’utr)，高粱花葉病毒蛋白質(zhì)的5’非翻譯區(qū)，牛溶菌酶編碼序列，高粱花葉病毒蛋白質(zhì)的3’非翻譯區(qū)，以及35s終止子的表達(dá)盒；seqidno：45說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括甘蔗富含脯氨酸的啟動(dòng)子(不具有5’utr)，牛溶菌酶編碼序列，35s終止子，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：46說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括甘蔗延伸因子1α啟動(dòng)子，牛溶菌酶編碼序列，高粱花葉病毒蛋白質(zhì)的3’非翻譯區(qū)，以及35s終止子的表達(dá)盒；seqidno：47說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括甘蔗延伸因子1α啟動(dòng)子，牛溶菌酶編碼序列，35s終止子，以及nos終止子的表達(dá)盒；seqidno：48說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括茉莉酸酯應(yīng)答的(responsive)啟動(dòng)子，牛溶菌酶編碼序列，以及35s終止子的表達(dá)盒；seqidno：49說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括茉莉酸酯應(yīng)答的啟動(dòng)子，牛溶菌酶編碼序列，高粱花葉病毒蛋白質(zhì)的3’非翻譯區(qū)，以及35s終止子的表達(dá)盒；以及seqidno：50說明根據(jù)本公開的具體實(shí)施例的實(shí)施方案的包括甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子，牛溶菌酶編碼序列，35s終止子，以及nos終止子的表達(dá)盒。具體實(shí)施方式在一些實(shí)施方案中，本公開涉及使用在單子葉植物，雙子葉植物，或單子葉植物和雙子葉植物二者中可操作的啟動(dòng)子在植物中表達(dá)基因產(chǎn)物的組合物、生物體、體系和方法。舉例來說，本公開涉及包括甘蔗桿狀病毒(scbv)啟動(dòng)子的表達(dá)控制序列(例如，啟動(dòng)子)、表達(dá)盒、表達(dá)載體、微生物和/或植物。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)控制序列可以(a)在選自根、葉、莖、花、種子、果實(shí)和/或塊莖(tuber)的器官中組成型地有活性或條件性地有活性，和/或(b)在選自表皮、周皮、薄壁組織、厚角組織、厚壁組織、木質(zhì)部、韌皮部和/或分泌結(jié)構(gòu)的組織中有活性。在一些實(shí)施方案中，可以在方法、組合物、體系和/或生物體中包括表達(dá)控制序列，以在植物中(例如，在甘蔗中)改變碳代謝(例如，在蔗糖積累組織中)和/或表達(dá)蛋白質(zhì)(例如，殺蟲蛋白)。根據(jù)一些實(shí)施方案，可以在方法、組合物、體系和/或生物體中包括表達(dá)控制序列以改進(jìn)害蟲耐受度和/或疾病耐受度和/或疾病抵抗力(例如，水稻)。甘蔗桿狀病毒(sugarcanebacilliformvirus，scbv)屬于花椰菜病毒科(caulimoviridae)badnavirus屬。那些屬于badnavirus屬的物種的病毒體具有無包膜(non-enveloped)的桿狀顆粒。血清學(xué)上，scbv與香蕉條斑病毒(bananastreakvirus，bsv)相關(guān)聯(lián)。scbv的基因組由～7600bp大小的單一的雙鏈dna組成，所述dna編碼三個(gè)可讀框(openreadingframe)，所述可讀框的轉(zhuǎn)錄由存在于orf3的3’部分和接近orf1的5’端之間的單一啟動(dòng)子介導(dǎo)。scbvmor分離株的啟動(dòng)子可以在單子葉植物和雙子葉植物二者中是有活性的。來自其他badnavirus屬(例如水稻東格魯病桿狀病毒(ricetungrobacilliformvirus)，鴨跖草屬黃花葉病毒(commelinayellowmosaicvirus)，香蕉條斑病毒和芋桿狀病毒(tarobacilliformvirus))的啟動(dòng)子已經(jīng)進(jìn)行外源基因表達(dá)測試。在一些實(shí)施方案中，來自這些病毒的啟動(dòng)子對(duì)于在單子葉植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以是有用的，因?yàn)樯鲜鯾adnavirus屬感染單子葉植物。盡管看起來來自rtbv、coymv和tabv的啟動(dòng)子典型地在維管組織中是有活性的，來自scbv和bsv的啟動(dòng)子介導(dǎo)外源基因的組成型表達(dá)。scbv與bsv緊密關(guān)聯(lián)并且可以在不同scbv分離株之間表現(xiàn)出相當(dāng)大的序列變異性。在由scbv感染的高貴蔗(saccharumofficinarum)克隆的scbv啟動(dòng)子區(qū)中可以存在相似的序列變異性。盡管由s.officinarumirengmaleng克隆的pcr衍生的(pcr-derived)啟動(dòng)子序列僅顯示出與另一scbvirengmaleng分離株(scbvim-12)的啟動(dòng)子序列～53％的序列同源性，該pcr衍生的啟動(dòng)子顯示出與bsv啟動(dòng)子區(qū)～74％的序列同源性。在位于德克薩斯里奧格蘭德谷中部的甘蔗田中的scbv發(fā)病率的初步篩選證實(shí)了在該區(qū)的甘蔗田中scbv是普遍的。來自scbv陽性的商業(yè)化的甘蔗雜種cp72-1210的scbv啟動(dòng)子已經(jīng)被分離、純化和克隆。其啟動(dòng)子活性已經(jīng)在各種單子葉植物和雙子葉植物中以及轉(zhuǎn)基因甘蔗植物中被證實(shí)。表達(dá)控制序列在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以包括一個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)或更多個(gè)操縱基因，一個(gè)或更多個(gè)增強(qiáng)子，一個(gè)或更多個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，和/或其組合。舉例來說，表達(dá)控制序列可以包括核酸，所述核酸具有(a)在單子葉植物、雙子葉植物、或單子葉植物和雙子葉植物二者中的啟動(dòng)子活性，以及(b)與seqidno：1多于約70％一致、與seqidno：1多于約75％一致、與seqidno：1多于約80％一致、與seqidno：1多于約81％一致、與seqidno：1多于約82％一致、與seqidno：1多于約83％一致、與seqidno：1多于約84％一致、與seqidno：1多于約85％一致、與seqidno：1多于約86％一致、與seqidno：1多于約87％一致、與seqidno：1多于約88％一致、與seqidno：1多于約89％一致、與seqidno：1多于約90％一致、與seqidno：1多于約92％一致、與seqidno：1多于約94％一致、與seqidno：1多于約96％一致、與seqidno：1多于約98％一致，和/或與seqidno：1多于約99％一致的核苷酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，與seqidno：1在全長上不是100％一致的序列可以具有在目標(biāo)核酸的長度上分散(例如，均勻地，隨意地(haphazardly))的變異點(diǎn)和/或變異區(qū)。舉例來說，表達(dá)控制序列可以包括與seqidno：1100％一致的序列的一個(gè)或更多個(gè)區(qū)(例如，在tata盒、ccaat盒，和/或tss模體(motif)中或與之接近)以及低于100％一致的長度和/或序列的一個(gè)或更多個(gè)區(qū)。舉例來說，表達(dá)控制序列可以包括與seqidno：1的核苷酸1-1450約95％一致的區(qū)(在長度和/或序列上)以及與seqidno：1的核苷酸1450-1786100％一致的區(qū)。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)控制序列可以與(a)seqidno：1的核苷酸1-1786，(b)seqidno：17，(c)seqidno：18，(d)seqidno：26，(e)seqidno：27，(f)seqidno：32，和/或(g)seqidno：33共享(share)相似性(例如，如在上文公開的從多于約70％至100％的一致性)。舉例來說，表達(dá)控制序列可以與seqidno：26、seqidno：27、seqidno：32和/或seqidno：33多于約85％一致；與seqidno：26、seqidno：27、seqidno：32和/或seqidno：33多于約95％一致；和/或與seqidno：2、seqidno：27、seqidno：32和/或seqidno：33多于約98％一致。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以包括tss1(seqidno:30)，tss2(seqidno：31)或tss1和tss2二者。舉例來說，表達(dá)控制序列可以至少約0.76kb長，其中，tss1的5’端(如果存在)在-760位置的100個(gè)核苷酸之內(nèi)，并且tss2的5’端(如果存在)在-80位置的100個(gè)核苷酸之內(nèi)。舉例來說，表達(dá)控制序列可以至少約0.7kb長，其中，tss1的5’端(如果存在)在表達(dá)控制序列的5’端的100個(gè)核苷酸之內(nèi)，并且tss2的5’端(如果存在)在-80位置的100個(gè)核苷酸之內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，tss2(如果存在)可以被這樣放置：所述tss2不延伸越過起始密碼子。在一些實(shí)施方案中，tss1可以是tss2的5’。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以包括由間隔區(qū)(例如，多于約500個(gè)核苷酸、多于約550個(gè)核苷酸、多于約600個(gè)核苷酸和/或多于約650個(gè)核苷酸)分隔的tss1和tss2，從約1至約75個(gè)核苷酸長的接頭，和/或起始密碼子。舉例來說，間隔區(qū)可以具有與seqidno：32的核苷酸96-726的序列多于約85％的一致性、多于約90％的一致性、多于約95％的一致性、和/或多于約98％的一致性。舉例來說，接頭可以具有與seqidno:32的核苷酸778-805的序列多于約85％的一致性、多于約90％的一致性、多于約95％的一致性、和/或多于約98％的一致性。表達(dá)控制序列可以還包括(例如，tss1的5’)具有與seqidno:32的核苷酸1-44的序列多于約85％一致性的序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)控制序列可以包括seqidno：1的片段。舉例來說，表達(dá)控制序列可以包括為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游(例如，核苷酸1787的上游)的seqidno：1的部分。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以包括具有與seqidno：1的核苷酸1-1786至少70％一致性的核酸。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)控制序列可以包括在病毒中(例如，植物病毒)發(fā)現(xiàn)的核酸序列。舉例來說，根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)控制序列可以包括scbv啟動(dòng)子、水稻東格魯病桿狀病毒啟動(dòng)子、鴨跖草屬黃花葉病毒啟動(dòng)子、香蕉條斑病毒啟動(dòng)子、芋桿狀病毒啟動(dòng)子和/或其組合。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以包括具有seqidno：1的核苷酸序列的核酸。根據(jù)一些實(shí)施方案，與35s啟動(dòng)子相比，表達(dá)控制序列可以可操作來驅(qū)動(dòng)細(xì)胞中的核酸序列(例如，編碼序列)的更高表達(dá)(例如，從約5％更高至約50％更高、從約50％更高至約500％更高)。舉例來說，表達(dá)的度量標(biāo)準(zhǔn)可以包括出現(xiàn)率和/或基因產(chǎn)物的積累(例如，rna和/或蛋白質(zhì))和/或自一個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)起(例如，起始點(diǎn)和/或發(fā)展階段后的經(jīng)過時(shí)間)的基因產(chǎn)物的總積累量。在一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物的比較試驗(yàn)(comparativeassay)可以是定性的、半定量的和/或定量的。比較試驗(yàn)可以間接和/或直接評(píng)定基因產(chǎn)物的存在和/或量。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以對(duì)一種或更多種刺激物(例如，一種或更多種小分子、一種或更多種植物防御誘導(dǎo)劑、機(jī)械損傷、溫度、壓力)敏感。舉例來說，表達(dá)控制序列的活性可以在感染病毒(例如，桿狀病毒)時(shí)被增強(qiáng)或抑制。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以包括光應(yīng)答元件、銅應(yīng)答元件、水楊酸應(yīng)答元件、植物生長素應(yīng)答元件、硫應(yīng)答元件和/或脫水應(yīng)答元件。模體的識(shí)別可以通過可獲得的模體預(yù)測軟件(例如日本國立農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的place數(shù)據(jù)庫)和/或?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)獲知。根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開涉及一個(gè)或更多個(gè)表達(dá)控制序列，所述表達(dá)控制序列像seqidno:1的核苷酸-1816至-1的核苷酸序列，和/或所述表達(dá)控制序列可操作來在至少一種單子葉植物和/或至少一種雙子葉植物中介導(dǎo)表達(dá)。舉例來說，表達(dá)控制序列可以包括與seqidno：1在一個(gè)或更多個(gè)位置處不同的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，與seqidno：1不同的表達(dá)控制序列的實(shí)施例可以包括來自一種或更多種桿狀病毒分離株的啟動(dòng)子。根據(jù)一些實(shí)施方案，在嚴(yán)格條件下，表達(dá)控制序列可以與具有seqidno：1的核苷酸序列的核酸雜交。舉例來說，嚴(yán)格條件可以包括(a)4×ssc，65℃，接下來0.1×ssc，65℃，60分鐘，和/或(b)50％甲酰胺、4×ssc，65℃。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以包括具有seqidno：1的序列的核酸和在至少一種單子葉植物和/或至少一種雙子葉植物中具有介導(dǎo)表達(dá)能力的核酸的缺失片段(deletionfragment)。得益于本公開的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以制備具有seqidno：1的序列的核酸的一個(gè)或更多個(gè)缺失片段?？梢酝ㄟ^使用表達(dá)控制序列的啟動(dòng)子或元件作為查詢序列，使用gappedblast算法(altschul等，1997年，核酸研究(nucl.acidsres.)25：3389-3402)(blosum62矩陣，gap成本(cost)為11，存留(persistence)成本每個(gè)殘基為1并且期望值(evalue)為10)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索來識(shí)別具有像seqidno：1的序列的表達(dá)控制序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，可以通過任何可利用的方法來評(píng)估序列一致性。舉例來說，可以在fasta應(yīng)用程序套件中(pearson和lipman，1988年，美國科學(xué)院院刊(proc.nat.acad.sci.)85：2444-24448；pearson，1990年，酶學(xué)方法(methodsinenzymology)183：63-98)用align(全球比對(duì))或lalign(本地同源性比對(duì))(blosum50矩陣并且gap罰分為-16、-4)來比較兩個(gè)序列?？梢愿鶕?jù)clustalw(larkin等，2007年，生物信息學(xué)(bioinformatics)23(21)：2947-2948)、blast、fasta或相似的算法來評(píng)估序列相似性。表達(dá)盒和載體在一些實(shí)施方案中，本公開涉及表達(dá)載體和/或表達(dá)盒，所述表達(dá)載體和/或表達(dá)盒用于在細(xì)胞中表達(dá)核酸序列(例如，編碼序列)并包括表達(dá)控制序列，并且所述核酸序列可操作地連接于所述表達(dá)控制序列。在一些實(shí)施方案中，盒可以包括能夠表達(dá)特定的編碼序列的核苷酸序列，所述特定的編碼序列被插入以便成為可操作地連接于在所述核苷酸序列中存在的一個(gè)或更多個(gè)表達(dá)控制序列。因此，舉例來說，根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)盒可以包括被期望在植物種子中表達(dá)的異源編碼序列。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及表達(dá)載體，舉例來說，所述表達(dá)載體可以包括具有表達(dá)控制序列和可操作地連接于所述表達(dá)控制序列的編碼序列的核酸。在允許編碼序列表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)錄)的條件下，表達(dá)載體可以與細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞)接觸。根據(jù)一些實(shí)施方案，在允許編碼序列在由植物細(xì)胞衍生的一個(gè)細(xì)胞和/或多個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的條件下，表達(dá)控制序列可以與植物細(xì)胞(例如，胚細(xì)胞、干細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞)接觸。在一些實(shí)施方案中，在允許表達(dá)載體的至少一部分在細(xì)胞的后代中遺傳的條件下，表達(dá)載體可以與細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞)接觸。表達(dá)載體的實(shí)施例可以包括(并非限制)在圖1、圖2、圖5和圖9中示出的載體。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)載體可以包括一個(gè)或更多個(gè)篩選標(biāo)記(selectablemarker)。舉例來說，當(dāng)載體在細(xì)菌宿主、酵母宿主和/或植物宿主中時(shí)，表達(dá)載體可以包括用于篩選的標(biāo)記(markerforselection)。根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開涉及表達(dá)盒，舉例來說，所述表達(dá)盒可以包括具有表達(dá)控制序列和可操作地連接于所述表達(dá)控制序列的編碼序列的核酸。表達(dá)盒可以被包括在表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，編碼序列可以包括在至少一種植物細(xì)胞中可表達(dá)的任何編碼序列。舉例來說，編碼序列可以包括人類的序列(例如，抗體序列)，非人類動(dòng)物的序列，植物的序列，酵母的序列，細(xì)菌的序列，病毒的序列(例如，植物病毒，動(dòng)物病毒和/或疫苗序列)，人造序列，其反義(antisense)序列，其片段，其變異體和/或其組合。根據(jù)一些實(shí)施方案，編碼序列可以包括糖運(yùn)輸基因和/或糖積累基因。糖運(yùn)輸基因的實(shí)施例可以包括(并非限制)二糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(例如，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體)和/或單糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。在一些實(shí)施方案中，編碼序列可以包括編碼具有殺蟲活性、抗菌活性和/或抗病毒活性的一種或更多種基因產(chǎn)物的序列?？梢跃哂袣⑾x活性、抗菌活性和/或抗病毒活性的基因產(chǎn)物的實(shí)施例可以包括(并非限制)抗生物素蛋白、植物殺蟲蛋白質(zhì)(例如，vip3a)、來自蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)的殺蟲結(jié)晶蛋白質(zhì)(例如，cry1、cry1ab、cry2、cry9)、豌豆蛋白(例如pa1b)、hirsutellina、凝集素(例如，smowdroplily凝集素、大蒜凝集素、洋蔥凝集素)、淀粉酶抑制劑(例如，α淀粉酶抑制劑)、arcelins(例如，來自豆類的arcelins)、蛋白酶抑制劑、溶菌酶(例如，牛溶菌酶、人溶菌酶、軟體動(dòng)物溶菌酶)、防御素、殼多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、其變異體，和/或其組合。根據(jù)一些實(shí)施方案，編碼序列可以包括用于形成和/或修飾聚合物的酶。用于形成和/或修飾聚合物的酶的實(shí)施例可以包括(并非限制)聚羥基脂肪酸酯合酶、4-羥基丁酸酰基-coa轉(zhuǎn)移酶、其變異體和/或其組合。在一些實(shí)施方案中，編碼序列可以包括編碼水解纖維素的一種或更多種酶的序列。水解纖維素的酶的實(shí)施例包括(并非限制)纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶(例如，內(nèi)切β-1,4葡聚糖酶)、葡糖苷酶(例如β葡糖苷酶)，水解酶(例如β-1,4-葡聚糖纖維二糖水解酶)、外切纖維素酶(exocellulases))、其變異體和/或其組合。在一些實(shí)施方案中，編碼序列可以包括編碼形成和/或修飾糖(例如，蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、果聚糖、果糖、塔格糖、三氯蔗糖)的一種或更多種酶的序列。形成和/或修飾糖的酶的實(shí)施例可以包括(并非限制)海藻糖-6-磷酸鹽合酶(tps)和海藻糖-6-磷酸鹽磷酸酶(tpp)。根據(jù)一些實(shí)施方案，編碼序列可以包括編碼用于形成或修飾甜菜堿、聚胺、脯氨酸、海藻糖、其變異體、和/或其組合的酶的序列。在一些實(shí)施方案中，編碼序列可以包括起始密碼子、內(nèi)含子、和/或翻譯終止序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，編碼序列可以包括一種或更多種天然或人造編碼序列(例如，編碼單一蛋白質(zhì)或嵌合體(chimera))。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)盒可以可選地包括終止序列。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列被用來構(gòu)建表達(dá)盒，在5’至3’方向上，所述表達(dá)盒包括(a)表達(dá)控制序列(例如，scbv啟動(dòng)子)，(b)異源基因或編碼序列，或者在所述表達(dá)控制序列的控制下與原生植物基因互補(bǔ)的序列，和/或(c)3’終止序列(例如，包括多聚腺苷化位點(diǎn)的終止序列)。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)盒的實(shí)施例可以包括seqidno：2、seqidno：3、seqidno:19的核苷酸710-3538、seqidno:21的核苷酸674-2472、seqidno:22的核苷酸674-2377、seqidno:38、seqidno:50和/或與其具有至少約98％和/或至少約99％一致性的序列。表達(dá)盒可以被包括在各種各樣的自主復(fù)制載體中以便構(gòu)建表達(dá)載體。舉例來說，可以通過將表達(dá)控制序列連接到要被表達(dá)的序列(例如，編碼序列)來構(gòu)建表達(dá)盒。一些用于構(gòu)建表達(dá)盒的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。舉例來說，對(duì)于連接dna片段，各種各樣的策略是可利用的，所述策略的選擇取決于dna片段末端的性質(zhì)。包含目標(biāo)啟動(dòng)子tata盒的限制和/或缺失片段可以在正向上被連接于無啟動(dòng)子的異源基因或編碼序列，例如gus的編碼序列。如得益于本公開的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以領(lǐng)會(huì)的，表達(dá)控制序列和/或其部分可以通過其他手段被提供，例如，化學(xué)合成或酶促合成。根據(jù)一些實(shí)施方案，在5’至3’方向上，核酸可以包括表達(dá)控制序列、接頭(可選)以及編碼序列。在一些實(shí)施方案中，接頭可以是從約1個(gè)核苷酸至約200個(gè)核苷酸的長度和/或可以包括一個(gè)或更多個(gè)限制性位點(diǎn)?？刹僮鞯剡B接于表達(dá)控制序列的核酸序列(例如，編碼序列)的表達(dá)水平可以被接頭的長度和/或序列，和/或編碼序列的5’序列影響。舉例來說，表達(dá)水平可以被從約-4位置至約+4位置的序列影響。在一些實(shí)施方案中，在5’至3’方向上，核酸可以包括表達(dá)控制序列、接頭以及編碼序列，其中-4至+4位置的序列包括選自表1示出的序列的序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，在5’至3’方向上，核酸可以包括表達(dá)控制序列和編碼序列，其中-4至+4位置的序列包括選自表1示出的序列的序列。在一些實(shí)施方案中，與其他-3至-1序列相比，為aaa的-3至-1序列可以與較高(例如，最高)的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)。與其他+1至+4序列(例如，atgc、atga、atgt)相比，為atgg的+1至+4序列可以與較高(例如，最高)的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)。表1.可選的銜接點(diǎn)(junction)序列在一些實(shí)施方案中，異源編碼序列的3’端可以可操作地連接于終止序列，舉例來說，所述終止序列包括多聚腺苷化位點(diǎn)，示例性地為(但不限于)胭脂堿合酶多聚腺苷化位點(diǎn)和/或章魚堿t-dna基因7多聚腺苷化位點(diǎn)。根據(jù)一些實(shí)施方案，多聚腺苷化位點(diǎn)可以由異源基因或編碼基因提供。根據(jù)一些實(shí)施方案，核酸可以包括5’非翻譯區(qū)(5’utr)、3’非翻譯區(qū)(3’utr)和/或其組合。舉例來說，核酸可以包括(例如，在5’至3’方向上)表達(dá)控制序列、5’utr、編碼序列(例如，轉(zhuǎn)基因)、3’utr和/或終止序列。微生物在一些實(shí)施方案中，本公開涉及包括表達(dá)控制序列的微生物。舉例來說，微生物可以包括細(xì)菌、酵母和/或病毒。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列可以包括scbv啟動(dòng)子。微生物可以包括表達(dá)控制序列和可操作地連接于所述表達(dá)控制序列的編碼序列。微生物的實(shí)施例可以包括(并非限制)農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)、大腸桿菌(escherichiacoli)、鱗翅類細(xì)胞系、水稻東格魯病桿狀病毒、鴨跖草屬黃花葉病毒、香蕉條斑病毒和芋桿狀病毒和/或桿狀病毒(baculovirus)。表達(dá)控制序列可以在基因組核酸上和/或基因組外(extra-genomic)核酸上存在。植物在一些實(shí)施方案中，本公開涉及包括表達(dá)控制序列的植物細(xì)胞(例如，胚細(xì)胞、干細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞)、組織和/或植物。在一些實(shí)施方案中，植物和/或植物細(xì)胞可以選自單子葉植物和/或雙子葉植物。單子葉植物的實(shí)施例可以包括(并非限制)甘蔗、芒草、芒草與甘蔗雜種、柳枝稷、燕麥、小麥、大麥、玉米、稻米、香蕉、絲蘭、洋蔥、蘆筍和/或高粱。雙子葉植物的實(shí)施例可以包括(并非限制)咖啡、番茄、胡椒、煙草、利馬豆、擬南芥、橡膠、橙、葡萄柚、馬鈴薯、葡萄柚、馬鈴薯、南瓜、豌豆和/或甜菜。在一些實(shí)施方案中，植物細(xì)胞可以被包括在植物組織、植物器官和/或整株植物中。根據(jù)一些實(shí)施方案，在組織、器官和/或整株植物中的植物細(xì)胞可以與一個(gè)或更多個(gè)等同基因的細(xì)胞和/或一個(gè)或更多個(gè)異源細(xì)胞鄰接。在一些實(shí)施方案中，植物可以包括原代轉(zhuǎn)化株和/或其后代。在一些實(shí)施方案中，包括表達(dá)控制序列的植物可以進(jìn)一步包括可操作地連接于所述表達(dá)控制序列的轉(zhuǎn)基因。根據(jù)一些實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因可以在植物中被表達(dá)，所述植物在所有的(例如，基本上所有的)器官類型、組織類型和/或細(xì)胞類型中包括表達(dá)控制序列，所述器官類型、組織類型和/或細(xì)胞類型包括(并非限制)莖稈(stalk)、葉、根、種子、花、果實(shí)、分生組織、薄壁組織、貯藏薄壁組織、厚角組織、厚壁組織、表皮、葉肉、維管束鞘、保衛(wèi)細(xì)胞、原生木質(zhì)部、后生木質(zhì)部、韌皮部、韌皮部伴隨物(companion)和/或其組合。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因和/或其基因產(chǎn)物可以位于和/或易位于一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞器中(例如，液泡、葉綠體、線粒體、質(zhì)粒)。表達(dá)體系根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開涉及用于表達(dá)(例如，到高水平)核酸序列(例如，包括一個(gè)或更多個(gè)編碼序列)的體系。舉例來說，表達(dá)體系可以在植物中被包括，以被用作高價(jià)值的蛋白質(zhì)的生物工廠。不必被限制于任何特定作用機(jī)制，表達(dá)體系可以得益于附加的和/或協(xié)同的表達(dá)控制序列活性、轉(zhuǎn)錄協(xié)同效應(yīng)、和/或引入的編碼序列(例如，轉(zhuǎn)基因)的降低的沉默作用，所述沉默作用是當(dāng)相同的啟動(dòng)子被用來表達(dá)相同或不同轉(zhuǎn)基因時(shí)，在植物中頻繁觀察到的現(xiàn)象，并且構(gòu)成植物作為生物工廠的經(jīng)濟(jì)開發(fā)的主要風(fēng)險(xiǎn)。包括表達(dá)體系的植物可以貫穿轉(zhuǎn)基因植物的一個(gè)或更多個(gè)連續(xù)世代保持符合期望的(例如，高的)表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)體系可以包括兩個(gè)或更多個(gè)表達(dá)控制序列(例如，啟動(dòng)子)，所述表達(dá)控制序列的每個(gè)可操作地連接于各自數(shù)量的單一編碼序列的克隆。根據(jù)一些實(shí)施方案，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)表達(dá)控制序列(例如，啟動(dòng)子)可以被可操作地連接于單一編碼序列的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)克隆。根據(jù)一些實(shí)施方案，每個(gè)表達(dá)控制序列可以獨(dú)立地是組成型的和/或被調(diào)控的(例如，組織特異性表達(dá)、發(fā)育誘導(dǎo)表達(dá)，應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)、防衛(wèi)誘導(dǎo)表達(dá)和/或干旱誘導(dǎo)表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，編碼序列的每個(gè)克隆可以與一個(gè)或更多個(gè)其他克隆相同。根據(jù)一些實(shí)施方案，編碼序列的拷貝可以某種程度上互相不同，舉例來說，在一個(gè)拷貝可以是為一個(gè)科、屬和/或種優(yōu)化的密碼子的情況下，另一拷貝可以是為不同的科、屬和/或種優(yōu)化，或者根本不是優(yōu)化的密碼子。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)表達(dá)控制序列-編碼序列克隆可以獨(dú)立地在表達(dá)載體上、在基因組核酸上和/或在基因組外核酸上存在(例如，在微生物和/或植物中)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)表達(dá)控制序列-編碼序列克隆還可以獨(dú)立地包括一個(gè)或更多個(gè)終止子。根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開涉及甘蔗的轉(zhuǎn)基因植物(一種高的生物量生產(chǎn)者和糖積累器)，所述甘蔗的轉(zhuǎn)基因植物是由用表達(dá)體系(例如，多個(gè)啟動(dòng)子-一個(gè)轉(zhuǎn)基因體系)轉(zhuǎn)化的外植體(explant)產(chǎn)生的。根據(jù)本公開的一些實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因甘蔗植物被觀察到表達(dá)高水平的(多達(dá)6.0mg每千克總莖稈鮮重＝～1％總可溶的蛋白質(zhì)(totalsolubleprotein)或tsp)可提取的活性牛胃溶菌酶(bovinestomachlyzozyme，bvlz，一種抗菌蛋白質(zhì))。所述高的bvlz表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因植物的連續(xù)的世代中是穩(wěn)定的，容許相應(yīng)蛋白質(zhì)的經(jīng)濟(jì)化的生產(chǎn)和純化。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及用于生產(chǎn)多個(gè)啟動(dòng)子-一個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因植物的方法。舉例來說，方法可以被用來轉(zhuǎn)化不同種類的甘蔗，所述方法通過在來自各自的載體的多個(gè)啟動(dòng)子的控制下，用bvlz轉(zhuǎn)基因來共轟擊目標(biāo)外植體組織(例如，胚性愈傷組織或葉卷盤(leafrolldisc))，所述bvlz轉(zhuǎn)基因編碼在牛胃中正常存在的蛋白質(zhì)并且是用于在單子葉植物植株中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。方法根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開涉及用包括表達(dá)控制序列的核酸來轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染植物的方法。舉例來說，方法可以包括用包括表達(dá)控制序列的核酸來接觸細(xì)胞(例如，酵母細(xì)胞和/或植物細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，用核酸與細(xì)胞接觸可以包括將目標(biāo)細(xì)胞與包括所述核酸(例如，在二元載體中)的細(xì)菌(例如，土壤桿菌屬)共培養(yǎng)、在所述核酸存在下電穿孔所述細(xì)胞、用包括所述核酸的病毒(桿狀病毒)感染所述細(xì)胞、用包括所述核酸的顆粒轟擊所述細(xì)胞(例如，在葉、莖和/或愈傷組織中的細(xì)胞)、在包括所述核酸和一種或更多種晶須(例如，碳化硅晶須)的溶液中攪拌所述細(xì)胞，和/或化學(xué)地誘導(dǎo)所述細(xì)胞吸收細(xì)胞外的dna。在一些實(shí)施方案中，使核酸與細(xì)胞接觸可以包括使所述核酸與植物葉盤和/或植物原生質(zhì)體接觸。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及用于在細(xì)胞中表達(dá)核酸序列(例如，包括一個(gè)或更多個(gè)編碼序列)的方法。舉例來說，方法可以包括在允許編碼序列表達(dá)的條件下，用核酸接觸細(xì)胞(例如，酵母細(xì)胞和/或植物細(xì)胞)，所述核酸包括表達(dá)控制序列和可操作地連接于所述表達(dá)控制序列的編碼序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，表達(dá)可以是組成型的、條件性的、原生的(例如，在正常時(shí)間和/或組織中)，和/或異位的(ectopic)。在一些實(shí)施方案中，方法還可以包括在植物中(例如，單子葉植物和/或雙子葉植物)表達(dá)核酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，方法可以包括從植物收獲(例如，部分純化)在植物中表達(dá)的核酸序列(例如，外源序列)的基因產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及用于分離在至少一種單子葉植物和/或至少一種雙子葉植物中可操作的表達(dá)控制序列的方法。舉例來說，方法可以包括用包括核酸的探針進(jìn)行文庫(例如，植物基因組文庫、細(xì)菌人工染色體文庫、植物病毒基因組文庫)篩選，所述核酸具有seqidno：1的核酸序列、其互補(bǔ)基因(complement)和/或其一部分(例如，在嚴(yán)格雜交條件下)。方法可以包括使用一個(gè)或更多個(gè)引物擴(kuò)增(例如，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來自文庫的表達(dá)控制序列，所述引物衍生自seqidno：1的核酸序列、其互補(bǔ)基因和/或其一部分的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，在至少一種單子葉植物和/或至少一種雙子葉植物中的候選表達(dá)控制序列的可操作性可以由形成候選表達(dá)控制序列和編碼序列(在所述至少一種單子葉植物和/或所述至少一種雙子葉植物中可表達(dá))的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的融合基因(fusion)來形成表達(dá)盒，將所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)移至所述至少一種單子葉植物和/或所述至少一種雙子葉植物中，和/或檢測所述編碼序列的表達(dá)來確認(rèn)。用于檢測編碼序列的表達(dá)的試驗(yàn)可以取決于編碼序列的性質(zhì)。舉例來說，編碼序列可以包括報(bào)告基因(例如，自發(fā)熒光蛋白質(zhì)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和β-萄糖醛酸酶(gus))?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來高靈敏度地檢測轉(zhuǎn)基因生物體中的報(bào)告酶。根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開涉及用于分離在至少一種單子葉植物和/或至少一種雙子葉植物中可操作的表達(dá)控制序列的方法。舉例來說，方法可以包括從與在seqidno：1的5’和/或3’端處或接近seqidno：1的5’和/或3’端的序列對(duì)應(yīng)的(但不必需相等)從約15至約40個(gè)核苷酸的長度選擇一個(gè)或更多個(gè)引物，在允許表達(dá)控制序列擴(kuò)增的條件下，將所述一個(gè)或更多個(gè)引物與擴(kuò)增文庫(例如，部分或全部的病毒基因組文庫、部分或全部的植物基因組文庫)和核酸聚合酶接觸。根據(jù)一些實(shí)施方案，植物基因組文庫可以包括從被病毒感染的植物和/或脫毒(virus-free)植物分離的核酸。在一些實(shí)施方案中，方法可以包括用包括seqidno:1或其片段的探針進(jìn)行文庫篩選。一個(gè)或更多個(gè)候選的表達(dá)控制序列(例如，擴(kuò)增產(chǎn)物)可以被克隆到表達(dá)載體中驅(qū)動(dòng)編碼序列(例如，gus，一種自發(fā)熒光蛋白質(zhì))表達(dá)的位置。舉例來說，擴(kuò)增產(chǎn)物的可操作性可以通過在允許編碼序列表達(dá)的條件下，用這樣的表達(dá)載體接觸植物細(xì)胞(例如，微粒彈射轟擊法(microprojectilebombardment)、土壤桿菌屬介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法)并且檢查所述植物細(xì)胞編碼序列的基因產(chǎn)物(例如，被編碼的蛋白質(zhì))的出現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及在至少一種單子葉植物和/或至少一種雙子葉植物中提高編碼序列的表達(dá)水平的方法。舉例來說，表達(dá)盒和/或表達(dá)載體可以被引入植物以便有效表達(dá)編碼序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，產(chǎn)生具有水平提高的蔗糖積累基因產(chǎn)物和/或防衛(wèi)基因產(chǎn)物的植物的方法可以包括用表達(dá)載體和/或表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且再生具有水平提高的蔗糖積累基因或防衛(wèi)基因的產(chǎn)物的植物，所述表達(dá)載體和/或表達(dá)盒包括可操作地連接于蔗糖積累基因或防衛(wèi)基因的表達(dá)控制序列。在本公開的一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因甘蔗株系可以被產(chǎn)生，其中糖代謝被改變以提高莖干重(例如，多于約50％的蔗糖、多于約60％的蔗糖、多于約70％的蔗糖)。根據(jù)一些實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因蔗糖株系可以被生產(chǎn)為具有增強(qiáng)的生物殺蟲活性(例如，用于防止莖鉆蛀昆蟲，可能是最具破壞力的害蟲)。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及在至少一種單子葉植物和/或至少一種雙子葉植物中降低編碼序列(例如，原生植物序列、病毒序列)的表達(dá)水平的方法。舉例來說，方法可以包括用表達(dá)載體接觸至少一種單子葉植物細(xì)胞和/或至少一種雙子葉植物細(xì)胞，所述表達(dá)載體包括表達(dá)控制序列和與編碼序列的至少一部分互補(bǔ)并且可操作地連接于所述表達(dá)控制序列的反義序列。在一些實(shí)施方案中，方法可以包括用rna干擾(rnainterference，rnai)表達(dá)載體接觸至少一種單子葉植物細(xì)胞和/或至少一種雙子葉植物細(xì)胞，所述rna干擾表達(dá)載體包括表達(dá)控制序列和核酸序列，所述核酸序列是其表達(dá)水平要被降低的和/或沉默的原生植物基因的反向重復(fù)，并且可操作地連接于所述表達(dá)控制序列。在一些實(shí)施方案中，方法可以包括用共抑制表達(dá)載體接觸至少一種單子葉植物細(xì)胞和/或至少一種雙子葉植物細(xì)胞，所述共抑制表達(dá)載體包括表達(dá)控制序列以及編碼原生植物基因、可操作地連接于所述表達(dá)控制序列的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，胚性愈傷組織和其他易感組織可以用不含(“disarmed”)外源含有dna的a.tumefaciens接種，培養(yǎng)若干天并且轉(zhuǎn)移到含有抗生素的介質(zhì)中。在包含合適的抗生素的介質(zhì)中生根后，被轉(zhuǎn)化的枝條(shoot)可以被選擇并且被轉(zhuǎn)移至土壤。轉(zhuǎn)基因植物可以被授粉，來源于這些植物的種子可以被收集并且在抗生素介質(zhì)中生長。根據(jù)一些實(shí)施方案，通過免疫學(xué)的、組織化學(xué)的、mrna表達(dá)或活性試驗(yàn)，組織、發(fā)育中的種子、幼苗和成熟的植物中的異源或報(bào)告基因的表達(dá)可以被監(jiān)控。對(duì)于表達(dá)盒的表達(dá)試驗(yàn)的選擇可以取決于異源編碼序列的性質(zhì)。舉例來說，若合適的核苷酸探針是可獲得的，則可以使用rna凝膠印記分析(rnagelblotanalysis)來評(píng)估轉(zhuǎn)錄。若由異源基因編碼的多肽的抗體是可獲得的，則可以使用western分析和免疫組織化學(xué)定位來評(píng)估多肽的生產(chǎn)和定位。取決于所述異源基因，可以使用合適的生物化學(xué)試驗(yàn)。本公開還涉及用于從植物分離和/或純化(“purifying”)基因產(chǎn)物(例如，核酸和/或蛋白質(zhì))的方法。舉例來說，方法可以包括提供包括核酸的植物，所述核酸具有表達(dá)控制序列和可操作地連接于所述表達(dá)控制序列的編碼序列，其中所述編碼序列編碼關(guān)注的基因產(chǎn)物。根據(jù)一些實(shí)施方案，方法可以包括在植物中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)、從植物中提取包含所述轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的汁液、清潔所述汁液以移除顆粒物質(zhì)，和/或?qū)⑺鲋簜魉屯ㄟ^至少一個(gè)膜以產(chǎn)生兩個(gè)部分(fraction)，所述部分中的一個(gè)包含所述轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)可以包括凝集素、酶、疫苗、細(xì)菌裂解肽、細(xì)菌裂解蛋白、抗菌肽、抗菌肽蛋白、抗病毒肽、抗病毒蛋白、殺蟲肽、殺蟲蛋白、治療肽以及治療蛋白。如將被得益于本公開的本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，用于在至少一種單子葉植物和/或至少一種雙子葉植物中表達(dá)核酸序列的其他等同的或可替代的組合物、設(shè)備、方法和體系可以被預(yù)想，而不背離本文所包含的描述。相應(yīng)地，所示出和描述的實(shí)施本公開的方式僅被理解為是說明性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在多個(gè)部件的形狀、尺寸、數(shù)量和/或排列方面進(jìn)行各種變化，而不背離本公開的范圍。舉例來說，表達(dá)控制序列的位置和數(shù)量可以被改變。每個(gè)公開的方法和方法步驟可以與任何其他公開的方法和方法步驟關(guān)聯(lián)進(jìn)行并且可以以任何順序進(jìn)行。同樣地，在已經(jīng)提供范圍的情況下，公開的端點(diǎn)可以被認(rèn)為是如特定的實(shí)施方案所期望或需要的精確值和/或近似值。當(dāng)端點(diǎn)是近似的，靈活度可以根據(jù)范圍的數(shù)量級(jí)成比例地改變。舉例來說，一方面，在約5至約50的范圍的上下文中，約50的范圍端點(diǎn)可以包括50.5，但是不包括52.5或55，而另一方面，在約0.5至50的范圍的上下文中，約50的范圍端點(diǎn)可以包括55，但是不包括60或75。此外，在一些實(shí)施方案中，混合和匹配范圍端點(diǎn)可能是符合期望的。同樣地，在一些實(shí)施方案中，每個(gè)公開的圖(例如，在一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施例和/或附圖)可以形成范圍的基礎(chǔ)(例如，公開值+/-約10％、公開值+/-約100％)和/或范圍端點(diǎn)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以對(duì)制備和使用本公開的組合物、設(shè)備和/或體系的方法進(jìn)行各種變化。舉例來說，組合物、設(shè)備和/或體系可以視情況而被制備和/或使用來用于動(dòng)物和/或人類用途(例如，關(guān)于公共衛(wèi)生、傳染性、安全、毒性、生物計(jì)量以及其他考慮)。這些等同物和替代物以及顯而易見的改變和修飾被意圖包括在本公開的范圍內(nèi)。相應(yīng)地，前述公開意圖是說明性的(但非限制性的)，本公開的范圍，如所附的權(quán)利要求書所說明的。實(shí)施例本公開的一些具體實(shí)施例的實(shí)施方案可以通過本文所提供的一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施例而被說明。實(shí)施例1：德克薩斯里奧格蘭德谷中部(midriograndevalley)的甘蔗田中的scbv感染從在德克薩斯里奧格蘭德谷中部的田里隨機(jī)挑選的甘蔗植株中收獲葉。從被收獲的甘蔗葉中提取dna后，通過southern印記的方法檢查scbv感染的發(fā)生率(表2)。用于southern印記的32p-dctp標(biāo)記的dna探針是由約1.4kb的scbv片段制備的，該片段包含scbvorf1，orf2以及orf3的5’端450nt，所述片段是以由cp72-1210制備的甘蔗dna通過pcr克隆得到的。southern印記的結(jié)果顯示，在被檢測的14個(gè)甘蔗品種/克隆中，有11個(gè)品種/克隆為scbv陽性，這表明在里奧格蘭德谷中部的田地中，scbv的感染是普遍存在的。表2.在商業(yè)化甘蔗品種中的scbv發(fā)生率*結(jié)果基于southern印記。實(shí)施例2：scbv啟動(dòng)子(scbv21)的克隆和測序從scbv陽性的甘蔗栽培品種cp72-1210的葉組織中分離總基因組dna。調(diào)整dna濃度至約100ng/μl，約250ngdna用于pcr反應(yīng)。引物序列信息由中國廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的zhouguohui博士提供，zhou博士克隆過scbv的華南地區(qū)分離株(isolate)。引物名稱及序列如下所示：p-2(5’-acgcggtaacacgtagtcctaaggt-3’；seqidno：11)，p-w3f(5’-gacatcaaatggttgtatcc-3’；seqidno：12)，p-w4f(5’-acaccgcattcagagtgaag-3’；seqidno：13)和p-w1r(5-ccgcattaacgttctcc-3’；seqidno：14)。所有pcr反應(yīng)均使用taqdna聚合酶(neb)，遵循廠商的建議，在20μl反應(yīng)混合物中完成。引物對(duì)p-2和p-w3f用于第一輪pcr反應(yīng)，采用用于包含其啟動(dòng)子序列的scbv基因組預(yù)擴(kuò)增的下列pcr參數(shù)：在94℃4分鐘，1個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)94℃30秒、48℃30秒以及72℃5分鐘，10個(gè)循環(huán)。隨后，5μl第一輪pcr反應(yīng)混合物用作第二輪pcr反應(yīng)的模板，第二輪pcr反應(yīng)采用引物對(duì)p-w1r和p-w4f，通過下列pcr程序：94℃4分鐘，1個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)94℃30秒、52℃30秒以及72℃4分鐘，35個(gè)循環(huán)；以及72℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)。pcr反應(yīng)混合物通過在1％的瓊脂糖凝膠上電泳被分析。所得到的pcr產(chǎn)物的大小為約2kb，被克隆至pgemt-easy載體(promega)。通過測序，分析克隆產(chǎn)物的核酸序列，確認(rèn)被克隆的片段與scbvorf3具有同源性。在與其他scbv啟動(dòng)子序列的序列比對(duì)之后，由保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩個(gè)引物：scbv/prom/f(5’-gaagaacagcatgctgaacatctgtggaagatgc-3’；seqidno：15)和scbv/prom/r(5’-caaacttgctcaaatgatcatgtggtgaactaccgatg-3’；seqidno：16)。采用這兩個(gè)引物的pcr條件是：94℃4分鐘，1個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)94℃30秒、52℃30秒以及72℃2分鐘，35個(gè)循環(huán)；以及72℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)。1％的瓊脂糖凝膠上分析pcr產(chǎn)物，將該pcr產(chǎn)物克隆至pgemt-easy，并且通過測序驗(yàn)證該克隆序列。被克隆的pcr產(chǎn)物被命名為pgem/scbv21(圖1)。實(shí)施例3：scbv21啟動(dòng)子活性為了檢測被克隆的scbv21的啟動(dòng)子活性，將該啟動(dòng)子亞克隆至β-葡萄糖醛酸酶(gus)基因的上游來構(gòu)建pbi/scbv21-gus(圖2)。通過用基因槍將包裹著dna的鎢粒轟擊洋蔥表皮層來測試scbv21的啟動(dòng)子活性。轟擊后2天通過組化gus試驗(yàn)確認(rèn)gus表達(dá)(圖3)。實(shí)施例4：來自不同scbv分離株的scbv啟動(dòng)子的序列比較將scbv21的序列和兩個(gè)scbv分離株——scbvirengmaleng(im)和scbvmorocco(mor)進(jìn)行比較。表3顯示scbv21具有與scbv-im和scbv-mor分別為87％和71％的一致性。表3.scbv21與兩個(gè)其他的scbv分離株的序列比較scbv-im-aj277091*scbv-morm89923*scbv2187％71％*ncbigenebank數(shù)據(jù)庫編號(hào)**序列一致性(％)：通過在ncbigenebank中用scbv21的blastn檢索得到。實(shí)施例5：轉(zhuǎn)基因甘蔗中scbv21驅(qū)動(dòng)的gus轉(zhuǎn)基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因甘蔗是用dna構(gòu)建體pbi/scbv21-gus(圖1)生成，并將此轉(zhuǎn)基因株系的gus基因表達(dá)水平與其他轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行比較，其中，其他轉(zhuǎn)基因株系的gus轉(zhuǎn)基因表達(dá)用camv35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，或者缺乏熱激元件的玉米u(yù)bi啟動(dòng)子(mubi1-nohse)驅(qū)動(dòng)(圖4)。在scbv21/gus轉(zhuǎn)基因株系中，gus基因的表達(dá)水平大約比在35s/gus轉(zhuǎn)基因株系中高約四到六倍，而mubi1-nohse/gus轉(zhuǎn)基因株系顯示最高的gus基因的表達(dá)水平，高于scbv21/gus株系中六到十倍(圖4)。實(shí)施例6：在高粱、煙草和利馬豆種子中scbv21介導(dǎo)gus表達(dá)通過將dna包裹的鎢粒在制備的植物樣品上進(jìn)行轟擊，在另一種單子葉植物(高粱)和兩種雙子葉植物物種(煙草和利馬豆)中，scbv21的啟動(dòng)子活性被瞬時(shí)地檢測(圖6)。結(jié)果顯示，不管是何種組織的樣品(葉或種子)或何種植物物種(單子葉植物或雙子葉植物)，scbv21都起啟動(dòng)子的作用(圖6)。實(shí)施例7：各種啟動(dòng)子的相對(duì)表達(dá)水平：在葉組織中的gus和eyfp瞬時(shí)表達(dá)在轟擊之前，將幼嫩的葉段在ms0.6固體培養(yǎng)基(murashigeandskoog，1962)，b5g1mg/l，0.6mg/l2,4-d，500mg/l水解酪蛋白，20g/l蔗糖和7g/l瓊脂中培養(yǎng)4天，葉卷被保存10天或28天。用氯化鈣和亞精胺將質(zhì)粒dna以每mg鎢4μg(針對(duì)gus構(gòu)建體)或1μg(針對(duì)eyfp構(gòu)建體)沉淀到鎢粒(1.1μm，bio-rad公司)上。實(shí)施例8：各種啟動(dòng)子的相對(duì)表達(dá)水平：gus組化轟擊后48小時(shí)之后，將葉段轉(zhuǎn)移至0.1％x-gluc染色液中，此染色液含0.1％(v/v)tritonx-100和0.1m磷酸鈉緩沖液(ph7.0)。隨后，組織在37℃孵育過夜(24小時(shí))。染色之后，通過將組織浸泡在70％(v/v)乙醇中并換液兩次，除去葉綠素。觀察組織的gus染色情況，并用olympusd71相機(jī)連接至szx7立體顯微鏡(日本)拍攝照片。實(shí)施例9：各種啟動(dòng)子的相對(duì)表達(dá)水平：gus活性定量試驗(yàn)gus定量熒光試驗(yàn)按照改進(jìn)的jefferson程序(1987)進(jìn)行。稱取500mg植物組織并在液氮中研磨，然后，與750μlgus提取緩沖液一起轉(zhuǎn)移至1.5ml微量離心管中，所述gus提取緩沖液含50mm磷酸鈉緩沖液(ph7.0)，10mm2-巰基乙醇，10mmedta(ph8.0)和0.1％(v/v)tritonx-100。短暫渦旋振蕩后，將這些管在冰上孵育1小時(shí)，并且在4℃12000g離心10分鐘。上清的一份(aliquot)用于蛋白質(zhì)濃度確定和gus活性試驗(yàn)。按照基于dc蛋白試驗(yàn)試劑盒(bio-rad公司)的使用手冊(cè)的lowry試驗(yàn)確定蛋白質(zhì)濃度。通過向25μlmug(4mm)試驗(yàn)緩沖液添加10μl蛋白質(zhì)提取物和15μlgus提取緩沖液，對(duì)葉樣品進(jìn)行熒光酶法gus試驗(yàn)。針對(duì)根樣品，25μl蛋白質(zhì)提取物被用來與25μlmug溶液反應(yīng)。在37℃孵育1小時(shí)后，添加950ml0.2mna2co3溶液以終止反應(yīng)。在versafluortm熒光計(jì)(bio-rad公司)上在365nm激發(fā)后，讀取在455nm的光度值。未轉(zhuǎn)染植株的蛋白質(zhì)提取物被用作為負(fù)對(duì)照樣品，gus提取緩沖液中4-甲基傘形酮(mu，sigma)溶液的一系列稀釋液被用作標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例10：各種啟動(dòng)子的相對(duì)表達(dá)水平：eyfp圖像采集及分析轟擊后，每6小時(shí)針對(duì)紅、綠、藍(lán)通道采集4080x3072像素、256灰度水平的圖像至少240小時(shí)。使用imagej軟件(rasband1997-2009)根據(jù)chiera等人(2007和2008)描述的修訂方法量化eyfp表達(dá)。每個(gè)圖像系列都通過adobeimagereadycs(8.0.1版)被輸入、調(diào)整大小至800x600像素并排列。排列后，該系列圖像被輸出為“mov”文件。使用imagej軟件打開該“mov”文件，從該系列圖像中剪切出一塊包括400x300像素、含最高表達(dá)細(xì)胞數(shù)目的區(qū)域，然后將其保存為“avi”文件用于eyfp定量分析。在“avi”文件中的每一系列圖像都被分為紅、綠和藍(lán)通道。在綠色通道背景中的一沒有eyfp表達(dá)的20×20像素區(qū)域被選擇用于背景灰度值的確定，并被從后續(xù)圖像中扣除以消除背景熒光。調(diào)整好閾值水平后，通過由chiera和hernandez-garcia善意贈(zèng)送的宏指令程序，生成熒光點(diǎn)(focuinumber)數(shù)值、平均灰度值以及總面積值。用每個(gè)像素的平均灰度值乘以總面積計(jì)算“總表達(dá)”值。實(shí)施例11：各種啟動(dòng)子的相對(duì)表達(dá)水平：原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)染采用chen(1987)和yoo等人(2007)的改進(jìn)方法，從愈傷組織分離原生質(zhì)體。在搖床(250ml三角瓶；100rpm)上，在ms3液體培養(yǎng)基(murashige和skoog，1962)中培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)物2-3個(gè)月，每周轉(zhuǎn)接一次(1：5稀釋)，ms3液體培養(yǎng)基含b5g1mg/l，3.0mg/l2,4-d，500mg/l酪蛋白水解物和20g/l蔗糖。收獲新鮮的懸浮細(xì)胞(被轉(zhuǎn)接2-3天)并在酶溶液(20mmmes(ph5.7)，2.0％纖維素酶(emdbiosciences，usa)，0.1％果膠酶y-23(duchefabiochemie，usa)，0.4m甘露糖醇，20mmkcl，10mmcacl2和0.1％bsa)中消化過夜。收集原生質(zhì)體，并在w5溶液中洗兩遍，100g離心兩分鐘。洗第二遍后，將原生質(zhì)體重懸在mmg溶液(4mmmes-koh，ph5.7，0.4m甘露糖醇，15mmmgcl2)中達(dá)到1～2×106個(gè)原生質(zhì)體/ml的終濃度。100μl原生質(zhì)體被轉(zhuǎn)移至2-ml圓底微型離心管中，與質(zhì)粒dna(10μl中10μg)輕柔混合。等體積的滅菌去離子水(模擬轉(zhuǎn)染)作為對(duì)照轉(zhuǎn)染。通過添加110μlpeg-鈣溶液(40％peg-4000，0.2m甘露糖醇，100mmcacl2)啟動(dòng)轉(zhuǎn)染。輕輕拍打所述管使原生質(zhì)體和peg-鈣溶液混合，并在室溫孵育10分鐘。用440μlw5溶液稀釋該混合物終止轉(zhuǎn)染。通過100g離心2分鐘收集被轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體，并將其重懸在250μlw5溶液中。在將原生質(zhì)體在暗處室溫保持16小時(shí)后，研究eyfp和gus表達(dá)分析。在進(jìn)行g(shù)us活性分析之前，通過在100g離心2分鐘收獲原生質(zhì)體，隨后棄除上清并在-80℃貯存。向冷凍的原生質(zhì)體中添加100μlgus提取緩沖液，通過漩渦振蕩2秒強(qiáng)力混合以破裂原生質(zhì)體。在冰上保持5分鐘之后，1000g離心2分鐘。取25μl原生質(zhì)體裂解物加入25μl4mmmug試驗(yàn)緩沖液，37℃孵育60分鐘。實(shí)施例12：各種啟動(dòng)子的相對(duì)表達(dá)水平：統(tǒng)計(jì)分析各種啟動(dòng)子的相對(duì)表達(dá)水平示于表4-10。數(shù)據(jù)采集自2-4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)6-10次事件(event)。statisticalanalysissystem(統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng))(8.0版，sasinstitute，美國)的glm程序被用于統(tǒng)計(jì)分析。用student-newman-keuls(snk)檢驗(yàn)進(jìn)行平均值的多重比較。表4.甘蔗葉段中g(shù)us的瞬時(shí)表達(dá)——斑點(diǎn)(spot)數(shù)**圖像使用顯微鏡拍攝得到(15倍)。表5.甘蔗葉段中eyfp的瞬時(shí)表達(dá)——熒光點(diǎn)(foci)數(shù)**數(shù)據(jù)采集自轟擊后48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)。圖像使用帶yfp濾光片的熒光顯微鏡拍攝得到(15倍)。表6.甘蔗葉段中eyfp的瞬時(shí)表達(dá)——總表達(dá)**總表達(dá)作為每個(gè)像素的平均灰度值×總面積×1000測得。數(shù)據(jù)采集自轟擊后48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)。圖像使用帶yfp濾光片的熒光顯微鏡拍攝得到(15倍)。表7.甘蔗原生質(zhì)體中g(shù)us的瞬時(shí)表達(dá)——gus活性**每分鐘p-mole4-mu/μg蛋白質(zhì)表8.甘蔗原生質(zhì)體中eyfp的瞬時(shí)表達(dá)——熒光點(diǎn)數(shù)**圖像使用帶yfp濾光片的熒光顯微鏡拍攝得到(85.5倍)。表9.轉(zhuǎn)基因甘蔗葉中的gus表達(dá)——gus活性*數(shù)據(jù)來自兩次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。mubi1-nohse/gus：2次事件，5棵植株；scbv21/gus：2次事件，6棵植株；35s/gus：6次事件，18棵植株。*每分鐘p-mole4-mu/μg蛋白質(zhì)表10.轉(zhuǎn)基因甘蔗莖中的gus表達(dá)——gus活性*數(shù)據(jù)來自兩次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。mubi1-nohse/gus：5棵植株，1次事件；scbv21/gus：1棵植株，1次事件；35s/gus：3棵植株，1次事件。*每分鐘p-mole4-mu/μg蛋白質(zhì)實(shí)施例13：scbv21的表達(dá)模式圖7a、7b和7c分別顯示了在scbv21控制下實(shí)施例5的轉(zhuǎn)基因甘蔗中的莖稈、葉和根部中的gus表達(dá)。全部三種組織中都觀察到染色。圖7a顯示徑向截切的莖稈段的相對(duì)兩半的剖面圖(左)，以及兩個(gè)莖桿段的等軸圖，每一個(gè)圖都包含了一個(gè)削去了葉片的葉節(jié)點(diǎn)(右上)，以及莖稈段的大體上的平視圖和橫截的莖稈斷面圖(右下)。圖7b顯示了來自單個(gè)節(jié)點(diǎn)的兩張葉片和葉鞘。圖7c顯示在基本分生組織附近區(qū)域具最高表達(dá)的單個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的根蘗(shootroot)。此外，我們也觀察了各種細(xì)胞類型中的scbv21的表達(dá)水平。例如，轉(zhuǎn)基因scbv21/gus莖稈的顯微照片(圖8a-8d)顯示貯藏薄壁組織和維管系統(tǒng)的強(qiáng)的染色(使用實(shí)施例9的gus染色方案)。在這些圖像中標(biāo)記出了木質(zhì)部(x)，韌皮部(p)和貯藏薄壁組織(pa)。轉(zhuǎn)基因scbv21/gus莖稈也顯示強(qiáng)的厚壁組織的染色。實(shí)施例14：scbv21中潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的識(shí)別用promoterfinder(通過berkeleydrosophilagenomeproject在fruitfly.org/seq_tools/promoter.html可獲得)分析1816bp的被克隆的scbv啟動(dòng)子序列(seqidno：1)，以識(shí)別潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。promoterfinder預(yù)測了兩個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，tss1(seqidno：1的核苷酸1055-1104)和tss2(seqidno：1的核苷酸1737-1786)。實(shí)施例15：scbv21的缺失突變的生成本實(shí)施例中所有的缺失突變體都由psk-scbv21-eyfp-nos(圖9a；seqidno：19)生成。用于缺失的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)被標(biāo)示在圖譜中。tss1和tss2用水平散列線顯示。用于生成缺失突變的引物的大致位置以實(shí)心箭頭標(biāo)出。引入正向引物(f1和f2；分別是seqidnos：34和35)中的xhoi酶切位點(diǎn)和反向引物(r1和r2；分別是seqidnos：36和37)中的ncoi位點(diǎn)用于克隆目的。缺失突變b是通過從psk-scbv2v-eyfp-nos(圖7a)刪除stui和ncoi位點(diǎn)之間的區(qū)域生成的。首先，用stui和ncoi對(duì)psk-scbv21-eyfp-nos進(jìn)行雙酶切，之后通過klenow反應(yīng)將消化的片段成為平末端。將4964bp的消化的片段從瓊脂糖凝膠中洗脫用于平末端連接。連接銜接點(diǎn)的核苷酸序列通過測序被驗(yàn)證。突變b的質(zhì)粒圖譜如圖9b所示。在圖9b中，scbv21的截掉區(qū)域用黑條標(biāo)示，scbv21的剩余片段用十字形填充圖案顯示。為了生成缺失突變c，使用引物f1(seqidno：34)和r1(seqidno：36)從psk-scbv21-eyfp-nospcr擴(kuò)增stui位點(diǎn)和scbv213’末端之間的區(qū)域(圖9a)。引物r1被設(shè)計(jì)來除去psk-scbv21-eyfp-nos中存在的eyfp起始密碼子和scbv213’末端之間的19個(gè)核苷酸(圖9a)。這段序列來自于pgemt-easy載體的多克隆位點(diǎn)。將805bp的pcr產(chǎn)物(scbv21突變c片段)克隆至pgemt-easy(promega)載體上，突變c片段的核苷酸序列通過測序被驗(yàn)證。xhoi和ncoi雙酶切(其酶切位點(diǎn)分別在突變c片段5’和3’末端旁側(cè))將突變c片段從pgemt-easy載體切下。psk-scbv21-eyfp-nos的xhoi-ncoi片段被突變c片段替換，生成突變c(圖9c)。在圖9c中，scbv21的截掉區(qū)域用黑條標(biāo)示，scbv21的剩余片段用十字形填充圖案顯示。圖譜中也標(biāo)示出了tss1和tss2。為了生成缺失突變d，用引物f2(seqidno:35)和r1(seqidno:36)從psk-scbv21-eyfp-nospcr擴(kuò)增scbv213’端的710bp(圖9a)。該pcr產(chǎn)物(scbv21的突變d片段)被克隆至pgemt-easy載體，且突變d片段的核苷酸序列通過測序驗(yàn)證。通過與制成突變c所使用的相同程序生成突變d。xhoi和ncoi雙酶切(其酶切位點(diǎn)分別在突變d片段5’和3’末端的旁側(cè))將突變d片段從pgemt-easy載體切下。psk-scbv21-eyfp-nos的xhoi-ncoi片段被突變d片段替換，生成突變d(圖9d)。在圖9d中，scbv21的截掉區(qū)域用黑條標(biāo)示，scbv21的剩余片段用十字形填充圖案顯示。圖譜中也標(biāo)示出了tss2。為了生成缺失突變e，用引物f1(seqidno:34)和r2(seqidno:37)從psk-scbv21-eyfp-nospcr擴(kuò)增nt1722至nt2440之間的區(qū)域(圖9a)。該pcr片段(突變e片段)被克隆至pgemt-easy載體，且突變e片段的核苷酸序列通過測序驗(yàn)證。通過與制成突變c和d所使用的相同程序生成突變e。通過xhoi和ncoi雙酶切(其酶切位點(diǎn)在突變e片段5’和3’末端兩者的旁側(cè))將突變e片段從pgemt-easy載體切下。psk-scbv21-eyfp-nos的xhoi-ncoi片段被突變e片段替換，生成突變e(圖9e)。在圖9e中，scbv21的截掉區(qū)域e1和e2用黑條標(biāo)示，scbv21的剩余片段用十字形填充圖案顯示。圖譜中也標(biāo)示出了tss1。為了生成缺失突變f，用引物f2(seqidno:35)和r2(seqidno:37)從psk-scbv21-eyfp-nospcr擴(kuò)增nt1815至nt2440之間的區(qū)域(圖9a)。該pcr片段(突變f片段)被克隆至pgemt-easy載體，且突變f片段的核苷酸序列通過測序驗(yàn)證。通過與制成上述三個(gè)突變，突變c、d和e，所使用的相同程序生成獲得突變f。通過xhoi和ncoi雙酶切(其酶切位點(diǎn)分別在突變f片段5’和3’末端的旁側(cè))將突變f片段從pgemt-easy載體切下。psk-scbv21-eyfp-nos的xhoi-ncoi片段被突變f片段替換，生成突變f(圖9f)。在圖9f中，scbv21的截掉區(qū)域用黑條標(biāo)示，scbv21的剩余片段用十字形填充圖案顯示。實(shí)施例16：甘蔗葉段上的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)用于瞬時(shí)eyfp表達(dá)試驗(yàn)的靶甘蔗葉組織由商業(yè)化甘蔗雜種cp72-1210制備。從生長在田里的甘蔗收獲處于活躍生長期的包含從頂部第一個(gè)2-3個(gè)節(jié)的莖稈頂部部分。去除所有完全展開的葉片直到第一個(gè)肉眼可見的芽點(diǎn)(dewlap)暴露出來，將甘蔗莖尖(sugarcanetop)用10％漂白水消毒20min。將第一個(gè)節(jié)上的最外面2-3層綠葉鞘去除，將接下來的1-2層葉鞘去掉中央葉脈(midrib)后切成10mm×20mm大小的片。將制備好的組織切片正面朝下放在ms固體培養(yǎng)基上在暗處培養(yǎng)3天。之后將每個(gè)組織切片都轉(zhuǎn)移到一塊新的ms培養(yǎng)基上，并用于以按照使用手冊(cè)(bio-rad)制備的包裹著dna的1.1μm鎢粒的粒子轟擊。對(duì)于粒子轟擊，500μg包裹500ngdna的鎢粒被放置在微載體濾膜上，然后，該濾膜被裝在噴嘴的頂端，噴嘴在真空室中釋放110psi的氦氣。ms培養(yǎng)基上的每個(gè)靶組織都放在真空室中微載體濾膜頂端下方7cm。dna包裹的鎢粒以110psi在26英寸汞柱的壓強(qiáng)轟擊到靶組織上。轟擊之后，將靶組織在暗處保持2天。在帶eyfp或者gfp濾光片的熒光顯微鏡下研究eyfp的表達(dá)。結(jié)果在表11和圖11a-11f中示出。表11.轉(zhuǎn)基因甘蔗葉中的eyfp表達(dá)在以scbv21-eypf-nos(未改造)、scbv21δnt1-nt1010-eyfp-nos(缺失c)和scbv21δnt1-nt1104-eyfp-nos(缺失d)轟擊的組織中觀察到黃色熒光蛋白(yfp)，分別如圖11a、圖11c和圖11d所示；在以scbv21δnt1014-nt1837-eyfp-nos(缺失b)、scbv21δnt1-nt1010δnt1732-nt1837-eyfp-nos(缺失e)或scbv21δnt1-nt1104δnt1732-nt1837-eyfp-nos(缺失f)轟擊的組織中觀察到幾乎沒有或沒有yfp，分別如圖11b、圖11e和圖11f所示。實(shí)施例17：在烤煙(nicotianatabacum)葉段中的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)針對(duì)在烤煙中的瞬時(shí)eyfp表達(dá)試驗(yàn)，收集在品紅盒子中生長45天的烤煙葉，并在轟擊前將其正面朝下放在補(bǔ)充有0.1m甘露糖醇和0.2m山梨糖醇的ms培養(yǎng)基上在暗處放置4個(gè)小時(shí)。制備的靶組織用500μg包裹了500ngdna的1.1μm鎢粒以60psi在26英寸汞柱的壓強(qiáng)下轟擊。在將被轟擊的組織在補(bǔ)充有0.1m甘露糖醇和0.2m山梨糖醇的ms培養(yǎng)基上在暗處保持約12小時(shí)之后，該靶組織被轉(zhuǎn)移到ms培養(yǎng)基并被保持24小時(shí)。在帶gfp濾光片的熒光顯微鏡下檢查yfp的表達(dá)。結(jié)果總結(jié)在下面的表12中。結(jié)果如表12所示。在以scbv21-eypf-nos(未改造)、scbv21δnt1-nt1010-eyfp-nos(缺失c)和scbv21δnt1-nt1104-eyfp-nos(缺失d)轟擊的組織中觀察到了黃色熒光蛋白(yfp)。在以scbv21δnt1014-nt1837-eyfp-nos(缺失b)、scbv21δnt1-nt1010δnt1732-nt1837-eyfp-nos(缺失e)或scbv21δnt1-nt1104δnt1732-nt1837-eyfp-nos(缺失f)轟擊的組織中觀察到幾乎沒有或沒有yfp。這樣的表達(dá)模式和實(shí)施例16中針對(duì)單子葉植物看到的是一致的。表12.轉(zhuǎn)基因煙草葉中的eyfp表達(dá)實(shí)施例18：牛胃溶菌酶的多啟動(dòng)子表達(dá)甘蔗(甘蔗屬，saccharumspp.)在基于蛋白質(zhì)的治療劑的生產(chǎn)方面具有高的潛力。它具有快的生長周期和有效率的碳固定途徑，產(chǎn)出大量生物質(zhì)，并提供廉價(jià)的生物藥生產(chǎn)前景。本實(shí)施例闡釋開發(fā)甘蔗作為一重組表達(dá)系統(tǒng)，該重組表達(dá)系統(tǒng)用于具有廣譜抗微生物活性、在食品、化妝品和農(nóng)業(yè)中有潛在應(yīng)用的哺乳類動(dòng)物的酶(牛胃溶菌酶)的生產(chǎn)。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性以及翻譯可以使這個(gè)哺乳類動(dòng)物的基因的表達(dá)在甘蔗中被增加。表達(dá)載體使用合成基因生成，所述合成基因經(jīng)密碼子優(yōu)化使其在植株單子葉植物系統(tǒng)中得以表達(dá)(例如seqidno：38)。單啟動(dòng)子和多啟動(dòng)子系統(tǒng)被用于驅(qū)動(dòng)表達(dá)。感染甘蔗的病毒的5’和3’非翻譯區(qū)與基因的編碼區(qū)融合以增強(qiáng)翻譯。兩種商業(yè)化甘蔗品種的胚性愈傷組織和葉卷被用于以生物彈射的方式轉(zhuǎn)化，并使用草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricinacetyltransferasebar)基因作為篩選標(biāo)記。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的甘蔗植株中的免疫印跡分析以及酶活性檢測顯示存在完整的牛胃溶菌酶，在由單啟動(dòng)子載體表達(dá)該牛胃溶菌酶的植株莖稈中，所述牛胃溶菌酶以多達(dá)0.33mg/kg的水平積累，在由三個(gè)不同啟動(dòng)子在各自的載體中共表達(dá)bvlz基因的轉(zhuǎn)基因的莖稈中，所述牛胃溶菌酶以多達(dá)6.0mg/kg的水平積累。每個(gè)載體對(duì)其他載體并沒有不利的影響，如由拷貝數(shù)、穩(wěn)態(tài)的mrna水平以及有功能酶的存在所示。這些結(jié)果提示通過疊加的啟動(dòng)子活性導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄協(xié)同效應(yīng)并且轉(zhuǎn)錄協(xié)同效應(yīng)提高基因表達(dá)。一11個(gè)月時(shí)間段的生長周期的研究顯示，隨著時(shí)間的推移，轉(zhuǎn)基因株系中酶的積累的實(shí)質(zhì)性增加。這項(xiàng)研究提示在轉(zhuǎn)基因甘蔗中生產(chǎn)穩(wěn)定的重組酶并開發(fā)甘蔗成為高價(jià)值蛋白質(zhì)的生物工廠的商業(yè)上可行性。實(shí)施例19：牛胃溶菌酶的單啟動(dòng)子表達(dá)a.甘蔗單啟動(dòng)子bvlz轉(zhuǎn)基因株系生長周期的研究：針對(duì)7個(gè)月、9個(gè)月和11個(gè)月時(shí)間段監(jiān)測轉(zhuǎn)基因株系bvlz活性根據(jù)本實(shí)施例生成若干甘蔗bvlz轉(zhuǎn)基因株系。這些株系代表：(1)在強(qiáng)組成型玉米泛素1啟動(dòng)子(不具有熱激元件(pmubi))的控制下，被轉(zhuǎn)基因以bvlzm(maizebvlz，玉米bvlz)的36個(gè)株系的74棵植株，(2)被轉(zhuǎn)基因以pmubibvlzm和p1hcpro的4個(gè)株系的18棵植株，所述p1hcpro為本實(shí)驗(yàn)室分離出的基因沉默的抑制子(美國專利號(hào)7,001,739)。一共選出15個(gè)bvlz轉(zhuǎn)基因株系用于進(jìn)一步的bvlz活性水平的特征化。為了研究甘蔗中bvlz隨時(shí)間的積累，對(duì)選出的15個(gè)bvlz轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了11個(gè)月溫室生長周期研究，并分別在7個(gè)月、9個(gè)月和11個(gè)月收獲。針對(duì)三次收獲所收獲的莖稈破碎后冷凍運(yùn)輸至texasa&muniversity的bioseparationslaboratory(collegestation)。針對(duì)三次不同收獲從15個(gè)bvlz轉(zhuǎn)基因株系中通過手工壓榨的方法提取汁液，并通過標(biāo)準(zhǔn)濁度試驗(yàn)評(píng)估bvlz。調(diào)整提取液至ph4.0，離心澄清，通過sp-sepharose陽離子交換柱得到bvlz濃縮液。在濃縮后的提取液中測試bvlz的活性。表13列出了針對(duì)在7個(gè)月、9個(gè)月和11個(gè)月收獲的15個(gè)bvlz甘蔗轉(zhuǎn)基因株系bvlz活性(每kg收獲的甘蔗莖(cane)/莖稈中bvlz的mg數(shù))。(在200ml來自7個(gè)月收獲的莖稈提取液以及650-700ml(1kg甘蔗莖/莖稈)來自11個(gè)月收獲的莖稈提取液中檢測bvlz活性)?？偟膩碚f，針對(duì)這15個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，在11個(gè)月收獲時(shí)bvlz的產(chǎn)量有實(shí)質(zhì)性的提高。15個(gè)株系中的9個(gè)顯示其bvlz活性水平的兩倍提高。在7個(gè)月收獲的莖稈中發(fā)現(xiàn)較低水平的bvlz活性。進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)以評(píng)估從當(dāng)前的bvlz轉(zhuǎn)基因株系中bvlz提取和純化的效率。這些實(shí)驗(yàn)包括如下：1.進(jìn)行了在所述柱的流穿組分中的bvlz的western分析，沒有觀察到bvlz的可察覺量。2.還進(jìn)行了在15個(gè)bvlz轉(zhuǎn)基因株系的切碎的莖稈的bvlz的western分析。bvlz活性的數(shù)據(jù)與通過western分析探測得的莖稈中bvlz的水平有非常好的相關(guān)性。用多克隆抗bvlz抗體借助western印記對(duì)來自葉和莖稈中的總可溶蛋白質(zhì)(葉40μg，莖稈2-5μg)進(jìn)行分析。分析來自11個(gè)月收獲的1kg甘蔗莖/莖稈(650-700ml提取液)的bvlz活性。還測定了三個(gè)不同時(shí)期、相同生理年齡(完全伸展的第二葉階段)的葉中的轉(zhuǎn)基因植株的bvlz表達(dá)水平。western分析顯示在7個(gè)月、9個(gè)月和11個(gè)月收獲的葉的bvlz水平?jīng)]有差別。而且，轉(zhuǎn)基因植株葉的bvlz水平與同時(shí)收獲的莖稈的bvlz水平的關(guān)聯(lián)性非常好。表13.通過bvlz活性水平對(duì)甘蔗單啟動(dòng)子bvlz轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行分類b.甘蔗單啟動(dòng)子bvlz轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)為了評(píng)估甘蔗bvlz表達(dá)株系是否會(huì)招致任何生長障礙，在三個(gè)月的時(shí)間段里每兩周對(duì)葉和莖稈的高度以及分蘗的數(shù)目進(jìn)行測量。甘蔗bvlz轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)的差異獨(dú)立于bvlz的積累之外。對(duì)bvlz轉(zhuǎn)基因株系而言，在葉高度、莖稈高度以及分蘗的數(shù)目方面沒有可觀察到的障礙。bvlz高表達(dá)株系(例如em116和em123)的生長模式并未受到影響。然而，在一些bvlz高表達(dá)株系(例如em116、em123、em112、em114和em96)中，萌發(fā)僅在種下第一周受影響。一些bvlz中等表達(dá)的株系(例如em108、em38和em33)以及bvlz低表達(dá)株系(例如em35)在第一周甚至不萌發(fā)。除了兩個(gè)高表達(dá)株系em112和114以及低表達(dá)株系em35(圖3d)以外，bvlz轉(zhuǎn)基因株系被注意到在種下第二周期間萌發(fā)情況有所好轉(zhuǎn)。但是，所有bvlz表達(dá)株系在種下后的第三周期間都能夠完全萌發(fā)(數(shù)據(jù)未列出)。為了探查甘蔗bvlz轉(zhuǎn)基因株系的光合作用是否受到限制，通過western印跡分析了葉中三種關(guān)鍵的光合作用酶，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco，大亞基/rbcl)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)和丙酮酸磷酸二激酶(ppdk)的水平。用多克隆抗rbcl、抗pepc或抗ppdk抗體對(duì)來自葉提取物總可溶蛋白質(zhì)(40μg)進(jìn)行分析。掃描western印跡并記錄rbcl、ppdk和ppdk條帶的凈強(qiáng)度。三種主要光合作用酶的水平并沒有受到轉(zhuǎn)基因株系bvlz表達(dá)水平的影響。高、中和低bvlz表達(dá)株系表現(xiàn)良好的rbcl、pepc和ppdk水平，該水平與未轉(zhuǎn)化植株的水平具有可比性。在大多數(shù)bvlz轉(zhuǎn)基因株系中，rbcl、pepc和ppdk掃描條帶的凈強(qiáng)度都是高的。每種光合作用酶的強(qiáng)度水平都與不同株系的bvlz表達(dá)水平具有非常好的相關(guān)性。實(shí)施例20：牛胃溶菌酶的多啟動(dòng)子表達(dá)在植物細(xì)胞中特定異源基因/轉(zhuǎn)基因的表達(dá)以及接下來其蛋白質(zhì)的生產(chǎn)受到幾個(gè)因素的影響。這些因素包括：(1)轉(zhuǎn)錄的因素，例如轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)以及啟動(dòng)子的活性。無論是組成型、組織特異性(在甘蔗的情形中即莖特異性)或是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，對(duì)特定的生長和發(fā)育階段或是在特殊的組織中，在控制異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方面都起著至關(guān)重要的作用。在甘蔗中組成型表達(dá)的兩個(gè)啟動(dòng)子psprp和psef1α是在我們的實(shí)驗(yàn)室中被分離出來的；這兩個(gè)啟動(dòng)子來自于一甘蔗富含脯氨酸蛋白(sprp)和一延伸因子1α(sef1α)。兩個(gè)莖表達(dá)和應(yīng)激誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，pjas和pomt，也被分離出來；這兩個(gè)啟動(dòng)子分別來自于甘蔗受茉莉酸酯誘導(dǎo)的蛋白(或引導(dǎo)蛋白)(jas)和o-甲基轉(zhuǎn)移酶(omt)。psprp、psef1α和pjas，作為單獨(dú)的或者三個(gè)啟動(dòng)子的組合，與來自玉米泛素1的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子pubi(不具有熱激元件)(pmubi)一起用于驅(qū)動(dòng)bvlz基因的表達(dá)。(2)轉(zhuǎn)錄后的因素，例如mrna的剪接、mrna的穩(wěn)定性以及翻譯。a.用于翻譯增強(qiáng)作用的非翻譯區(qū)域，例如感染單子葉植物的病毒的5’和3’非翻譯區(qū)域(utr)被融合進(jìn)了bvlz基因。這些區(qū)域包括高粱花葉病毒(sorghummosaicvirus,srmv)的5’和3’utrs。b.轉(zhuǎn)錄后基因沉默(ptgs)的抑制子與bvlz遺傳構(gòu)建體一起用于共轉(zhuǎn)化。這些抑制子包括從高粱花葉病毒中分離出來的pl/hc-pro蛋白，和從柑橘速衰病病毒(citrustristezavirus)中分離出來的ctvp23蛋白。(3)翻譯和翻譯后的因素，例如密碼子的使用、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、修飾、運(yùn)輸(trafficking)以及最終區(qū)室化作用(compartmentalization)。a.新遺傳構(gòu)建體的組裝使用不同的組成型和莖調(diào)控/誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組合來驅(qū)動(dòng)bvlzm基因(按照玉米密碼子使用合成的bvlz)或者bvlzsc基因(按照對(duì)甘蔗特異性的密碼子使用合成的bvlz)的表達(dá)，組裝幾個(gè)遺傳構(gòu)建體。srmv的非翻譯區(qū)域也被融合進(jìn)了bvlz基因以增強(qiáng)翻譯?；虺聊囊种谱右埠蚥vlz基因一起引入甘蔗來減低其沉默。b.甘蔗的轉(zhuǎn)化生物彈射轉(zhuǎn)化：以生物彈射的方式將新的遺傳構(gòu)建體引入甘蔗(經(jīng)由微粒彈射轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移)。盡管用物理手段(即，微粒彈射轟擊)將dna引入細(xì)胞的方法已經(jīng)使作物植株的基因轉(zhuǎn)化領(lǐng)域革命化，但在穩(wěn)定性、整合性以及引入基因的表達(dá)上可能會(huì)被看到有相當(dāng)大的變數(shù)。土壤桿菌屬(agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化：這種轉(zhuǎn)化類型利用農(nóng)桿菌的特性，將一離散的dna段遞送進(jìn)受體基因組。在我們實(shí)驗(yàn)室中，用一包含了玉米泛素1組成型啟動(dòng)子控制下的bvlz基因的二元載體引發(fā)甘蔗農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化的靶植物組織：在我們常規(guī)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中正在被使用的是甘蔗的愈傷組織和葉卷。和當(dāng)前的轉(zhuǎn)化愈傷組織的方法相比，轉(zhuǎn)化葉卷后直接進(jìn)行胚再生以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法已經(jīng)被證明有所改進(jìn)。經(jīng)由愈傷組織培養(yǎng)物的植株再生是耗時(shí)耗力的，并且增加了體細(xì)胞無性系變異(somaclonalvariation)的機(jī)會(huì)。甘蔗品種：商業(yè)化甘蔗品種，cp72-1210，以及其他的一些商業(yè)化品種，例如tcp87-3388、tcp89-3505和tcp99-4454正被用于以新的bvlz構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化。形成超過3000個(gè)新株系，并篩選表達(dá)水平比實(shí)施例19中表達(dá)量最高的株系還要高的株系。表14總結(jié)了用于新的甘蔗轉(zhuǎn)化的新的bvlz構(gòu)建體。表14.用于甘蔗生物彈射轉(zhuǎn)化的bvlz構(gòu)建體在所形成并被針對(duì)其bvlz表達(dá)水平進(jìn)行過分析的bvlz轉(zhuǎn)基因植株中，23個(gè)株系顯示與實(shí)施例19中表達(dá)量最高的株系還要好的表達(dá)水平。這些植株包括pspu(16棵植株)，pspnu(1棵植株)和pspj(6棵植株)的植株，這些植株是bvlz在三啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因植株(在同一株植物中，三個(gè)啟動(dòng)子每個(gè)都驅(qū)動(dòng)了單個(gè)轉(zhuǎn)基因(bvlz)各自拷貝的表達(dá))。pspu指的是針對(duì)bvlz基因、其表達(dá)受三個(gè)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株，所述三個(gè)組成型啟動(dòng)子是：psef1α(針對(duì)蔗糖延伸因子1α的啟動(dòng)子)、psprp(針對(duì)蔗糖富脯氨酸蛋白的啟動(dòng)子)和pmubi(針對(duì)玉米泛素1的啟動(dòng)子)。植株用三個(gè)遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化：psef1αbvlzmsrmv3’、psprpbvlzmsrmv3’和pmubi5’srmvbvlzscsrmv3’。bvlzm指的是合成的bvlz基因，該基因具有針對(duì)玉米優(yōu)化的密碼子，而bvlzsc指的是合成的bvlz基因，該基因具有針對(duì)甘蔗優(yōu)化的密碼子。5’和3’srmv指的是高粱花葉病毒的5’和3’非翻譯區(qū)域(utr)(參見表14)。pspnu指的是針對(duì)bvlz基因、其表達(dá)受三個(gè)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株，所述三個(gè)組成型啟動(dòng)子是：psef1α、沒有5’utr的psprp和pmubi。植株用三個(gè)遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化：psef1αbvlzmsrmv3’、pprp(無5’utr)5’srmvbvlzscsrmv3’和pubibvlzmsrmv3’(參見表14)。pspj指的是針對(duì)bvlz基因、其表達(dá)受兩個(gè)組成型啟動(dòng)子，psef1α和pprp，以及一個(gè)莖調(diào)控啟動(dòng)子pjas(茉莉酸酯誘導(dǎo)蛋白或引導(dǎo)蛋白的啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株。植株用三個(gè)遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化：psef1αbvlzmsrmv3、psprpbvlzmsrmv3’和pjasbvlzmsrmv3’(參見表14)。在新形成的pspu和pspj植株中，基因組dna凝膠印跡分析被用來確定bvlz轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)以及整合事件。在這些植株的基因組中檢測到了多個(gè)條帶，體現(xiàn)bvlz轉(zhuǎn)基因插入有多個(gè)拷貝。dna凝膠印跡分析鑒定了總共5個(gè)獨(dú)立的pspu株系的16棵植株，1個(gè)獨(dú)立的pspnu的1棵植株以及2個(gè)獨(dú)立的pspj株系的6棵植株。首先，通過western印跡分析來評(píng)價(jià)所形成的pspu和pspj植株在葉中的bvlz表達(dá)。使用多克隆抗-bvlz抗體來分析來自26棵轉(zhuǎn)基因甘蔗植株的葉的總可溶蛋白質(zhì)(40μg)。大部分植株顯示比單啟動(dòng)子bvlz植株高的bvlz的表達(dá)水平。通過western分析，在pspu和pspj植株的葉中檢測到的bvlz表達(dá)水平得到在莖稈中bvlz酶活性的支持(表15)。在0.105到0.345kg的約7個(gè)月大的莖稈做了bvlz活性的試驗(yàn)。pspu32e,ppsu19a和pspj10a植株在其莖稈中累積了最高量的bvlz水平?？偟膩碚f，新形成的bvlz轉(zhuǎn)基因株系在其bvlz表達(dá)水平方面顯示高于實(shí)施例19株系的提高。在新的株系中bvlz表達(dá)水平通過使用三啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)bvlz表達(dá)來提高。表15.甘蔗莖稈中的bvlz表達(dá)總而言之，在本實(shí)施例中表達(dá)量最高的株系每千克鮮重具有4.7mg的bvlz，較之于實(shí)施例19中的單啟動(dòng)子高表達(dá)株系，每千克莖稈只具有0.33mg的bvlz。實(shí)施例21：牛胃溶菌酶的表達(dá)：pjsubvlzm植株pjsu三元bvlzm植株：針對(duì)bvlzm、其表達(dá)在三個(gè)啟動(dòng)子控制下被驅(qū)動(dòng)的植株(在同一株植物中用三個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)bvlz表達(dá))。使用兩個(gè)組成型啟動(dòng)子，pseflα(針對(duì)甘蔗延伸因子1α基因的啟動(dòng)子)和pmubi(針對(duì)玉米泛素1基因的啟動(dòng)子)，以及一個(gè)莖調(diào)控啟動(dòng)子pjas(針對(duì)編碼茉莉酸酯誘導(dǎo)蛋白的基因的啟動(dòng)子)。用以下三個(gè)遺傳構(gòu)建體以生物彈射的方式(經(jīng)由微彈射體轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移)轉(zhuǎn)化甘蔗品種tcp98-4454的葉卷：pjasbvlzm/psef1αbvlzmsrmv3’/pmubi(nohse)bvlzmsrmv3’得到的植株通過western印跡分析對(duì)bvlz表達(dá)做試驗(yàn)來確定表達(dá)，并通過southern分析來估計(jì)構(gòu)建體的拷貝數(shù)。觀察到了最少6次獨(dú)立事件。首先，對(duì)新形成的pjsu植株的bvlz水平在甘蔗葉中作出估計(jì)。使用多克隆抗-bvlz抗體對(duì)來自26棵轉(zhuǎn)基因甘蔗植株的葉總可溶蛋白質(zhì)(40μg)進(jìn)行分析。使用實(shí)施例20形成的一棵植株pspu32e作為陽性對(duì)照。該植株是高表達(dá)bvlz植株，其中，bvlzm基因在三個(gè)組成型啟動(dòng)子psef1α、psprp和pmubi的控制之下。在所有被檢測的pjsu的葉中，觀察到強(qiáng)的bvlz表達(dá)。還通過elisa對(duì)新形成的pjsu植株bvlz積累水平在莖稈中進(jìn)行了確定。表16顯示了17棵植株的bvlz的活性，所述bvlz的活性是在7-8個(gè)月生長階段時(shí)作出的分析。表16.通過elisa確定的在一些代表性的甘蔗pjsubvlz轉(zhuǎn)基因株系的莖稈中的bvlz表達(dá)a實(shí)施例20中形成的pspu32c植株被用作正對(duì)照。pspu32c是一棵高表達(dá)bvlz的植株，其中，bvlzm是在三種組成型啟動(dòng)子(psef1α、psprp和pubi)的控制之下的。在新形成的pjsu植株中，southern印跡分析被用來確定bvlz轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)以及整合事件。用hindiii對(duì)20棵bvlz轉(zhuǎn)基因植株的基因組dna(15μg)進(jìn)行消化，然后與全長bvlzcdna雜交。在這些植株的基因組中檢測到了多條bvlz轉(zhuǎn)基因條帶，體現(xiàn)插入了多個(gè)bvlz拷貝。帶型模式揭示了四種獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件的存在。事件1由植株23、27、30和42代表，事件2由植株22代表，事件3由植株24、25、26、28、52、53和54代表，事件4由植株29代表?？偣卜治隽?5棵pjsubvlz高表達(dá)植株，在被分析的植株中，所檢測得到的最高bvlz活性水平是6.0mgbvlz/kg莖稈(約1％tsp)，較之于從pspu32c(實(shí)施例20中描述的參考bvlz植株)得到的平均值2.4mg/kg。因此，bvlz活性有2.5倍提高。實(shí)施例22：牛胃溶菌酶表達(dá)的誘導(dǎo)性防御誘導(dǎo)/應(yīng)激調(diào)控的激素對(duì)增強(qiáng)甘蔗三啟動(dòng)子pjsubvlz的表達(dá)株系的bvlz水平的效果被評(píng)估。具體地，植株被噴涂(或離體培養(yǎng)來自莖桿頂部的葉卷)以應(yīng)激調(diào)控激素茉莉酸(ja)和水楊酸(sa)，所述茉莉酸(ja)和水楊酸(sa)是已知能誘導(dǎo)pubi和pjas啟動(dòng)子，所述pubi和pjas啟動(dòng)子在存在三啟動(dòng)子bvlz甘蔗株系中驅(qū)動(dòng)bvlz表達(dá)。從處理過的植株葉(或離體培養(yǎng)較高的葉卷)提取總可溶蛋白質(zhì)，并通過western分析和酶法試驗(yàn)來檢測其bvlz水平。將來自pjsubvlz53和66的植株的葉卷在補(bǔ)充以sa(5mm)或ja(25mm)的ms(murashigeandskoog)介質(zhì)中培養(yǎng)0、24和40小時(shí)。從每種處理提取總可溶蛋白質(zhì)并且確定每種處理的bvlz表達(dá)和活性水平。三啟動(dòng)子pjsubvlz表達(dá)株系的bvlz活性水平受到應(yīng)激調(diào)控激素sa和ja的誘導(dǎo)。bvlz活性在40小時(shí)(對(duì)于pjsu53為2.4倍，對(duì)于pjsu66為2.0倍)被sa最大程度地誘導(dǎo)，在24小時(shí)(對(duì)于pjsu53為1.5倍，對(duì)于pjsu66為2.7倍)和40小時(shí)(對(duì)于pjsu53為2.6倍，對(duì)于pjsu66為3.9倍)被ja最大程度地誘導(dǎo)。氮施肥對(duì)于增強(qiáng)合作用率并且從而增強(qiáng)存在三啟動(dòng)子的pjsu和pspu最高bvlz表達(dá)株系的生物量的效果也被評(píng)估。對(duì)于具有提高的蛋白質(zhì)含量的高質(zhì)量農(nóng)作物的生產(chǎn)，氮(n)是施肥程序的主要組分。三啟動(dòng)子bvlz表達(dá)植株從播種(seedsetts)起始直至成熟，并且在6個(gè)月時(shí)間里，以低氮水平(每植株1.43g的peters溶液20-20-20；每周兩次)和高氮水平(每植株2.38g的peters溶液20-20-20肥料；每周兩次)被施肥。施肥后2個(gè)月和6個(gè)月時(shí)收集bvlz植株的莖桿，將其切碎，由生物分離實(shí)驗(yàn)室(bioseparationlaboratory)確定所述莖稈的總bvlz產(chǎn)量。被施肥的三啟動(dòng)子bvlz表達(dá)植株的光合作用活性也通過測量葉綠素?zé)晒舛淮_定，所述測量葉綠素?zé)晒鈾z測光系統(tǒng)ii的光化學(xué)效率以及葉的綠度。在施肥后，三啟動(dòng)子bvlz表達(dá)植株對(duì)必需大量營養(yǎng)元素的吸收也被確定(表17)。氮施肥對(duì)于提高甘蔗三啟動(dòng)子bvlz表達(dá)株系的生物量以及bvlz產(chǎn)量是重要的。例如，對(duì)于pspu32c株系(品種cp-72-1210)，與低施肥量相比，具有高施肥量的莖稈生物量和bvlz產(chǎn)量在2個(gè)月和6個(gè)月生長階段分別有6.3倍和2.3倍的提高。此外，與低施肥量相比，高施肥量的pjsu19株系(品種tcp98-4454)的莖稈生物量和bvlz產(chǎn)量在2個(gè)月和6個(gè)月生長階段分別有7.5倍和2.0倍的提高。通過施肥，三啟動(dòng)子bvlz表達(dá)植株的葉綠素?zé)晒獗辉鰪?qiáng)。與低施肥量相比，高施肥量的這些植株的葉綠素?zé)晒獾脑黾颖稊?shù)在1.1-1.5倍的范圍內(nèi)。表17.三啟動(dòng)子bvlz植株對(duì)氮/大量營養(yǎng)元素的吸收如表1所示，與低氮施肥量(lf)相比，伴隨高氮施肥量(hf)的三啟動(dòng)子bvlz表達(dá)株系的葉對(duì)于氮、磷和鎂有更高的吸收。顯然，為提高甘蔗桿和bvlz的產(chǎn)量，氮的吸收以及磷和鎂的吸收都是必要的，因?yàn)樗羞@三種元素之間是互相關(guān)聯(lián)的。實(shí)施例23：牛胃溶菌酶的多啟動(dòng)子表達(dá)四啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的bvlz表達(dá)：分別由四個(gè)不同的啟動(dòng)子(四啟動(dòng)子體系)驅(qū)動(dòng)的bvlz的遺傳構(gòu)建體以生物彈射的方式被引入數(shù)個(gè)甘蔗品種的每個(gè)(表18)。已經(jīng)檢測數(shù)個(gè)幼苗來確認(rèn)bvlz的活性。表18.用于甘蔗四啟動(dòng)子植物的bvlz構(gòu)建體在本工作中，由四種遺傳構(gòu)建體以生物彈射的方式轉(zhuǎn)化外植體(葉卷或愈傷組織)，所述遺傳構(gòu)建體的每個(gè)包含由不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的牛溶菌酶(bvlz)基因。驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子：psef1α是從甘蔗延伸因子1α基因分離的組成型啟動(dòng)子，pprp是從編碼甘蔗富含脯氨酸的蛋白質(zhì)的基因分離的組成型啟動(dòng)子，pscbv是從甘蔗桿狀病毒分離的莖部表達(dá)的啟動(dòng)子，pjas是從甘蔗茉莉酸酯誘導(dǎo)/引導(dǎo)基因分離的莖部表達(dá)的啟動(dòng)子，而pmubi是常用于單子葉植物的組成型啟動(dòng)子，并且衍生自玉米泛素1基因。所表達(dá)的基因：bvlzm指的是合成的bvlz，該bvlz具有對(duì)玉米優(yōu)化的密碼子，而bvlzsc指的是合成的bvlz，該bvlz具有對(duì)甘蔗優(yōu)化的密碼子。轉(zhuǎn)錄終止子：35st指的是源自花椰菜花葉病毒的35srna的35s終止子。nost指的是源自胭脂堿合酶基因(來自農(nóng)桿菌ti質(zhì)粒)的nos終止子。所述nost是轉(zhuǎn)錄終止子。35stnost指的是由35st和nost組成的雙重終止子。最近的研究已經(jīng)證明將35stnost雙重終止子融合在轉(zhuǎn)基因的3’端可以對(duì)減少基因沉默和增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有顯著效果。翻譯增強(qiáng)子：5’和3’srmv指的是高粱花葉病毒蛋白的5’和3’非翻譯區(qū)(utr)。所述5’和3’srmv可以被用來增強(qiáng)翻譯。用于植株轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記：bar指的是bar基因，所述bar基因是用于植株轉(zhuǎn)化的最常使用的篩選標(biāo)記。該基因編碼草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶，所述草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶能夠使雙丙氨膦(bialaphos)或草胺膦酸(phophinothricin)脫毒，所述草胺膦酸是除草劑(例如basta和finale)中的活性成分。bar基因活性的篩選可以通過對(duì)植物噴涂除草劑來容易地并且低成本地達(dá)到。nptii指的是nptii基因，所述nptii基因是最廣泛使用的用于植物轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記之一。其編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(或氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶)，所述新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶通過磷酸化作用使一系列氨基糖苷抗生素(例如遺傳霉素)失活。pjsu指的是被針對(duì)bvlz基因、其表達(dá)受兩個(gè)組成型啟動(dòng)子(psef1α和pmubi)以及莖調(diào)控的啟動(dòng)子pjas驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因甘蔗植株。以三個(gè)遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植株，所述遺傳構(gòu)建體為：pjasbvlzm、psef1αbvlzmsrmv3’和pmubibvlzmsrmv3’。實(shí)施例24：牛胃溶菌酶的多啟動(dòng)子表達(dá)數(shù)個(gè)bvlz的遺傳構(gòu)建體被以生物彈射的方式引入甜高粱和谷高粱(grainsorghum)中(表19)。已經(jīng)檢測數(shù)個(gè)幼苗來確認(rèn)bvlz的活性。表19.用于高粱四啟動(dòng)子植物的bvlz構(gòu)建體pmi指的是大腸桿菌磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(由getubeyene分離，用于本工作的高粱轉(zhuǎn)化)。pmi是用于植物轉(zhuǎn)化的多用途的可選擇的標(biāo)記。其在高粱轉(zhuǎn)化中非常有效。實(shí)施例25：從轉(zhuǎn)基因植株中收獲蛋白質(zhì)通過純化所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)來評(píng)價(jià)實(shí)施例的表達(dá)體系(三啟動(dòng)子的植株)作為生物工廠的潛力。實(shí)驗(yàn)方案調(diào)整自美國申請(qǐng)?zhí)?007/0130655。首先，在中試規(guī)模的squire碾壓機(jī)中不加浸泡的水將所述轉(zhuǎn)基因甘蔗切碎和壓碎一次，而后，加20％重量的水切碎和壓碎兩次以上?；旧?，甘蔗莖桿被壓碎，然后通過squire碾壓機(jī)上的三個(gè)輥以每平方英寸3000磅的壓力按壓。這產(chǎn)生約70％水，15％蔗糖以及10％纖維的混合物。剩余5％混合物由蛋白質(zhì)和其他糖類、鹽和有機(jī)分子組成。隨后，含有高價(jià)值蛋白質(zhì)(bvlz)的汁液被泵入純化滑軌(skid)并通過一組震動(dòng)(自清潔)篩并進(jìn)入槽。該步驟移除了纖維。第一篩是150微米，而第二篩為100微米。調(diào)節(jié)汁液的ph至5.2并補(bǔ)充以1mmedta和0.1％的亞硫酸鈉以防止氧化和酚類物質(zhì)(phenolics)的形成。汁液自所述槽滲透通過0.2微米的交叉流濾膜。該步驟移除除所有不溶固體和高分子量的可溶性固體，例如細(xì)菌、淀粉和葡聚糖。包含糖和高價(jià)值蛋白質(zhì)的滲過物進(jìn)入第二槽，并且在第一槽中的滯留物被丟棄。汁液自第二槽滲透通過0.05微米的膜。該步驟移除分子量高于150,000kd的可溶性分子。具有分子量大于150,000kd的高價(jià)值蛋白質(zhì)被留在第二槽中，并且可以通過下面所描述的hplc(高壓液相色譜)步驟被進(jìn)一步純化。包含糖和小于150,000w的高價(jià)值蛋白質(zhì)(本實(shí)施例中為bvlz)的第二滲過物進(jìn)入第三槽，并且第二槽中的滯留物被丟棄。此時(shí)，我們得到了相對(duì)純凈的樣品，所有高分子量的材料(即，細(xì)菌、淀粉、葡聚糖和高分子量的蛋白質(zhì))從所述樣品中被移除。樣品自第三槽在3kda的膜上被濃縮(約30倍)，并且隨后通過兩個(gè)循環(huán)的高壓液相色譜(hplc)被進(jìn)一步純化。第一循環(huán)使用sp離子交換樹脂，同時(shí)第二循環(huán)使用疏水交互樹脂(hydrophobicinteractionresin)。初步運(yùn)行所生產(chǎn)蛋白質(zhì)。我們已經(jīng)鑒定流出膜的低分子量的物質(zhì)可以被用來在第三槽中濃縮樣品。水、糖類和其他小分子將流動(dòng)通過膜，但高價(jià)值蛋白質(zhì)將在第三槽中被濃縮。這將大大提高h(yuǎn)plc步驟性能。使用不同的初始提取條件(不同的離子交換樹脂/膜、親和性樹脂(affinityresin)和hplc柱)的進(jìn)一步改進(jìn)可以被用來增強(qiáng)性能。第一次運(yùn)行和第二次運(yùn)行的結(jié)果分別在表21和表22中示出。表21.從轉(zhuǎn)基因植株分離的bvlz*代表被裝載在sp柱上的一部分濾液**冷凍干燥前通過活性以及280nm處的光密度移除硫酸銨后獲得表22.從三啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的bvlz轉(zhuǎn)基因植株中提取的bvlz因此，從約500磅三啟動(dòng)子植株中收獲多達(dá)14mg99％純度的bvlz是可能的。實(shí)施例26：牛胃溶菌酶的多啟動(dòng)子表達(dá)如在表23和表24中所示出的，具有一個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子的額外構(gòu)建體被制備并且被用于轉(zhuǎn)化甘蔗品種。表23.具有一個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因bvlz植株表24.具有一個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因bvlz植株表25.用于實(shí)施例的dna構(gòu)建體promubi(nohse):bvlz(m)35stseqidno:39promubi(nohse):bvlz(m)3’srmv35stseqidno:40promubi(nohse):5’srmvbvlz(sc)3’srmv35stseqidno:41promubi(nohse):bvlz(m)35stnostseqidno:42prosprp:bvlz(m)3’srmv35stseqidno:43prosprp(no5’utr):5’srmvbvlz(sc)3’srmv35stseqidno:44prosprp:bvlz(m)35stnostseqidno:45prosef1:bvlz(m)3’srmv35stseqidno:46prosef1:bvlz(m)35stnostseqidno:47projas:bvlz(m)35stseqidno:48projas:bvlz(m)3’srmv35stseqidno:49proscbv21:bvlz(m)35stnostseqidno:50bvlz(m)：具有針對(duì)玉米優(yōu)化的密碼子的合成牛溶菌酶基因。bvlz(sc)：具有針對(duì)甘蔗優(yōu)化的密碼子的合成牛溶菌酶基因。promubi(nohse)：不具有熱激元件的玉米泛素1啟動(dòng)子。所述泛素1啟動(dòng)子是常用于單子葉植物的組成型啟動(dòng)子。promubi(nohse)(no5’utr)：不具有熱激元件和5’非翻譯區(qū)(utr)的玉米泛素1啟動(dòng)子。prosprp：從編碼甘蔗富含脯氨酸的蛋白質(zhì)的基因中分離的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。prosprp(no5’utr)：不具有5’utr的甘蔗富含脯氨酸的蛋白質(zhì)啟動(dòng)子。prosef1a：從編碼甘蔗延伸因子1a蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)室的基因分離的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。projas：從編碼甘蔗茉莉酸酯誘導(dǎo)蛋白的基因分離的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子是在莖部表達(dá)的應(yīng)激誘導(dǎo)啟動(dòng)子。proscbv21：從甘蔗桿狀病毒分離的啟動(dòng)子。5’和3’srmv指的是高粱花葉病毒蛋白的5’和3’非翻譯區(qū)(utrs)。所述5’和3’srmv是用于增強(qiáng)翻譯。35st：衍生自花椰菜花葉病毒的35srna的35s終止子。該終止子是轉(zhuǎn)錄終止子。nost：衍生自農(nóng)桿菌ti質(zhì)粒的胭脂氨酸合酶基因的nos終止子。該終止子是轉(zhuǎn)錄終止子。35stnost：包含35st和nost的雙終止子。最近公布的研究已經(jīng)證明將35stnost雙終止子融合在轉(zhuǎn)基因的3’端將對(duì)于減少基因沉默和增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)有顯著效果。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12