本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及來(lái)氟米特的新用途，具體涉及來(lái)氟米特的藥物組合物及其在治療膽石癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：來(lái)氟米特特是一個(gè)具有抗增殖活性的異唑類免疫調(diào)節(jié)劑，其作用機(jī)理主要是抑制二氫乳清酸脫氫酶的活性，從而影響活化淋巴細(xì)胞的嘧啶合成。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)氟米特的藥物組合物，該藥物組合物中含有來(lái)氟米特和一種天然產(chǎn)物，來(lái)氟米特和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療膽石癥。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(Ⅰ)，一種來(lái)氟米特的藥物組合物，包括來(lái)氟米特、如權(quán)利要求1所述的化合物(Ⅰ)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤(rùn)滑劑。進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。上述化合物(Ⅰ)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將海風(fēng)藤粉碎，用80～90％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用30％乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用85％乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集85％洗脫液，減壓濃縮得85％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中85％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88％的甲醇水溶液等度洗脫，收集13～16個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)。進(jìn)一步地，化合物(Ⅰ)的制備方法中，步驟(a)用85％乙醇熱回流提取，合并提取液。進(jìn)一步地，化合物(Ⅰ)的制備方法中，所述大孔樹(shù)脂為D101型大孔吸附樹(shù)脂。進(jìn)一步地，化合物(Ⅰ)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到二氯甲烷萃取物。上述化合物(Ⅰ)在制備治療膽石癥的藥物中的應(yīng)用。上述來(lái)氟米特的藥物組合物在制備治療膽石癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的來(lái)氟米特的藥物組合物中含有來(lái)氟米特和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，來(lái)氟米特、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)膽石癥具有治療作用；來(lái)氟米特和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)膽石癥的治療效果顯著提高，可開(kāi)發(fā)成治療膽石癥的藥物。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。實(shí)施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。分離方法：(a)將海風(fēng)藤(2kg)粉碎，用85％乙醇熱回流提取(15L×3次)，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹(shù)脂除雜，先用30％乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用85％乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集85％洗脫液，減壓濃縮得85％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中85％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1(12個(gè)柱體積)、50:1(10個(gè)柱體積)、25:1(8個(gè)柱體積)和12:1(8個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1(6個(gè)柱體積)、12:1(8個(gè)柱體積)和2:1(6個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88％的甲醇水溶液等度洗脫，收集13～16個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(HPLC歸一化純度大于98％)。結(jié)構(gòu)確證：HR-ESI-MS顯示[M+Na]+為m/z253.1582，結(jié)合核磁特征可得分子式為C15H18O2，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δH(ppm，CD3OD，500MHz)：H-1α(2.32，m)，H-2(1.74，m，2H)，H-3α(1.78，m)，H-3β(2.01，m)，H-5(2.12，m)，H-6α(2.63，m)，H-6β(2.65，t，J＝12.7Hz)，H-8(5.15，m)，H-9α(1.96，dd，J＝13.2，6.2Hz)，H-9β(2.47，dd，J＝13.3，10.9Hz)，H-13(1.76，s)，H-14a(4.54，s)，H-14b(4.59，s)，H-15a(5.02，s)，H-15a(5.06，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δC(ppm，CD3OD，125MHz)：52.5(CH，1-C)，26.5(CH2，2-C)，41.2(CH2，3-C)，146.9(C，4-C)，53.2(CH，5-C)，25.5(CH2，6-C)，167.1(C，7-C)，83.5(CH，8-C)，49.2(CH2，9-C)，152.2(C，10-C)，123.2(C，11-C)，176.5(C，12-C)，8.2(CH3，13-C)，113.2(CH2，14-C)，111.5(CH2，15-C)。紅外光譜表明該化合物含有內(nèi)酯羰基(1736cm-1)結(jié)構(gòu)。氫譜和碳譜顯示該化合物含有一個(gè)α,β-不飽和γ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)[[δH5.15(1H，m，H-8)；δC167.1(C-7)，83.5(C-8)，123.2(C-11)，176.5(C-12)]，一個(gè)乙烯基甲基[δH1.76(3H，s，H-13)；δC8.2(C-13)]以及兩組環(huán)外亞甲基質(zhì)子信號(hào)[δH5.02(1H，s，H-15a)和5.06(1H，s，H-15b)；δC111.5(C-15)和152.2(C-10)；以及δH4.54(1H，s，H-14a)和4.59(1H，s，H-14b)；δC113.2(C-14)和146.9(C-4)]。結(jié)合核磁數(shù)據(jù)信息以及高分辨質(zhì)譜信息可以看出這個(gè)化合物是典型的愈創(chuàng)木烷型倍半萜內(nèi)酯類化合物。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，該化合物和已知化合物zedoalactoneA具有相似的結(jié)構(gòu)，通過(guò)和該化合物進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，新化合物中多了兩組雙鍵碳信號(hào)。對(duì)該化合物的HMBC譜的解析中發(fā)現(xiàn)，H-14a/C-4，H-14a/C-5，H-14b/C-3的相關(guān)性說(shuō)明C-4和C-14位為雙鍵。同時(shí)，H-15a/C-1，H-15b/C-10，H-15b/C-9以及H-15b/C-1之間的相關(guān)性說(shuō)明C-10和C-15之間存在另一個(gè)雙鍵。ROESY譜中，H-1/H-9α，H-9β與H-8以及H-1和H-5的相關(guān)信號(hào)說(shuō)明H-1和H-5為α構(gòu)型，H-8是位于β位的。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：實(shí)施例2：藥理作用本實(shí)施例使用鹽酸林可霉素皮下注射制備膽石癥豚鼠模型，觀察藥物降低膽石癥豚鼠膽囊黏膜TGR5陽(yáng)性表達(dá)率，減少膽石形成等方面的抗膽石癥作用。1、材料與方法1.1動(dòng)物豚鼠，雌性，350～450g，由衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2試劑與樣品來(lái)氟米特購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所?；衔?Ⅰ)自制，制備方法見(jiàn)實(shí)施例1。1.3儀器一抗RabbitPolyelonaltoGPCRTGR5(ab72608)(美國(guó)Abcam)和二抗，購(gòu)自Abcam和北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；OlympusDp72圖像采集分析儀(日本Olympus公司生產(chǎn))。1.4豚鼠分組及模型制備豚鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、來(lái)氟米特組(80mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)組(80mg·kg-1)、來(lái)氟米特與化合物(Ⅰ)組合物組【40mg·kg-1來(lái)氟米特+40mg·kg-1化合物(Ⅰ)】。除正常對(duì)照組外，其他組均給予鹽酸林可霉素60mg/kg，1次/d，皮下注射，連續(xù)注射4d，停藥2d，再注射3d進(jìn)行造模。正常對(duì)照組給以同等劑量生理鹽水皮下注射。造模成功后按照上述劑量灌胃給藥，1次/d，共8天；模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給以同樣劑量的生理鹽水灌胃。1.5膽囊容積測(cè)定實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)第12天，末次給藥前，禁食24h。末次給藥1h后，將豚鼠以戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，打開(kāi)腹腔，結(jié)扎膽囊管切除膽囊，用空針抽出膽汁，測(cè)量膽囊容積[膽囊容積(μl/g)＝膽汁量(μl)/豚鼠體質(zhì)量(g)]。1.6免疫組化觀察陽(yáng)性細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用Envision法染色。TGR5經(jīng)檸檬酸高溫修復(fù)，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)。取染色良好的豚鼠各組切片在光學(xué)顯微鏡下觀察并照相，顯微鏡下每一張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，以膽囊黏膜上皮細(xì)胞頂膜側(cè)出現(xiàn)棕色或棕褐色的均質(zhì)或顆粒樣物質(zhì)為陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1對(duì)膽石癥模型豚鼠膽囊容積的影響與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組豚鼠膽囊容積明顯增加(P＜0.01)，表明造模效果較好；與模型對(duì)照組比較，來(lái)氟米特與化合物(Ⅰ)組合物組豚鼠膽囊容積顯著減小(P＜0.01)；與模型對(duì)照組比較，來(lái)氟米特組、化合物(Ⅰ)組豚鼠膽囊容積減小(P＜0.05)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。2.2對(duì)膽石癥模型豚鼠膽囊黏膜TGR5陽(yáng)性表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組豚鼠的膽囊黏膜TGR5陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。與模型對(duì)照組比較，來(lái)氟米特與化合物(Ⅰ)組合物組豚鼠的膽囊黏膜TGR5陽(yáng)性表達(dá)明顯減弱(P＜0.01)；與模型對(duì)照組比較，來(lái)氟米特組、化合物(Ⅰ)組豚鼠的膽囊黏膜TGR5陽(yáng)性表達(dá)減弱(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1對(duì)膽石癥模型豚鼠膽囊容積和膽囊黏膜TGR5陽(yáng)性表達(dá)的影響組別膽囊容積(μl/g)陽(yáng)性率(％)正常對(duì)照組0.32±0.070模型對(duì)照組1.13±0.18100來(lái)氟米特組0.78±0.1562化合物(Ⅰ)組0.84±0.1557來(lái)氟米特與化合物(Ⅰ)組合物組0.56±0.1411TGR5(Gpbarl)是一種類似于視紫質(zhì)的跨膜G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體，為7次跨膜脂蛋白，受體胞外結(jié)構(gòu)域(N-末端)識(shí)別胞外信號(hào)分子并與之結(jié)合，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(C-末端)與G蛋白偶聯(lián)。通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)，調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使，從而將胞外信號(hào)跨膜傳遞到胞內(nèi)。TGR5mRNA的蛋白表達(dá)在許多不同的人類組織和嚙齒類動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)，包括鼠膽管上皮細(xì)胞和膽囊上皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)TGR5定位于人體膽囊黏膜上皮細(xì)胞頂膜側(cè)和膽管上皮細(xì)胞原纖毛上，而且GS患者膽囊TGR5的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。TGR5介導(dǎo)尖端鈉依賴性膽鹽運(yùn)輸體(ASBT)促進(jìn)胞外膽汁酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)，使胞內(nèi)的膽汁酸濃度升高，反饋地抑制了肝細(xì)胞中膽汁酸合成關(guān)鍵酶-膽固醇7a一羥化酶(cytochromeP450，family7，subfamilyA，polypeptide1；Cyp7al)，使膽汁酸合成減少而膽固醇增多，排入膽道形成膽固醇過(guò)飽和致石膽汁。來(lái)氟米特、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)膽石癥具有治療作用；來(lái)氟米特和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)膽石癥的治療效果顯著提高，可開(kāi)發(fā)成治療膽石癥的藥物。上述實(shí)施例的作用在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3