本發(fā)明涉及一種來(lái)源于嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)的糖苷水解酶家族第10家族的木聚糖酶基因及其編碼酶在畢赤酵母中的異源表達(dá)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

內(nèi)切β-1,4-d-木聚糖酶(endo-β-1,4-d-xylanase,ec3.2.1.8)簡(jiǎn)稱木聚糖酶。它是一類以內(nèi)切方式水解木聚糖中的β-1,4糖苷鍵，其水解產(chǎn)物主要是寡糖和少量木糖。在半纖維素類生物資源轉(zhuǎn)化和利用中，木聚糖酶是必不可少的有效生物催化劑。木聚糖酶在食品、飼料、造紙有廣泛的應(yīng)用。然而，自然存在的大多數(shù)木聚糖酶的性質(zhì)往往不能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求，特別是生產(chǎn)中的高溫、耐堿等極端環(huán)境。因此，耐熱木聚糖酶的研究和開發(fā)具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

從嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)中分離的木聚糖酶具有較高的比活性和熱穩(wěn)定性，在70℃條件下保溫8h不影響其酶活性；在生物技術(shù)應(yīng)用中展現(xiàn)出較大吸引力。為了進(jìn)一步改善熱穩(wěn)定性，研究者通過(guò)將其編碼基因在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)或者使用定向突變的技術(shù)改善酶的產(chǎn)量和熱穩(wěn)定性。然而，重組酶在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物熱穩(wěn)定性并未提高。

巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，與現(xiàn)有的其他表達(dá)系統(tǒng)相比，其在表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分泌、翻譯后修飾以及糖基化等方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。翻譯后修飾和糖基化往往會(huì)影響異源表達(dá)酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其生物學(xué)功能，是酶工程領(lǐng)域獲得改良酶產(chǎn)品的重要技術(shù)手段之一。密碼子使用偏好與基因表達(dá)緊密關(guān)聯(lián)，按照密碼子的偏好性，對(duì)外源蛋白編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化可以有效提高外源蛋白的表達(dá)量甚至影響蛋白功能。因此，巴斯德畢赤酵母成為耐熱木聚糖酶異源表達(dá)的優(yōu)良宿主。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于嗜熱子囊菌的耐熱β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因xyna及其重組酶xyna在畢赤酵母中的異源表達(dá)，為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

將源自嗜熱子囊菌的耐熱β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶的基因根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行序列優(yōu)化，優(yōu)化后基因命名為xyna，其核苷酸序列為seqidno:1；編碼的蛋白質(zhì)為xyna，其氨基酸序列為seqidno:2；將該優(yōu)化基因在畢赤酵母gs115中進(jìn)行分泌表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活性測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)分析。

所述的xyna是一種來(lái)源于嗜熱子囊菌thermoascusaurantiacusnbrc9748的耐熱木聚糖酶基因，密碼子優(yōu)化后的基因序列已提交genbank(登錄號(hào)為mf072723)，優(yōu)化后的基因在畢赤酵母中異源表達(dá)，其重組蛋白xyna的熱穩(wěn)定性較好，具有適合于工業(yè)應(yīng)用的理想特性。

本發(fā)明保護(hù)該種耐熱木聚糖酶，其氨基酸序列為seqidno.2所示。

本發(fā)明還保護(hù)該耐熱木聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列為seqidno.1所示。

本發(fā)明亦保護(hù)該耐熱木聚糖酶編碼基因的重組載體和重組菌株。

本發(fā)明還提供制備該種耐熱木聚糖酶的方法，包括以下步驟：

(1)以權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；

(2)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；

(3)分離純化耐熱木聚糖酶。

其中，步驟(1)和(2)所述的宿主細(xì)胞為畢赤酵母gs115細(xì)胞。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供了一種源自嗜熱子囊菌的第10家族耐熱木聚糖酶基因及其重組酶在畢赤酵母的異源表達(dá)。其相應(yīng)的基因?yàn)閤yna；重組酶xyna的表觀分子量為75kda；重組酶發(fā)酵粗酶活為40u/ml；分子篩層析后的純酶比活為1053u/ml；xyna的最適反應(yīng)溫度為75℃；在100℃下保溫3h，殘余酶活為86.5％，表明該酶的熱穩(wěn)定性較好。xyna的最適ph為8.0，在ph4.0～10.0范圍內(nèi)較為穩(wěn)定；金屬離子對(duì)該酶活性影響較小。本發(fā)明為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為其它耐熱木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，以下實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明而非對(duì)其加以限定。

實(shí)施例1重組質(zhì)粒pgem-t-xyna的構(gòu)建

為實(shí)現(xiàn)來(lái)源于嗜熱子囊菌的耐熱木聚糖酶基因xyna在畢赤酵母中的高效表達(dá)，對(duì)基因序列進(jìn)行畢赤酵母密碼子優(yōu)化，將其命名為xyna。在其基因兩端分別加入ecori和noti限制性酶切位點(diǎn)，經(jīng)人工合成后克隆至pgem-t質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e.colixl10-gold感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，獲得重組質(zhì)粒pgem-t-xyna。

實(shí)施例2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述得到的重組質(zhì)粒pgem-t-xyna進(jìn)行ecori和noti雙酶切，割膠回收目的基因xyna，與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pgapzαa連接，轉(zhuǎn)化e.colixl10-gold感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)pcr篩選鑒定后送上海生工測(cè)序，獲得重組質(zhì)粒pgapzαa-xyna。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pgapzαa-xyna進(jìn)行sali線性化處理，再經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入畢赤酵母gs115感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化子涂布于含博萊霉素的ypd平板，經(jīng)pcr篩選出高拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為rx8。

實(shí)施例3重組木聚糖酶的表達(dá)與純化

將rx8接種于5mlypd培養(yǎng)基中，于30℃，250rpm/min振蕩培養(yǎng)12h。以1％的接種量轉(zhuǎn)接于100mlypd培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)96h。發(fā)酵液離心后的上清液為粗酶液，使用分子篩層析的方法純化該酶。

實(shí)施例4重組木聚糖酶xyna酶學(xué)屬性測(cè)定

1.酶活與分子量

木聚糖酶酶活測(cè)定采用dns法。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，一個(gè)酶活性單位(u)定義為每分鐘產(chǎn)生1μm還原糖所需的酶量。結(jié)果顯示，dns法測(cè)定粗酶液的木聚糖酶活性為40u/ml。使用分子篩層析的方法純化該酶，重組酶的比酶活為1053u/mg。

sds-page分析顯示重組酶的表觀分子量為75kda。

2.酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

取適當(dāng)重組酶稀釋液于不同溫度下(30～100℃)測(cè)定酶活性，以酶活力最高者為100％，獲得重組酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液置于不同溫度下保溫0～4h，參照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定殘余酶活，未處理酶液的酶活力為100％。當(dāng)殘余酶活達(dá)到85％以上，定義為穩(wěn)定。結(jié)果顯示，該酶的最適反應(yīng)溫度為75℃，在100℃處理3h后，殘余酶活性為86.5％。

3.酶的最適ph與ph穩(wěn)定性

在最適溫度下，測(cè)定不同ph值(ph3.0～ph11.0)條件下木聚糖酶的酶活性。以酶活力最高者為100％，繪制ph-相對(duì)酶活性曲線，獲得最適ph。將粗酶液在不同的ph值，在75℃中保溫4h，測(cè)定殘余酶活性，以未處理酶液的酶活性為100％。當(dāng)殘余酶活達(dá)到85％以上，即定義為穩(wěn)定。結(jié)果顯示，重組木聚糖酶的最適ph為8.0，在ph4.0～10.0的范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。

4.金屬離子對(duì)酶活性的影響

將酶液與不同金屬離子溶液混合，終濃度為5mm，30℃，保溫1h，參照常規(guī)方法測(cè)定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性定義為100％。結(jié)果顯示，金屬離子對(duì)該酶的活性影響較小。

以上所述實(shí)施方式僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。

<110>安徽醫(yī)科大學(xué)

<120>一種耐熱木聚糖酶及其編碼基因

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