本發(fā)明屬于醫(yī)藥合成化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種咪唑并[1,2-a]吡啶化合物及其合成方法和應(yīng)用，所述咪唑并[1,2-a]吡啶化合物作為NEK2抑制劑，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止和凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)和體外均具有良好的抗腫瘤活性。

背景技術(shù)：

世界衛(wèi)生組織及其下屬的癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)2012年發(fā)布研究報(bào)告稱，全球約診斷1400萬例新增癌癥病例。全球的一半新發(fā)癌癥病例發(fā)生在亞洲，其中大部分發(fā)生在中國[http://china.caixin.com/2014-02-08/100636253.html？cx_from＝news.baidu.com]。據(jù)報(bào)告估計(jì)，20年后，全球每年新發(fā)癌癥病例將增長至2200萬例。與此同時(shí)，癌癥致死人數(shù)將從目前每年約820萬人增長至每年約1300萬人。NEKS(NIMA-related kinases)激酶是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，NEKS家族從NEK1到NEK11共11種蛋白激酶，對(duì)細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期調(diào)控起著重要作用，和腫瘤關(guān)系密切。

其中在哺乳動(dòng)物中，NEK2(NIMA-related kinase 2)是最具有特征性和代表性的一員，與NIMA的同源性最高，也是目前認(rèn)為最重要，研究的最多，最深入的一個(gè)。NEK2主要位于中心體上，通過對(duì)底物蛋白的磷酸化作用參與紡錘體形成與分離，從而調(diào)控細(xì)胞周期中G2/M期中心體的分離。在人類蛋白中，NEK2與真菌激酶的聯(lián)系最為密切，作為一種細(xì)胞周期調(diào)控激酶，其表達(dá)與活性在一個(gè)細(xì)胞周期中是受嚴(yán)格控制的。表達(dá)水平G1很低，而S/G2中增加。NEK2在G2期活性增加，通過磷酸化β-catenin，ninein-like protein(Nlp)，中心體NEK2結(jié)合蛋白(centrosomal NEK2asspciated protein 1,C-Nap1)及根絲蛋白(rootletin)致使染色體分離。根據(jù)細(xì)胞分裂周期的不同階段，NEK2可以分布于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中并具有很多其他與細(xì)胞周期相關(guān)的功能。同時(shí)，NEK2的活性還受蛋白質(zhì)磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)的調(diào)節(jié)，然而有趣的是，PP1又是Akt的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。NEK2既參與中心體分離又參與染色質(zhì)凝縮，因此可間接調(diào)節(jié)中心體或直接干擾染色體，從而影響整個(gè)基因組的穩(wěn)定，導(dǎo)致CIN和腫瘤的誘發(fā)、惡化和轉(zhuǎn)移。綜上所述，正常細(xì)胞內(nèi)NEK2的過表達(dá)可產(chǎn)生致瘤的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，在乳腺癌，肺癌，肝癌，前列腺癌，子宮頸癌，胰腺癌等癌癥中，都存在NEK2高表達(dá)現(xiàn)象。

NEK2作為一種細(xì)胞蛋白周期激酶，對(duì)有絲分裂調(diào)控起著重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展惡化及轉(zhuǎn)移是密切相關(guān)的。同時(shí)腫瘤細(xì)胞NEK2過度表達(dá)能顯著增強(qiáng)藥物外排蛋白的活性，進(jìn)而將化療藥物泵出細(xì)胞，產(chǎn)生耐藥性。通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)NEK2的過表達(dá)，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的再生、轉(zhuǎn)移、同時(shí)可以抑制耐藥性的產(chǎn)生，增強(qiáng)藥物治療的敏感性，因此NEK2還可以作為癌癥治療的術(shù)后診斷工具，用來評(píng)估癌癥治療效果和監(jiān)測(cè)腫瘤患者對(duì)治療的反應(yīng)。

總的來說，目前已經(jīng)報(bào)道出來的NEK2小分子抑制劑還比較少，尚未見國際專利，僅見文獻(xiàn)報(bào)道三種骨架結(jié)構(gòu)的NEK2抑制劑[J.Med.Chem.,2010,53,7682-7698；J.Med.Chem.,2011,54,1626-1639；J.Med.Chem.,2012,55,3228-3241；J.Med.Chem.,2011,54,4133-4146]。這些抑制劑細(xì)胞活性很不理想，目前尚無具有體內(nèi)腫瘤抑制效果的抑制劑的報(bào)道。

因此，NEK2作為一種新型抗癌靶標(biāo)，設(shè)計(jì)合成新型抗腫瘤范圍廣、激酶活性及選擇性好，同時(shí)PK、PD數(shù)據(jù)理想，毒副作用小，可以用于臨床前開發(fā)的NEK2小分子抑制劑具有巨大的研究價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，為癌癥的治療提供有效幫助，為開發(fā)具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的癌癥治療藥物打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是，提供一種咪唑并[1,2-a]吡啶化合物，其結(jié)構(gòu)如式(1)所示，

其中，R¹，R²，R³都為氫，或其中一個(gè)為氫時(shí)，另兩個(gè)官能團(tuán)為硝基、氰基、甲基、鹵素等，或其中兩個(gè)為氫時(shí)，另一個(gè)官能團(tuán)為硝基、氰基、甲基、鹵素等；

R⁴為氫或甲基；

R⁵為哌啶環(huán)、烷氧基或含有取代基的雜環(huán)如吡唑環(huán)等；

優(yōu)選地，R¹，R²，R³都為氫，或其中一或兩個(gè)為氫時(shí)，另兩或一個(gè)官能團(tuán)為硝基、氰基、甲基、氟或氯等；

R⁴為氫或甲基；

R⁵為哌啶環(huán)、烷氧基或含有取代基的雜環(huán)如吡唑環(huán)等；如

本發(fā)明所涉及的一種咪唑并[1,2-a]吡啶化合物，所述咪唑并[1,2-a]吡啶化合物含有一個(gè)或多個(gè)手性中心時(shí)，所對(duì)應(yīng)的對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體及消旋體均包含在本發(fā)明內(nèi)。

本發(fā)明包括所涉及的咪唑并[1,2-a]吡啶化合物所對(duì)應(yīng)的各種鹽。

一種咪唑并[1,2-a]吡啶化合物，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示，

式(I)中，R⁶為氫，甲基，或Boc(叔丁氧羰基)；R⁷為氫或甲基；

一種咪唑并[1,2-a]吡啶化合物，其結(jié)構(gòu)如式(II)所示，

式(II)中，R⁸和R⁹為氫或甲基；

一種咪唑并[1,2-a]吡啶化合物，其結(jié)構(gòu)如式(III)所示，

式(III)中，R¹⁰，R¹¹，R¹²都為氫；或其中一個(gè)為氫時(shí)，另兩個(gè)官能團(tuán)為硝基、氰基、甲基、鹵素等；或其中兩個(gè)為氫時(shí)，另一個(gè)官能團(tuán)為硝基、氰基、甲基、鹵素等；

R¹³為氫或甲基；

優(yōu)選地，R¹⁰，R¹¹，R¹²都為氫；或其中一個(gè)為氫時(shí)，另兩個(gè)官能團(tuán)為硝基、氰基、甲基、氟或氯等；或其中兩個(gè)為氫時(shí)，另一個(gè)官能團(tuán)為硝基、氰基、甲基、氟或氯等；

R¹³為氫或甲基。

本發(fā)明還提供了一種通過多次運(yùn)用Mitsunobu reaction、Miyaura boration、Suzuki cross-coupling、Buchwald-Hartwig cross-coupling和SN2反應(yīng)來合成式(1)咪唑并[1,2-a]吡啶化合物的方法。

Mitsunobu reaction涉及到溶劑、溫度、反應(yīng)時(shí)間、催化劑等。此反應(yīng)所用溶劑包括但不限于DCM、THF等，所用催化劑包括但不限于DIAD,DEAD及DBAD。

Miyaura boration發(fā)生涉及到溶劑、堿、催化劑等。此反應(yīng)所用底物包括但不限于三氟甲磺酸酯化合物及鹵代物等。溶劑包括但不限于1，4-dioxane，DMF，DMSO、THF，甲苯等。所用催化劑包括但不限于Pd₂(dba)₃,Pd(PPh₃)₄,Pd(dppf)Cl₂·DCM,PdCl₂(PPh₃)₄。所用堿包括但不限于Na₂CO₃,Ba(OH)₂,K₃PO₄,Cs₂CO₃,K₂CO₃,TlOH,KF,CsF,Bu₄F,NaOH,M+(-O-alkyl)等。

SN2反應(yīng)涉及到溶劑、堿、底物等。所以此反應(yīng)所用底物包括但不限于鹵代物、三氟甲磺酸酯及甲磺酸酯化合物，溶劑包括但不限于DMF，DMSO、乙腈，堿包括但不限于Na₂CO₃,Cs₂CO₃,K₂CO₃,TlOH,NaOH等。

本發(fā)明還提供了將如上所述的式(1)所示的咪唑并[1,2-a]吡啶化合物在體外作為NEK2抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了將如上所述的式(1)所示的咪唑并[1,2-a]吡啶化合物在制備NEK2抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了將如上所述的式(1)所示的咪唑并[1,2-a]吡啶化合物在體外抑制腫瘤細(xì)胞活性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了將如上所述的式(1)所示的咪唑并[1,2-a]吡啶化合物在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停止、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。

其中，所述腫瘤細(xì)胞為胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞。

本發(fā)明如上所述的式(1)所示的咪唑并[1,2-a]吡啶化合物作為NEK2抑制劑，在動(dòng)物體內(nèi)具有明顯的腫瘤抑制效果，且沒有明顯的毒副作用。

本發(fā)明還提供了所述式(1)咪唑并[1,2-a]吡啶化合物作為NEK2抑制劑，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止和凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)和體外均具有良好的抗腫瘤活性。

本發(fā)明還提供了一種式(1)咪唑并[1,2-a]吡啶化合物在調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長中的應(yīng)用。本發(fā)明中，式(1)咪唑并[1,2-a]吡啶化合物為NEK2小分子抑制劑，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤生長，可以作為先導(dǎo)化合物用于抗癌藥物的進(jìn)一步開發(fā)。

本發(fā)明中，腫瘤細(xì)胞包括但不限于胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞。

本發(fā)明研究表明化合物MBM-17(IC₅₀＝3nM)和MBM-55(IC₅₀＝1nM)具有非常高效的NEK2抑制效果，且選擇性好。另外，它們可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止和凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。更為重要的是，其相應(yīng)的琥珀酸鹽MBM-17S(49.5％TGI)和MBM-55S(36.0％TGI)具有明顯的腫瘤抑制效果，且沒有明顯的毒副作用?？偟膩碚f化合物MBM-17和MBM-55是目前已知的NEK2抑制活性最好的化合物，同時(shí)也是唯一具有體內(nèi)抑瘤活性的化合物，因此它們具有良好的腫瘤治療潛力，為后續(xù)候選藥物的開發(fā)提供指導(dǎo)和幫助。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的式(1)咪唑并[1,2-a]吡啶化合物具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤生長的能力。

附圖說明

圖1為MBM-17和MBM-55誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯并且使>4N的細(xì)胞累積；(A)流式細(xì)胞儀檢測(cè)將MBM-17以濃度0.25-1μM作用于HCT-116和MGC-803細(xì)胞24h后的細(xì)胞周期分布情況，僅顯示了代表性的數(shù)據(jù)；(B)將(A)圖中細(xì)胞各個(gè)周期比例進(jìn)行定量。數(shù)值均以三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的Mean±SD表示；(C)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)將MBM-55以濃度0.5μM和1μM作用于HCT-116細(xì)胞24h后的細(xì)胞周期分布情況，代表性的數(shù)據(jù)沒有顯示；(D)將(C)圖中細(xì)胞各個(gè)周期比例進(jìn)行定量，數(shù)值均以三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的Mean±SD表示。

圖2為MBM-17和MBM-55誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(A)MBM-17以濃度0.25-1μM作用于HCT-116和MGC-803細(xì)胞24h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；(B)MBM-55分別以濃度0.5μM和1μM作用于HCT-116細(xì)胞24h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用AnnexinⅤ/PI染色方法利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，凋亡細(xì)胞和定量數(shù)據(jù)均在圖像中顯示，數(shù)值均以三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的Mean±SD表示；***/###P＜0.001,**/##P＜0.01,*/#P＜0.05vs對(duì)照組。

圖3為MBM-17S和MBM-55S的體內(nèi)抗腫瘤活性，HCT-116異種移植瘤裸鼠模型，其中溶劑對(duì)照組，MBM-17S組，MBM-55S組，給予藥物一天兩次，伊立替康組一周兩次，治療21天；(A)腫瘤接種后的瘤體積記錄情況，數(shù)值以Mean±SEM(n＝5)表示。(B)較初始治療時(shí)的體重變化情況，**P＜0.01,*P＜0.05vs-.溶劑對(duì)照組。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容包括但不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

一種咪唑并[1,2-a]吡啶化合物制備方法：

Scheme 1:

首先，化合物2-氨基-4-羥基吡啶2與氯乙醛環(huán)化高收率的得到化合物6，隨后通過Mitsunobu反應(yīng)與N-Boc-4-羥基哌啶反應(yīng)，接著NIS碘化反應(yīng)，TAF脫Boc。4-溴水楊酸化合物11在硫酸催化下和甲醇在回流條件下過夜反應(yīng)生成化合物12甲酯，接著通過Mitsunobu反應(yīng)和SN2反應(yīng)合成芳基醚13，隨后通過Miyaura boration合成芳基硼酸酯14。最后芳基硼酸酯14和碘化物10通過Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)，得到化合物15，在氨解便得到目標(biāo)化合物16。

Scheme 2:

或者也可以通過路線二來合成目標(biāo)化合物，首先12氨解后通過Mitsunobu或SN2反應(yīng)反應(yīng)合成芳基醚18，接著通過Miyaura boration合成芳基硼酸酯19，然后其在與碘代物8反應(yīng)，便可以直接合成目標(biāo)分子。其中，化合物20a在TFA條件下可以脫去Boc保護(hù)基，得到化合物21a。

一種咪唑并[1,2-a]吡啶化合物制備方法:

Scheme 3:

化合物氯乙醛與2-氨基-4溴吡啶關(guān)環(huán)得到化合物23，接著與N-甲基哌嗪通過Buchwald coupling得到24,24隨后與NIS反應(yīng)得到碘代物25。接著碘代物25與芳基硼酸酯14通過Suzuki coupling合成26，氨解便可以得到目標(biāo)分子27；或者碘代物25直接與含有酰胺基的芳基硼酸酯19通過Suzuki coupling一步合成目標(biāo)分子。

一種咪唑并[1,2-a]吡啶化合物制備方法:

Scheme 4:

化合物17首先通過Miyaura boration化合成中間體35，讓后在與一系列溴代物通過SN2反應(yīng)生成芳基醚36。4-溴吡唑37通過SN2反應(yīng)生成38，然后先后通過Miyaura boration、Suzuki coupling及碘化反應(yīng)合成碘化物41，接著再與含有酰胺基的芳基硼酸酯19通過Suzuki coupling一步合成目標(biāo)分子。

實(shí)施例1：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物16的合成

合成路線：

將2-氨基-4-羥基吡啶(4.4g,40.0mmol),溶解在200mL EtOH后，加入氯乙醛(16.5mL,100mmol),攪拌回流過夜。濃縮反應(yīng)液，柱層析得白色固體6咪唑并[1，2-a]吡啶-7-醇，收率88％。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.56(d,J＝8.2Hz,1H),7.93(d,J＝1.7Hz,1H),7.74(d,J＝1.9Hz,1H),7.05-7.01(m,2H).

將咪唑并[1，2-a]吡啶-7-醇(218mg,1.63mmol),N-Boc-4-羥基哌啶(654mg,3.25mmol)and Ph₃P(1.71g,6.52mmol)溶于THF(30mL)，然后將溶于THF(10mL)的DBAD(748mg,3.25mmol)在0℃滴入反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)完全后，加入水淬滅反應(yīng)，真空旋干柱層析得產(chǎn)物7(250mg,48％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.96(d,J＝7.4Hz,1H),7.47(d,J＝1.3Hz,1H),7.42(s,1H),6.88(d,J＝2.3Hz,1H),6.50(dd,J＝7.4,2.4Hz,1H),4.57–4.45(m,1H),3.71(ddd,J＝11.3,6.8,3.8Hz,2H),3.35(ddd,J＝13.4,7.9,3.8Hz,2H),2.04-1.92(m,2H),1.83-1.72(m,2H),1.48(s,9H).

化合物8(6.12g,13.81mmol)，溶解于130mL DCM中，加入15mL TFA室溫?cái)嚢?h。0℃加入100mL 2M的氫氧化鈉水溶液淬滅反應(yīng)，PH此時(shí)為堿性，有白色固體生成，抽濾得到一部分產(chǎn)物。濾出液用DCM萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，濃縮共得白色固體化合物9共4.87克，直接用于下一步反應(yīng)?；衔?(0.53g,14.87mmol)，溶解于18mL DCM及9mL乙醇中，加入37％的甲醛水溶液(37％w/w in water,0.7mL,9.3mmol),AcOH(0.125g,1.85mmol,1.2eq),NaBH(OAc)₃(0.6 6g,1.85mmol,2.0eq),室溫?cái)嚢?h。加入飽和NaHCO₃溶液淬滅反應(yīng)，濃縮除去有機(jī)相后，DCM萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，柱層析得白色固體化合物10，兩步收率57％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.93(d,J＝7.5Hz,1H),7.51(s,1H),6.87(d,J＝2.4Hz,1H),6.62(dd,J＝7.5,2.4Hz,1H),4.41-4.32(m,1H),2.75-2.64(m,2H),2.26–2.24(m,5H),2.12–2.01(m,2H),1.90–1.81(m,2H).HRMS(ESI)m/z calcd for C₁₃H₁₇N₃OI(M+H)⁺358.0416,found358.0427.

2-羥基-4-溴苯甲酸(5.0g,23.1mmol)溶解于20mL無水甲醇中，加入1.7mL硫酸。反應(yīng)液攪拌回流24h。將反應(yīng)液加入冰水，濃縮除去甲醇后，EA萃取，加入飽和NaHCO₃溶液洗滌有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，濃縮共得紅褐色固體2-羥基-4-溴苯甲酸甲酯12共5.31克，直接用于下一步反應(yīng)。

(S)-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙醇(1.25g,6.58mmol),2-羥基-4-溴苯甲酸甲酯(1.97g,8.55mmol),

Ph₃P(2.24g,8.55mmol)溶于40mL DCM，在0℃滴加溶解于10mLDCM的DBAD

(1.97g,8.55mmol)溶液，加完后室溫?cái)嚢杓s5h。加入30mL H₂O淬滅反應(yīng)，DCM萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，柱層析得化合物13b共2.89g。

化合物13b(2.645g,6.58mmol),聯(lián)硼酸頻那醇酯(2.73g,1.5eq),KOAc(1.4g,2.0eq)溶解于20mL

dioxane，加入Pd(dppf)Cl₂.DCM(0.29g,0.05eq)，氬氣保護(hù)90℃攪拌過夜。硅藻土抽濾、濃縮，柱層析得化合物14b共2.74g。收率92.6％。

化合物14b(1.23g，3.44mmol),化合物10(1.86g，4.14mmol,1.2eq),K₂CO₃(0.95g,6.88mmol,2.0eq)溶解于1,4-dioxane/H₂O(4/1,17.6mL)，加入Pd(PPh₃)₄(0.95g，0.826mmol,0.2eq)，氬氣保護(hù)90℃攪拌3h。硅藻土抽濾、濃縮，柱層析得淡黃色固體化合物15，收率56％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.94-7.84(m,2H),7.69(s,1H),7.67(s,1H),7.56(t,J＝7.6Hz,1H),7.43(s,1H),7.39(t,J＝7.6Hz,1H),7.05(d,J＝7.9Hz,1H),6.88(s,1H),6.86(d,J＝1.8Hz,1H),6.39(dd,J＝7.5,2.1Hz,1H),5.81(d,J＝6.1Hz,1H),4.40-4.31(m,1H),3.96(s,3H),2.80-2.62(m,2H),2.30(s,3H),2.26-2.12(m,2H),2.11-2.01(m,2H),1.94-1.79(m,2H),1.73(d,J＝6.1Hz,3H).HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₀H₃₀N₃O₄NaF₃(M+Na)⁺576.2086,found 576.2088.

化合物15b(1.237g，2.236mmol)溶解在13mL 7M氨甲醇溶液于一封管中，90℃攪拌4d。旋干柱層析得白色固體16b共0.955g，收率80％。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ7.95(d,J＝8.1Hz,1H),7.71(m,2H),7.66(d,J＝7.6Hz,1H),7.56(t,J＝7.6Hz,1H),7.46(t,J＝7.6Hz,1H),7.32(s,1H),7.06(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),6.97(d,J＝2.3Hz,1H),6.78(d,J＝1.1Hz,1H),6.62(d,J＝6.1Hz,1H),5.83(q,J＝6.0Hz,1H),4.88(m,1H),3.53(m,2H),3.41(m,2H),2.96(s,3H),2.32(m,2H),2.15(m,2H),1.73(d,J＝6.2Hz,3H).HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₉H₂₉N₄O₃Na F₃(M+Na)⁺561.2089,found 561.2082.

實(shí)施例2：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物21的合成

將4-溴-2-羥基苯甲酸甲酯(4.6g)溶解在異丙醇(20mL)中，然后加入氨水(40mL)，50℃反應(yīng)5h后旋干得到粗產(chǎn)物4-溴-2-羥基苯甲酰胺直接用于下一步反應(yīng)。

將4-溴-2-羥基苯甲酰胺(8.64g,40.0mmol)溶解于DMF(80mL)中，然后加入2-(三氟甲基)芐溴(11.5g,1.2eq)和K₂CO₃(6.08g,1.1eq),然后50℃反應(yīng)6h。待反應(yīng)完全后加入EA(500mL)稀釋,用水洗(2 250mL),飽和食鹽水洗(150mL),Na₂SO₄干燥后濃縮旋干，柱層析EA:PE＝1:10得化合物18c(12.4g,82.9％).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.09(d,J＝8.4Hz,1H),7.77(d,J＝7.8Hz,1H),7.62(t,J＝6.1Hz,2H),7.53(dt,J＝8.3,4.2Hz,1H),7.40(s,1H),7.31–7.23(m,1H),7.18(d,J＝1.2Hz,1H),5.97(s,1H),5.37(s,2H).

化合物18c(2.9g)溶解在1,4-dioxane(30mL)后加入聯(lián)硼酸頻那醇酯(2.95g,1.5eq),Pd(dppf)Cl2·DCM(316.4mg,5％)和KOAc(1.52g,2.0eq).然后用氮?dú)庵脫Q氣體，90℃反應(yīng)過夜.硅藻土抽濾后旋干濾液，柱層析(1-2％MeOH/DCM)純化得到化合物19c(2.61g,80.1％).¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.86(d,J＝7.7Hz,1H),7.82(d,J＝7.8Hz,1H),7.74(t,J＝7.7Hz,2H),7.62(d,J＝7.6Hz,1H),7.54(s,1H),7.51(s,1H),7.37(d,J＝7.9Hz,2H),5.38(s,2H),1.30(s,12H).

化合物8(133.0mg,0.30mmol)和19c(127.2mg,0.36mmol，1.2eq)溶于DMF/H₂O(10/1，3.3mL)中，加入K₂CO₃(82.9mg,0.6mmol 2.0eq)和Pd(PPh₃)₄(34.7mg,0.03mmol 0.10eq)，然后80℃反應(yīng)10h.硅藻土抽濾后旋干濾液，柱層析(2-10％MeOH/DCM)得到化合物20.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.34(d,J＝8.1Hz,1H),8.03(d,J＝7.5Hz,1H),7.78(d,J＝7.8Hz,1H),7.71–7.60(m,3H),7.58(s,1H),7.52(t,J＝7.5Hz,1H),7.28(dd,J＝6.3,1.6Hz,1H),7.07(s,1H),6.94(d,J＝1.9Hz,1H),6.58–6.48(m,1H),6.52(dd,J＝7.5,2.3Hz,1H),6.15(s,1H),5.48(s,2H),4.60–4.47(m,1H),3.85–3.66(m,2H),3.49–3.26(m,2H),2.17(s,1H),2.08–1.93(m,2H),1.90–1.73(m,2H),1.48(s,9H).RMS(ESI)m/z calcd for C₃₂H₃₄N₄O₅F₃(M+H)⁺611.2481,found 611.2457.

化合物20(51.0mg,0.084mmol)溶于DCM(4mL)中加入TFA(0.5mL),然后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過于。濃縮旋干得粗產(chǎn)物用DCM、PE及MeOH打漿得灰白色固體21，收率60％。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.58(d,J＝7.5Hz,1H),8.16(d,J＝7.9Hz,1H),8.04(s,1H),7.86–7.79(m,2H),7.72(t,J＝7.5Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),7.57–7.38(m,3H),7.18(d,J＝7.8Hz,1H),5.56(s,2H),3.56–3.41(m,2H),3.33(s,2H),2.41–2.27(m,2H),2.24–2.09(m,2H).HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₇H₂₆N₄O₃F₃(M+H)⁺511.1957,found 511.1947.

實(shí)施例3：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物的20d合成

將碘化物10(71.4mg,0.20mmol)和硼酸酯19d(106mg,0.30mmol，1.5eq)溶解在DMF/H₂O(10/1，2.2mL)中后，加入K₂CO₃(55.3mg,0.40mmol 2.0eq)和Pd(PPh₃)₄(23.1mg,0.02mmol 0.10eq),然后80℃反應(yīng)12h.硅藻土抽濾后旋干濾液，柱層析(2-10％MeOH/DCM)純化得到化合物20d(75mg，78％).¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.35(s,1H),7.94(d,J＝7.6Hz,1H),7.79(s,1H),7.66(s,1H),7.59(s,1H),7.53(d,J＝6.5Hz,2H),7.48–7.32(m,4H),7.31–7.19(m,2H),6.74(s,1H),5.40(s,2H),4.85(s,1H),3.28–3.06(m,4H),2.85(s,3H),2.30–1.87(m,4H).HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₇H₂₉N₄O₃(M+H)⁺457.2240,found 457.2222.

實(shí)施例4：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物16c的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物16c的合成同21,(20％yield)。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.25(t,J＝10.0Hz,1H),8.10(d,J＝8.1Hz,1H),7.79(t,J＝7.6Hz,1H),7.68(t,J＝7.6Hz,1H),7.64–7.53(m,2H),7.33(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.24(d,J＝1.0Hz,1H),6.99(d,J＝1.8Hz,1H),6.69(dd,J＝7.6,2.1Hz,1H),5.56(s,2H),4.67–4.53(m,1H),3.22–3.07(m,1H),3.05–2.88(m,1H),2.67(s,3H),2.30–2.13(m,2H),2.09–1.93(m,1H).

實(shí)施例5：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物27b的合成

合成路線：

化合物2-氨基-4-溴吡啶22(5.0g)和2-氯乙醛(40percent wt aqueous solution,12mL,2.5eq)溶于無水乙醇(50mL)中，加入NaHCO₃(4.89g,2.0eq)后，回流反應(yīng)6h。硅藻土抽濾，真空旋干有機(jī)溶劑后，加入EA(60mL)稀釋，水洗，飽和食鹽水水，Na₂SO₄干燥后旋干柱層析得棕色固體23(4.38g,78％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.99(d,J＝7.1Hz,1H),7.81(s,1H),7.59(s,1H),7.56(s,1H),6.88(dd,J＝7.2,1.6Hz,1H).

將化合物7-溴咪唑并[1,2-a]吡啶23(487.9mg,1.0eq),N-甲基哌嗪(0.83mL,3.0eq),Pd₂(dba)₃(45.8mg,2％),Xantphos(86.8mg,6％)和t-BuONa(0.36g,1.5eq)溶于甲苯(3.5mL)中，100℃下反應(yīng)12h。硅藻土抽濾，真空旋干后有機(jī)溶劑后柱層析(1-10％MeOH/DCM)得白色固體24(476mg,88.0％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.88(d,J＝7.5Hz,1H),7.41(d,J＝0.8Hz,1H),7.31(s,1H),6.77(d,J＝1.7Hz,1H),6.56(dd,J＝7.5,2.3Hz,1H),3.21(t,J＝4.8Hz,4H),2.54(t,J＝4.8Hz,4H),2.32(s,3H).

將24(476mg,1.0eq)溶于乙腈(7.0mL)中，加入NIS(495.0mg,1.0eq)后反應(yīng)半小時(shí)。旋干溶劑后柱層析(eluted with MeOH:DCM＝1:100-1:5)得黃色固體25(576mg,75％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.82(d,J＝7.4Hz,1H),7.40(s,1H),6.66-6.69(m,2H),3.20-3.23(m,4H),2.50-2.51(m,4H),2.28(s,3H)。

將化合物25(430mg,1.26mmol)和19c(822mg,1.88mmol，1.5eq)溶于1,4-dioxane/H₂O(4/1,4mL)中，加入Cs₂CO₃(821mg,2.52mmol 2.0eq)和Pd(dppf)Cl2·DCM(34.7mg,0.03mmol 0.10eq)90℃反應(yīng)10h.硅藻土抽濾，真空旋干后有機(jī)溶劑后柱層析(2-10％MeOH/DCM)得白色固體26b(165mg,25％).將化合物26b(150mg)溶于7M氨甲醇溶液(15.0mL)，在封管中90℃反應(yīng)六天.濃縮反應(yīng)液柱層析(1-10％MeOH/DCM)的產(chǎn)物27b(43mg,30％).¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.12(d,J＝7.7Hz,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.71(t,J＝7.8Hz,2H),7.60(t,J＝7.5Hz,1H),7.54–7.44(m,2H),7.24(d,J＝8.1Hz,1H),7.16(s,1H),6.78(d,J＝7.7Hz,1H),6.68(s,1H),5.46(s,2H),3.34–3.24(m,4H),2.62–2.51(m,4H),2.30(s,3H).

實(shí)施例6：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物29a的合成

將化合物25(102.6mg,0.30mmol)和19a(156.9mg,0.36mmol)溶于DMF/H₂O(10/1,3.3mL),然后加入K₂CO₃(82.9mg,0.6mmol)和Pd(PPh₃)₄(34.7mg,0.03mmol)，90℃反應(yīng)10h.硅藻土抽濾，真空旋干有機(jī)溶劑后柱層析(2-10％MeOH/DCM)得白色固體29a(119.3mg,76％).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.29(d,J＝8.2Hz,1H),7.93(d,J＝2.7Hz,1H),7.79(d,J＝7.7Hz,1H),7.72(d,J＝7.7Hz,1H),7.68(d,J＝7.8Hz,1H),7.57(t,J＝7.5Hz,1H),7.43(t,J＝7.7Hz,1H),7.39(s,1H),7.18(dd,J＝8.2,1.5Hz,1H),6.86(d,J＝1.4Hz,1H),6.79(d,J＝2.3Hz,1H),6.51(dd,J＝7.7,2.5Hz,1H),5.97(s,1H,b),5.94(q,J＝6.3Hz,1H),3.27(t,J＝5.2Hz,4H),2.58(t,J＝5.2Hz,4H),2.36(s,3H),1.81(d,J＝6.2Hz,3H).HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₈H₂₉N₅O₂F₃(M+H)⁺524.2273,found 524.2289.

實(shí)施例7：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物29b的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物29b的合成同29a。收率，70％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.33(d,J＝8.1Hz,1H),8.06(d,J＝7.7Hz,1H),7.77(d,J＝7.8Hz,1H),7.69–7.48(m,5H),7.31–7.23(m,2H),7.08(s,1H),6.84(s,1H),6.62(dd,J＝7.7,1.8Hz,1H),5.91(s,1H),5.49(s,2H),3.30(t,J＝4.8Hz,4H),2.59(t,J＝4.8Hz,4H),2.37(s,3H).

實(shí)施例8：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物42b的合成

化合物36的合成：4-溴吡唑(22.0g)溶于DMF(75mL)中，加入K₂CO₃(51.8g,2.5eq)和二甲氨基氯乙烷鹽酸，然后室溫反應(yīng)兩天。加入EA(500mL)稀釋,然后依次用水和飽和食鹽水洗，Na₂SO₄干燥旋干后柱層析(1-20％MeOH/DCM)得36(21.85g,66.5％)。H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.50(s,1H),7.44(s,1H),4.18(t,J＝6.5Hz,2H),2.71(t,J＝6.5Hz,2H),2.25(s,6H).

化合物37的合成：化合物36(2.5g,11.46mmol)溶解在1,4-二氧六環(huán)(12.5mL)中，加入聯(lián)硼酸頻那醇酯(4.37g,1.5eq),Pd(dppf)Cl2·DCM(468mg,5％)和KOAc(2.81g,2.5eq)。反應(yīng)液100℃反應(yīng)12h.硅藻土抽濾，真空旋干后有機(jī)溶劑后的粗產(chǎn)物37共6.7g直接用于下一步反應(yīng)。

化合物37(1.3eq)溶于DMF(169.3mL)中，加入7-溴咪唑并[1,2-a]吡啶(3.48g)，1N Na₂CO₃水溶液(26.64mL)和Pd(dppf)Cl2·DCM(0.05eq),然后反應(yīng)液80℃反應(yīng)過夜.硅藻土抽濾,真空旋干有機(jī)溶劑后柱層析(2-10％MeOH/DCM)得白色固體31(4.88g,72％).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.07(d,J＝7.0Hz,1H),7.81(s,1H),7.80(s,1H),7.66(s,1H),7.59(s,1H),7.52(s,1H),6.92(d,J＝6.9Hz,1H),4.26(t,J＝6.5Hz,2H),2.80(t,J＝6.5Hz,2H),2.29(s,6H).

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物42b的合成同29a,收率67％。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.55(s,1H),8.02–7.95(m,2H),7.79(d,J＝7.4Hz,1H),7.75–7.65(m,2H),7.65–7.58(m,2H),7.58–7.51(m,1H),7.44(s,1H),7.12(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.00(dd,J＝7.2,1.7Hz,1H),6.79(d,J＝1.1Hz,1H),5.84(q,J＝5.4Hz,1H),4.73(t,J＝5.6Hz,2H),3.88(t,J＝5.6Hz,2H),3.08(s,6H),1.76(d,J＝6.0Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ169.27,157.00,147.09,142.16,139.29(s),134.74,133.82,133.50,133.15,131.70,131.05,130.03,128.00,127.55(d,J＝5.9Hz),127.28(d,J＝5.3Hz),126.02,125.36,124.54,123.49,121.95,121.26,114.19,113.91,111.12,74.93,58.21,47.66,44.50,25.10.

實(shí)施例9：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物MBM-17的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物MBM-17的合成同29a,收率67％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.38(d,J＝8.1Hz,1H),8.16(dd,J＝7.2,0.8Hz,1H),7.85(d,J＝5.1Hz,2H),7.75(s,1H),7.73(s,2H),7.50–7.40(m,5H),7.32(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),7.20(d,J＝1.4Hz,1H),6.95(dd,J＝7.2,1.8Hz,1H),5.77(s,1H),5.30(s,2H),4.28(t,J＝6.3Hz,2H),2.82(t,J＝6.3Hz,2H),2.31(s,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ166.26,157.46,147.42,136.84,135.28,134.32,134.00,133.76,129.93,129.16,128.86,127.74,127.12,124.50,123.44,120.71,120.30,119.95,112.34,112.16,112.16,111.78,71.40,59.05,50.68,45.65.

實(shí)施例10：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物44的合成

將化合物35(425mg,1.62mmol)和3-氯芐溴(331.9mg,1.62mmol)溶于丙酮(8mL)中，加入K₂CO₃(425mg,1.78mmol),然后回流反應(yīng)兩天。待反應(yīng)完全后，硅藻土抽濾，旋干濾液得粗產(chǎn)物43白色固體660mg直接用于下一步反應(yīng)。

將碘化物41(76.2mg,0.20mmol)和粗產(chǎn)物43(154.7mg,0.40mmol 2.0eq)溶于DMF/H₂O(10/1,2.2mL)后，加入K₂CO₃(55.3mg,0.40mmol 2.0eq)和Pd(PPh₃)₄(46.2mg,0.044mmol 0.20eq)，然后80℃反應(yīng)12h.待反應(yīng)完全后，硅藻土抽濾，旋干濾液柱層析(2-10％MeOH/DCM得白色固體產(chǎn)物44(62mg,60.2％)。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.49(s,1H),8.43(d,J＝7.1Hz,1H),8.23(s,1H),7.93(d,J＝7.5Hz,2H),7.85(s,1H),7.71(s,1H),7.64(s,2H),7.56–7.40(m,4H),7.35(d,J＝7.9Hz,1H),7.21(d,J＝6.9Hz,1H),5.42(s,2H),4.54(t,J＝5.8Hz,2H),2.76(s,6H),2.50(s,2H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.09,156.17,146.58,139.17,137.49,133.81,133.29,132.42,131.65,130.58,129.30,128.83,128.04,127.41,126.20,124.51,124.17,122.57,120.30,119.27,111.73,11.64,110.96,69.06,56.11,46.71,43.13.HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₈H₂₈N₆O₂Cl(M+H)⁺515.1962,found 515.1944.

實(shí)施例11：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物MBM-55的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物MBM-55的合成同29a,收率72％.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.60(s,1H),8.52(s,1H),8.48(d,J＝7.2Hz,1H),8.27(s,1H),8.04–7.90(m,2H),7.87(s,1H),7.69(s,1H),7.64(s,1H),7.58–7.47(m,1H),7.44–7.32(m,3H),7.23(d,J＝5.7Hz,2H),5.43(s,2H),4.58(t,J＝6.1Hz,2H),3.61(t,J＝6.1Hz,2H),2.83(s,6H).¹⁹F NMR(376MHz,DMSO)δ-112.71(dd,J＝15.6,9.2Hz).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.07,162.24(d,J＝243.9Hz),156.18,146.41,139.52(d,J＝7.6Hz),137.66,133.57,132.30,131.58,130.70(d,J＝8.2Hz),129.41,128.98,124.67,124.23,123.59(d,J＝2.4Hz),122.68,120.33,119.27,114.89(d,J＝20.9Hz),114.33(d,J＝22.0Hz),111.74,111.66,110.86,69.13,55.77,46.35,42.87.HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₈H₂₈N₆O₂F(M+H)⁺499.2258,found 499.2278.

實(shí)施例12：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物42f的合成

咪唑并[1，2-a]吡啶化合物42f的合成同29a,收率66％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.56(d,J＝7.2Hz,1H),8.43(s,1H),8.13(s,1H),7.97(d,J＝8.0Hz,1H),7.90(s,1H),7.86(s,1H),7.68–7.64(m,1H),7.61(s,1H),7.56(s,1H),7.52(s,1H),7.49–7.44(m,1H),7.41–7.36(m,1H),7.34–7.27(m,2H),7.24(dd,J＝7.4,1.7Hz,1H),5.47(s,2H),4.29(t,J＝6.3Hz,2H),2.86(t,J＝6.1Hz,2H),2.30(s,6H).¹⁹F NMR(376MHz,DMSO)δ-117.84(s),-118.35(s).HRMS(ESI)m/z calcd forC28H28N6O2F C₂₈H₂₈N₆O₂F(M+H)⁺499.2258,found 499.2252.

實(shí)施例13：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物42d的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物42d的合成同29a,收率55％。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.36(d,J＝7.2Hz,1H),8.24(s,1H),8.11(d,J＝8.0Hz,1H),8.00(s,1H),7.89(s,1H),7.83(d,J＝7.5Hz,1H),7.79–7.70(m,3H),7.67(d,J＝7.6Hz,1H),7.41(s,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),7.19(dd,J＝7.2,1.5Hz,1H),5.49(s,2H),4.35(t,J＝6.6Hz,2H),2.90(t,J＝6.6Hz,2H),2.34(s,6H).¹⁹F NMR(376MHz,MeOD)δ-64.02(s).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.13,156.20,146.78,138.17,136.51,133.89,132.55,131.61(d,J＝4.4Hz),129.72,129.64,129.32(q,J＝31.8Hz),128.29,124.77(q,J＝3.8Hz),124.36,124.21(q,J＝3.9Hz),124.14(d,J＝270.7Hz),124.05,122.69,119.66,119.25,111.72,111.60,110.72,69.16,58.31,49.53,44.96.HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₉H₂₈N₆O₂F₃(M+H)⁺549.2226,found 549.2215.

實(shí)施例14：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物42e的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物42e的合成同29a,收率50％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.38(d,J＝8.1Hz,1H),8.05(d,J＝7.2Hz,1H),7.89–7.81(m,2H),7.79–7.68(m,4H),7.65–7.56(m,3H),7.38–7.30(m,1H),7.12(s,1H),6.91(dd,J＝7.2,1.7Hz,1H),5.85(s,1H),5.36(d,J＝9.1Hz,2H),4.29(t,J＝6.5Hz,2H),2.83(t,J＝6.5Hz,2H),2.32(s,6H).¹⁹F NMR(376MHz,CDCl₃)δ-62.58(s).HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₉H₂₈N₆O₂F₃(M+H)⁺549.2226,found 549.2249.

實(shí)施例15：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物45的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物45的合成同44,收率19％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.80–8.67(m,2H),8.38(s,1H),8.31–8.23(m,1H),8.06(s,1H),7.96(d,J＝7.9Hz,1H),7.67–7.57(m,1H),7.55(d,J＝6.7Hz,1H),7.50(d,J＝7.1Hz,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.33–7.23(m,2H),5.38(s,2H),4.64(t,J＝5.9Hz,2H),3.67(t,J＝6.0Hz,2H),2.87(s,6H),2.38(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ165.95,156.50,138.29(s),136.66,134.17,131.48,130.39,130.20,126.25(s),125.97,125.20(s),123.87(s),120.26(s),119.40(s),113.82,112.95,68.96,55.52,46.33,42.76,18.56.HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₉H₃₁N₆O₂(M+H)⁺495.2508,found495.2507.

實(shí)施例16：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物46的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物46的合成同44,收率19％。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.39(d,J＝6.8Hz,1H),8.29(s,1H),8.12(d,J＝7.8Hz,1H),8.07(s,1H),7.77(s,1H),7.62(d,J＝7.7Hz,2H),7.50–7.33(m,3H),7.22(d,J＝7.0Hz,1H),5.52(s,2H),4.53(s,2H),3.27(s,2H),2.77(s,6H).¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ169.44,158.28,148.32,138.72,137.58,134.87,134.51,133.79,133.63,132.58,132.21,131.81,129.97,129.55,129.35,125.53,122.96,122.23,121.29,113.56,113.26,111.92,69.88,58.98,49.71,44.77.HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₈H₂₇N₆O₂Cl₂(M+H)⁺549.1573,found 549.1559.

實(shí)施例17：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物47的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物47的合成同44,收率68％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.48(d,J＝9.0Hz,2H),8.24(s,1H),7.95(s,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),7.86(s,2H),7.74(d,J＝8.2Hz,1H),7.70(s,1H),7.63(s,1H),7.55(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),7.42(s,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),7.21(dd,J＝7.2,1.4Hz,1H),5.42(s,2H),4.55(t,J＝6.1Hz,2H),3.53(t,J＝6.1Hz,2H),2.78(s,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.10,156.02,146.57,137.88,137.51,133.86,132.37,131.57,131.25,130.85,130.60,129.67,129.25,128.84,127.91,124.57,124.15,122.81,120.31,119.30,111.72,111.55,110.98,68.41,56.02,46.63,43.06.HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₈H₂₇N₆O₂Cl₂(M+H)⁺549.1573,found 549.1555.

實(shí)施例18：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物48的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物48的合成同44,,收率74％¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.71(d,J＝6.8Hz,1H),8.66(s,1H),8.37(s,1H),8.16(s,1H),8.04(s,1H),8.01–7.94(m,2H),7.89–7.79(m,2H),7.71–7.57(m,3H),7.54(s,1H),7.51–7.42(m,2H),5.55(s,1H),4.62(t,J＝6.0Hz,2H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),2.94–2.81(m,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ165.88,156.09,139.40,138.12,133.69,133.42,131.70,129.85,129.63,129.40(s),125.85,125.84,123.70,120.44,119.69,117.19,113.22,112.61,110.99,68.39,55.61,46.29,42.81.HRMS(ESI)m/zcalcd for C₂₉H₂₈N₇O₂(M+H)⁺506.2304,found 506.2308.

實(shí)施例19：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物49的合成

咪唑并[1,2-a]吡啶化合物49的合成同44,,收率49％。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.36(dd,J＝20.8,7.1Hz,1H),8.29–8.11(m,2H),8.05(d,J＝8.0Hz,1H),7.98(d,J＝4.2Hz,1H),7.87(d,J＝7.7Hz,1H),7.77(t,J＝7.2Hz,1H),7.72–7.59(m,2H),7.54(d,J＝18.9Hz,1H),7.41–7.27(m,1H),7.16(d,J＝7.0Hz,1H),5.73(s,1H),4.35(t,J＝6.3Hz,2H),2.93(t,J＝6.4Hz,2H),2.37(d,J＝1.5Hz,6H)

實(shí)施例20：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物MBM-17S的合成

將MBM-17(664mg,1.38mmol)溶于DCM(40mL)中，加入溶于10ML丙酮中的丁二酸(326mg,2.76mmol)溶液，室溫?cái)嚢柽^夜，有固體析出，抽濾干燥后的淡黃色固體MBM-17S(858mg,87％).¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.34(d,J＝7.2Hz,1H),8.30(s,1H),8.18(d,J＝8.1Hz,1H),8.09(s,1H),7.80–7.74(m,2H),7.59–7.52(m,2H),7.51–7.41(m,4H),7.40–7.34(m,1H),7.22(dd,J＝7.2,1.6Hz,1H),5.44(s,2H),4.52(t,J＝6.2Hz,2H),3.30(d,J＝6.3Hz,2H),2.66(s,6H),2.57(s,8H).¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ177.27,169.27,158.84,148.27,138.76,137.61,134.85,133.71,132.21,130.02,129.59,128.90,126.34,125.62,122.27,120.97,113.54,111.87,72.21,59.52–58.47,44.61,30.83.HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₈H₂₉N₆(M+H)⁺481.2352,found 481.2364.

實(shí)施例21：咪唑并[1,2-a]吡啶化合物MBM-55S的合成

將MBM-55(696mg,1.40mmol)溶于DCM(100mL)中，加入溶于10ML丙酮中的丁二酸(329mg,2.79mmol)溶液，室溫?cái)嚢柽^夜，有固體析出，抽濾干燥后的淡黃色固體(800mg,78％).¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.35(d,J＝7.1Hz,1H),8.30(s,1H),8.14(d,J＝8.0Hz,1H),8.08(s,1H),7.81–7.73(m,2H),7.52–7.44(m,1H),7.42–7.35(m,3H),7.35–7.29(m,1H),7.22(d,J＝6.9Hz,1H),7.18–7.11(m,1H),5.43(s,2H),4.56(t,J＝6.0Hz,2H),3.39(t,J＝6.0Hz,2H),2.74(s,6H),2.56(s,8H).¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ177.28,169.38,164.51(d,J_C-F＝243.6Hz),158.1,148.18,140.46,138.89,134.76,133.61,132.20,131.88(d,J_C-F＝8.3Hz),130.12,126.30,125.60,124.55,122.71,122.32,121.06,116.23(d,J_C-F＝21.2Hz),115.53(d,J_C-F＝22.3Hz),113.54,111.85,71.29,58.43,44.33,30.78.HRMS(ESI)m/z calcd for C₂₈H₂₈N₆O₂F(M+H)⁺499.2258,found 499.2271.

實(shí)施例22式(1)咪唑并[1,2-a]吡啶化合物的選擇性及體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

本發(fā)明在細(xì)胞水平上的研究表明，式(1)咪唑并[1,2-a]吡啶化合物可作為對(duì)AurA激酶有非常好的選擇性，同時(shí)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有很好的抑制作用。

表1、Nek2抑制劑對(duì)AurA激酶和腫瘤細(xì)胞中的抗癌活性

表2：MBM-55在一系列激酶中的選擇性

表2表明化合物MBM-55對(duì)多種激酶均有很好的選擇性。

實(shí)施例23

圖1和2表明化合物MBM-17和MBM-55可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止和凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞周期分布的影響：

將處于對(duì)數(shù)生長期的MGC-803或HCT-116細(xì)胞種于6孔板，24h后給予相應(yīng)濃度的MBM-17或MBM-55，藥物作用24h后，收細(xì)胞，70％乙醇固定，PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

AnnexinⅤ/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)：

將處于對(duì)數(shù)生長期的MGC-803或HCT-116細(xì)胞種于6孔板，24h后給予相應(yīng)濃度的MBM-17或MBM-55，藥物作用24h后，收細(xì)胞，AnnexinⅤ/PI染色后直接流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

實(shí)施例24：MBM-17S和MBM-55S體內(nèi)調(diào)控腫瘤生長實(shí)驗(yàn)

在HCT-116異種移植瘤模型上進(jìn)行MBM-17S和MBM-55S的體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)選用4～5周齡的雌性裸鼠，在其左前肢腋窩皮下注射HCT-116細(xì)胞懸液。待腫瘤體積達(dá)到100mm³左右時(shí)進(jìn)行隨機(jī)分組，分為4組，分別為溶劑對(duì)照組，MBM-17S組(20mg/kg),MBM-55S組(20mg/kg)，伊立替康組(10mg/kg)每組5只，分組后當(dāng)天給予藥物。其中溶劑對(duì)照組、MBM-17S組和MBM-55S組給藥次數(shù)為一天兩次，伊立替康組為一周兩次。給藥后于每周三次測(cè)量老鼠的瘤體積和體重，共治療觀察21天。

化合物MBM-17和MBM-55的琥珀酸鹽MBM-17S(49.5％TGI)和MBM-55S(36.0％TGI)具有明顯的腫瘤抑制效果，且沒有明顯的毒副作用?？偟膩碚f化合物MBM-17和MBM-55是目前已知的NEK2抑制活性最好的化合物，同時(shí)也是唯一具有體內(nèi)抑瘤活性的化合物，因此它們具有良好的腫瘤治療潛力，為后續(xù)候選藥物的開發(fā)提供指導(dǎo)和幫助。