本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及過氧麥角甾醇在制備治療或預(yù)防流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用，還涉及從板藍(lán)根中分離過氧麥角甾醇的方法。
背景技術(shù)：
：流感病毒(InfluenzaVirus)為包膜RNA病毒，屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，分為A、B、C三型，也稱為甲、乙、丙三型。流感病毒全基因長13.6kb，由8條大小不等的單股負(fù)鏈RNA組成，分別編碼10種結(jié)構(gòu)蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)。流感病毒表面的糖蛋白植物血凝素(HA)與宿主細(xì)胞表面唾液酸受體結(jié)合后介導(dǎo)流感顆粒的內(nèi)吞而建立流感感染。禽流感病毒的糖蛋白植物血凝素(HA)與唾液酸(sialicAcid，SA)a2-3Ga1受體結(jié)合；人流感病毒與SAa2-6Ga1受體結(jié)合。禽流感與人流感對不同受體結(jié)合的差異性導(dǎo)致禽流感病毒難以傳播到人群中。由流感病毒引起的急性上呼吸道傳染性疾病，具有傳染性強(qiáng)、傳播速度迅速、易發(fā)生傳染等特點(diǎn)。自20世紀(jì)以來，流感病毒在全球范圍內(nèi)造成幾次大流行，例如：1918年“西班牙流感”；1957年“亞洲流感”；1968年“香港流感”，每次的大流感在全球的范圍內(nèi)造成巨大的損失。最近在我國東部沿海地區(qū)流行禽流感H7N9，經(jīng)統(tǒng)計(jì)已658例感染和死亡病例221例，死亡率為33.5％。流行性感冒作為一種病毒性傳染病不僅嚴(yán)重威脅著公眾健康，而且給國家和社會(huì)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于流感病毒的抗原變異能力極強(qiáng)且相當(dāng)頻繁，疫苗的研制和生產(chǎn)相對滯后，對于易感人群的保護(hù)率不高。當(dāng)前美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于防治流感的藥物有M2離子通道抑制劑：多金剛烷(Amantadine)、金剛乙胺(Rimantadine)和神經(jīng)氨酸酶抑制劑：奧司他韋(Oseltamivir)、扎那米韋(Zanamivir)，但分別已經(jīng)存在引起流感病毒耐藥株的出現(xiàn)的問題。因此，新的流感大流行隨時(shí)都有可能爆發(fā)。在這種情況下，尋找具有預(yù)防和治療作用的抗流感藥物就顯得尤為重要和緊迫。目前，較多研究表明，流感病毒的感染使得宿主免疫系統(tǒng)過度激活，導(dǎo)致過度炎癥因子的表達(dá)致組織損傷是其主要的致病機(jī)制之一。例如：1918年的西班牙大流感與高致病禽流感H5N1導(dǎo)致的較高的發(fā)病率及病死率與早期募集至肺部炎癥細(xì)胞導(dǎo)致隨后發(fā)生的“炎癥風(fēng)暴”直接相關(guān)。感染09H1N1或者高致病禽流感病毒H5N1、H7N9病例產(chǎn)生嚴(yán)重病毒性肺炎。09H1N1感染病例中高表達(dá)炎癥因子及趨化因子：IP-10、MCP-1和MIP-1。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，流感導(dǎo)致“炎癥因子風(fēng)暴”產(chǎn)生而致機(jī)體免疫損傷，因此，控制宿主機(jī)體合適有效的清除病原免疫應(yīng)答反應(yīng)、防止過激免疫引起的免疫損傷這一環(huán)節(jié)，尋找到有效的調(diào)控宿主炎癥的藥物是十分必要的。流感感染導(dǎo)致肺損傷組織病理學(xué)及臨床特征顯示肺泡上皮細(xì)胞凋亡、壞死、肺泡間隔塌陷及嚴(yán)重的低氧血癥，這與ARDS患者的特征相似。最近研究報(bào)道，在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的進(jìn)展中肺內(nèi)表達(dá)促凋亡配體FasL和TRAIL是誘導(dǎo)肺病理損傷的主要因素。凋亡因子TRAIL主要來源于募集至肺部的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞群體。TRAIL過表達(dá)除了介導(dǎo)流感導(dǎo)致肺損傷外，也會(huì)有利于引起隨后繼發(fā)性細(xì)菌感染。在臨床上現(xiàn)在應(yīng)用的糖皮質(zhì)激素具有抑制免疫應(yīng)答、抗炎等的作用。其應(yīng)用于ARDS患者的治療，能降低炎癥及臨床的癥狀。此外，在慢性炎癥COPD及哮喘中糖皮質(zhì)激素長期應(yīng)用也有較好的效果。糖皮質(zhì)激素也應(yīng)用于流感H1N1感染引起的急性炎癥顯示減少肺損傷及多器官功能衰竭。但，在2009H1N1流感流行應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療卻提高病人的病死率。因此，使用糖皮質(zhì)激素進(jìn)行對流感引起免疫炎癥的治療的療效仍有待評(píng)價(jià)的。板藍(lán)根分為南、北板藍(lán)根，分別為爵床科和十字花科，性寒味苦，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，是臨床十分常用傳統(tǒng)的抗流感病毒中藥。但板藍(lán)根的有效抗流感成份及藥理作用方式仍然不清楚。我們首次從南板藍(lán)根中分離獲得的甾類化合物：過氧麥角甾醇。到目前為止，并未發(fā)現(xiàn)關(guān)于過氧麥角甾醇在抑制甲型流感病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)方面的作用的報(bào)道。據(jù)已有的報(bào)道過氧麥角甾醇的藥理作用包括具有抗腫瘤，抗炎等活性。本發(fā)明首次從南板藍(lán)根中分離獲得過氧麥角甾醇以及首次將南板藍(lán)根中分離得的過氧麥角甾醇應(yīng)用于流感感染疾病的治療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供過氧麥角甾醇在制備用于預(yù)防或治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用，從而為現(xiàn)在臨床上流感的預(yù)防和治療提供一種有效的藥物。進(jìn)一步的，過氧麥角甾醇在制備能抑制甲型流感病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的藥物中應(yīng)用。過氧麥角甾醇具有如下就結(jié)構(gòu)式：進(jìn)一步的，所述過氧麥角甾醇可以通過商業(yè)渠道購買獲得，也可以通過從天然產(chǎn)物中提取分離制得。作為一種具體實(shí)施方式，過氧麥角甾醇可以從板藍(lán)根中分離獲得，優(yōu)選的，所述板藍(lán)根為南板藍(lán)根。本發(fā)明還提供一種從板藍(lán)根中分離過氧麥角甾醇的方法，包括如下步驟：S1：將板藍(lán)根藥材碎片用體積濃度為60～90％的乙醇水溶液加熱回流提取，提取次數(shù)可以為一次或多次，將提取液濃縮成浸膏；S2：將浸膏用水溶解成混合液，用氯仿萃取混合液得水層和氯仿層，將氯仿層減壓濃縮得氯仿層浸膏；萃取次數(shù)可以是1次或多次；S3：將氯仿層浸膏加入硅膠中，用乙酸乙酯-石油醚進(jìn)行梯度洗脫收集含有過氧麥角甾醇的餾分并濃縮去除溶劑。還包括步驟S4，所述步驟S4為：將步驟S3中所得產(chǎn)物用水溶解，加入到反相C18柱中，用甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫，收集含有過氧麥角甾醇的餾分。作為一種具體實(shí)施方式，在步驟S3、S4進(jìn)行洗脫時(shí)，均用TLC對洗脫液進(jìn)行定性分析，根據(jù)TLC分析結(jié)果來收集所需餾分。作為一種具體實(shí)施方式，所述板藍(lán)根為南板藍(lán)根。作為一種優(yōu)選方案，所述硅膠為正相硅膠。優(yōu)選的，步驟S3中，乙酸乙酯-石油醚按照9∶1～5∶5的體積比進(jìn)行梯度洗脫；更為優(yōu)選的，乙酸乙酯-石油醚按照體積比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5五個(gè)梯度進(jìn)行洗脫。優(yōu)選的，步驟S4中，甲醇-水按照1∶9～6∶4的體積比進(jìn)行梯度洗脫；更為優(yōu)選的，甲醇-水按照體積比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4六個(gè)梯度進(jìn)行洗脫。本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防或治療流感病毒感染的藥物，該藥物的活性成分包括過氧麥角甾醇。過氧麥角甾醇可作為唯一活性成分，也可和其他藥用許可的物質(zhì)組合。作為一種具體實(shí)施方式，該藥物的劑型可以制成藥學(xué)上可接受的任一種劑型，為制備所需的劑型，該藥物可以加入藥學(xué)上允許的輔料或載體。劑型例如為片劑、硬膠囊、軟膠囊、注射液、顆粒劑、滴丸等劑型。所需的藥學(xué)上可接受的載體或輔料，具體如藥學(xué)上常用的稀釋劑和吸收劑，例如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；藥學(xué)上常用的濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；藥學(xué)上常用的崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體或輔料不再一一例舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)所掌握的公知常識(shí)進(jìn)行具體選擇。作為一種具體實(shí)施方式，藥物中的過氧麥角甾醇為從板藍(lán)根中分離獲得，優(yōu)選的，所述板藍(lán)根為南板藍(lán)根。藥物中的過氧麥角甾醇可以通過商業(yè)渠道購買獲得，或者可按照上文所述的方法制得。本發(fā)明提供了小分子化合物過氧麥角甾醇在制備預(yù)防或治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用，從而為現(xiàn)在臨床上流感的預(yù)防和治療提供一種有效的藥物。本申請發(fā)明人采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)，過氧麥角甾醇能夠明顯抑制甲型流感病毒H1N1感染A549誘導(dǎo)對病原識(shí)別的模式識(shí)別受體RIG-I的過表達(dá)；過氧麥角甾醇能夠明顯抑制甲型流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥因子(IL-6，IP-10，IL-8，IFN-lambda，IFN-β，TNF-a)的過表達(dá)，呈劑量依賴關(guān)系；過氧麥角甾醇能夠明顯抑制甲型流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡因子TRAIL的異常表達(dá)。與現(xiàn)有藥物比較，采用過氧麥角甾醇制備預(yù)防或治療流感感染藥物至少具有如下突出優(yōu)勢：1、過氧麥角甾醇能有效地抑制流感病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞過表達(dá)病原識(shí)別的模式識(shí)別受體RIG-I；從而抑制模式識(shí)別受體下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的異常免疫炎癥及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。2、在優(yōu)選方案的，過氧麥角甾醇分離源于傳統(tǒng)的治療流感中藥板藍(lán)根，無明顯毒副作用。附圖說明圖1過氧麥角甾醇抑制流感誘導(dǎo)A549細(xì)胞過表達(dá)模式識(shí)別受體RIG-I；圖2過氧麥角甾醇抑制流感誘導(dǎo)A549細(xì)胞炎癥基因的異常表達(dá)；圖3過氧麥角甾醇抑制流感感染誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)凋亡因子TRAIL。具體實(shí)施方式為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。以下實(shí)施例中的過氧麥角甾醇可以通過商業(yè)渠道獲得，也可以通過如下實(shí)施例一的方法制得。實(shí)施例一制備南板藍(lán)根過氧麥角甾醇化合物步驟S1：提取將3Kg南板藍(lán)根藥材切成碎片，用80％(體積)的乙醇水溶液加熱回流分別提取三次，每次乙醇的體積為30L、24L、18L，得到乙醇提取液，合并乙醇提取液，加熱減壓回收乙醇得總提取物浸膏。步驟S2：萃取將所得浸膏與水混合，并加熱攪拌，采用1L的氯仿萃取所得混合液3次得到水層和氯仿層，隨后采用1L乙酸乙酯萃取所得水層3次，得乙酸乙酯層和水層。分別合并氯仿層和乙酸乙酯層，并用加熱減壓回收溶劑得氯仿層浸膏和乙酸乙酯層浸膏。步驟S3：正相硅膠處理將所得的氯仿層浸膏加入硅膠中，采用體積比9∶1～5∶5的乙酸乙酯-石油醚進(jìn)行梯度洗脫，本實(shí)施例中共進(jìn)行了五個(gè)洗脫梯度，依次為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，每個(gè)洗脫梯度的洗脫量為2L。通過TLC分析顯示確定分為了13個(gè)餾分，并用加熱減壓回收溶劑得13個(gè)固體殘留物。步驟S4：反相C18處理將5號(hào)餾分與6號(hào)餾分混合后(1.8g)用水溶解并加入反相C18柱中，采用甲醇-水按照體積比1∶9～6∶4進(jìn)行梯度洗脫，本實(shí)施例共有六個(gè)洗脫梯度，依次為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4，每個(gè)洗脫梯度的洗脫量為1L，通過TLC顯示，確定對應(yīng)于過氧麥角甾醇的餾分，該餾分進(jìn)行濃縮、干燥，得白色粉末(1.0mg)。經(jīng)檢測，其純度是95％。對所得的白色粉末進(jìn)行檢測，其結(jié)構(gòu)解析如下：1H-NMR譜顯示了質(zhì)子δ3.97(1H，M，H-3)，δ1.00(3H，D，J＝6.6Hz，H-21)，δ0.91(D，J＝7.2Hz，3H，H-28)，δ0.89(S，3H，H-19)，δ0.83(D，J＝6.6Hz，3H，H-26)，δ0.82(D，J＝7.2Hz，3H，H-26)，和δ0.82(S，3H，H-18)，這表明該化合物應(yīng)該是甾醇。在1H-NMR譜中同時(shí)存在的兩個(gè)雙鍵特征信號(hào)：δ5.14(1H，dd，J＝15.6，7.8Hz，H-22)，δ5.23(1H，dd，J＝15.6，7.8H，H-23)，δ6.51(1H，d，J＝9.0Hz，H-6)，δ6.25(1H，d，J＝9.0Hz，H-7)，在HMBC中與碳δ132.3(C-23)，δ135.2(C-22)，δ135.39(C-6)，δ130.68(C-7)相關(guān)。在HMBC中兩個(gè)亞甲基質(zhì)子信號(hào)在δ1.94(1H，m，H-4a)和2.11(1H，m，H-4b)與兩個(gè)碳的信號(hào)δ82.2(C-5)和135.4(C-6)的顯著相關(guān)性提示該化合物存在5α，8α-epidioxy系統(tǒng)。同時(shí)亞甲基信號(hào)δ0.89(s，3H，H-19)與碳位移為δ82.2(C-5)遠(yuǎn)距離相關(guān)。質(zhì)子δ1.94(1H，m，H-4a)和2.11(1H，m，H-4b)有相關(guān)性而與碳δ79.4(C-8)無相關(guān)性。此外，在5α，8α-epidioxy系統(tǒng)中烯烴質(zhì)子δ6.25(1H，D，J＝9.0Hz，H-7)與碳δ51.1(C-9)和51.7(C-14)相關(guān)，而另一個(gè)烯烴質(zhì)子δ6.51(1H，d，J＝9.0Hz，H-6)與碳δ37.0(C-4)和36.9(C-10)相關(guān)。經(jīng)檢測及結(jié)構(gòu)解析，確定所得產(chǎn)物的所有數(shù)據(jù)均與過氧麥角甾醇的一致，其結(jié)構(gòu)如下：實(shí)施例二過氧麥角甾醇對流感病毒感染誘導(dǎo)宿主表達(dá)模式識(shí)別受體RIG-I的影響1.實(shí)驗(yàn)材料：1.1藥物受試樣品過氧麥角甾醇(實(shí)施例一制備)，經(jīng)HPLC檢測其純度為95％。1.2細(xì)胞和毒株A549細(xì)胞購自ATCC，保存于本實(shí)驗(yàn)室；甲型H1N1流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)，保存于本實(shí)驗(yàn)室1.3試劑逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(購自Takara公司；貨號(hào)：RR036A)；實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑盒(購自Takara公司；貨號(hào)：RR390A)2.實(shí)驗(yàn)方法包括如下步驟：1)將A549細(xì)胞以5X106的細(xì)胞密度種至6孔板，放置于溫度37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中；2)過夜培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入PBS洗滌2次。然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)無血清的DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基吸附細(xì)胞2h；然后，用PBS將細(xì)胞洗滌除去未吸附的病毒；3)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組設(shè)置，包括：正常組，病毒組，藥物干預(yù)組和陽性藥物奧司他韋對照組。用無血清的DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基稀釋流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)并加至細(xì)胞中進(jìn)行吸附細(xì)胞2h；然后，用PBS將細(xì)胞洗滌除去未吸附的病毒。其中藥物干預(yù)組采用藥物治療模式，藥物干預(yù)組加入不同濃度過氧麥角甾醇(PR8+過氧麥角甾醇(150μg/ml)、PR8+過氧麥角甾醇(300μg/ml))；病毒組不加藥物進(jìn)行干預(yù)；陽性藥物奧司他韋藥物對照組，加入300μg/ml的奧司他韋。4)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)上清后，冷PBS洗滌2遍，加入1mlTrizol(Lifetechnologies公司)并在室溫下孵育5min；(可選：或轉(zhuǎn)至1.5mlEP管中，于-80°冰箱中保存；或直接進(jìn)行提取)；5)后續(xù)按照如下步驟進(jìn)行：①加入200ul氯仿，震蕩15sec，于室溫中孵育2-3min；置于4℃離心機(jī)中進(jìn)行離心：13000rpmx15min；②離心畢，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5EP管，加入500ul異丙醇；室溫下孵育10min；置于4℃離心機(jī)中進(jìn)行離心：12000rpmx10min；③離心畢，加入1ml75％乙醇洗滌一次，置于4℃離心機(jī)中進(jìn)行離心：7500rpmx10min；④棄去上清，室溫放置5-10min，加入無RNase水溶解RNA，立刻進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。⑤分光光度計(jì)中測定總RNA的濃度(ng/μl)并計(jì)算總RNA的體積：擬加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中總RNA的量為1000ng，則計(jì)算所需總RNA的體積V＝1000/RNA濃度；⑥mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下(試劑盒：TakaraRR036A)：試劑體積5xPrimeScriptRTMasterMix4ul總RNAVDH2O16-V體系總體積20ul⑦進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：37℃15min85℃5Sec4℃∞收取樣品進(jìn)行后續(xù)定量PCR實(shí)驗(yàn)或保存于-20℃。⑧實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑盒(貨號(hào)：TakaraRR390A)配置反應(yīng)體系如下：進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)條件(ABI7500)引物序列及探針序列如下：實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖1，由圖可知，過氧麥角甾醇能夠明顯抑制甲型流感病毒H1N1感染A549誘導(dǎo)對病原識(shí)別的模式識(shí)別受體RIG-I的過表達(dá)。實(shí)施例三過氧麥角甾醇對流感病毒感染誘導(dǎo)宿主表達(dá)炎癥基因的影響1.實(shí)驗(yàn)材料：1.1藥物受試樣品過氧麥角甾醇(實(shí)施例一制備)。1.2細(xì)胞和毒株A549細(xì)胞購自ATCC，保存于本實(shí)驗(yàn)室；甲型H1N1流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)，保存于本實(shí)驗(yàn)室。1.3試劑逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(購自Takara公司；貨號(hào)：RR036A)；實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑盒(購自Takara公司；貨號(hào)：RR390A)2.實(shí)驗(yàn)方法，包括如下步驟：1)將A549細(xì)胞以5X106的細(xì)胞密度種至6孔板，放置于溫度37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中；2)過夜培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入PBS洗滌2次。然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)無血清的DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基吸附細(xì)胞2h；然后，用PBS將細(xì)胞洗滌除去未吸附的病毒；3)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組設(shè)置，包括：正常組，病毒組，藥物干預(yù)組和陽性藥物奧司他韋對照組。用無血清的DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基稀釋流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)加至細(xì)胞中進(jìn)行吸附細(xì)胞2h；然后，用PBS將細(xì)胞洗滌除去未吸附的病毒。其中藥物干預(yù)組采用藥物治療模式，藥物干預(yù)組加入不同濃度過氧麥角甾醇(PR8+過氧麥角甾醇(150μg/ml)、PR8+過氧麥角甾醇(300μg/ml))；病毒組不加藥物進(jìn)行干預(yù)。陽性藥物奧司他韋藥物對照組，加入300μg/ml的奧司他韋。4)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)上清后，冷PBS洗滌2遍，加入1mlTrizol(Lifetechnologies公司)并在室溫下孵育5min；(可選：或轉(zhuǎn)至1.5mlEP管中，于-80°冰箱中保存；或直接進(jìn)行提取)；后續(xù)進(jìn)行的細(xì)胞總RNA提取、mRNA逆轉(zhuǎn)錄成eDNA、及實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)均參照實(shí)施例二的相應(yīng)步驟進(jìn)行，不再贅述；其中，本實(shí)施例在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中引物序列及探針序列如下：3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖2顯示，流感A/PR8/3/4(H1N1)感染A549細(xì)胞進(jìn)行藥物過氧麥角甾醇干預(yù)后，明顯抑制流感誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6、IL-8、IP-10、IFN-beta、IFN-lambdal、TNF-a的基因水平的表達(dá)。實(shí)施例四.過氧麥角甾醇對流感病毒感染誘導(dǎo)宿主凋亡基因TRAIL的表達(dá)影響1.實(shí)驗(yàn)材料：1.1藥物受試樣品過氧麥角甾醇(實(shí)施例一制備)1.2細(xì)胞和毒株A549細(xì)胞購自ATCC，保存于本實(shí)驗(yàn)室；甲型H1N1流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)，保存于本實(shí)驗(yàn)室。1.3試劑逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(購自Takara公司；貨號(hào)：RR036A)；實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑盒(購自Takara公司；貨號(hào)：RR390A)2.實(shí)驗(yàn)方法按照如下步驟：1)將A549細(xì)胞以5X106的細(xì)胞密度種至6孔板，放置于溫度37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中；2)過夜培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入PBS洗滌2次。然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)無血清的DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基吸附細(xì)胞2h；然后，用PBS將細(xì)胞洗滌除去未吸附的病毒；3)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組設(shè)置，包括：正常組，病毒組，藥物干預(yù)組和陽性藥物奧司他韋對照組。用無血清的DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基稀釋流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)加至細(xì)胞中進(jìn)行吸附細(xì)胞2h；然后，用PBS將細(xì)胞洗滌除去未吸附的病毒。其中藥物干預(yù)組采用藥物治療模式，藥物組干預(yù)組加入不同濃度過氧麥角甾醇(PR8+過氧麥角甾醇(150μg/ml)、PR8+過氧麥角甾醇(300μg/ml))；病毒組不加藥物進(jìn)行干預(yù)。陽性藥物奧司他韋藥物對照組，加入300μg/ml的奧司他韋。4)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)上清后，冷PBS洗滌2遍，加入1mlTrizol(Lifetechnologies公司)并在室溫下孵育5min；(可選：或轉(zhuǎn)至1.5mlEP管中，于-80°冰箱中保存；或直接進(jìn)行提取)；后續(xù)的細(xì)胞總RNA提取、mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、及實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)均參照實(shí)施例二的相應(yīng)步驟進(jìn)行，不再贅述；其中，本實(shí)施例在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中所用的凋亡因子TRAIL引物序列及探針序列如下：3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖3所示，南板藍(lán)根過氧麥角甾醇干預(yù)后明顯抑制流感病毒誘導(dǎo)的凋亡因子TRAIL的基因表達(dá)水平，并呈劑量依賴關(guān)系。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表面，過氧麥角甾醇能夠明顯抑制甲型流感病毒H1N1感染A549誘導(dǎo)對病原識(shí)別的模式識(shí)別受體RIG-I的過表達(dá)；過氧麥角甾醇能夠明顯抑制甲型流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥因子(IL-6，IP-10，IL-8，IFN-lambda，IFN-β，TNF-a)的過表達(dá)，呈劑量依賴關(guān)系；過氧麥角甾醇能夠明顯抑制甲型流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡因子TRAIL的異常表達(dá)。過氧麥角甾醇可應(yīng)用于制備預(yù)防或治療流感病毒感染的藥物，從而為現(xiàn)在臨床上流感的預(yù)防和治療提供一種有效的藥物。與現(xiàn)有藥物比較，采用過氧麥角甾醇制備預(yù)防或治療流感感染藥物至少具有如下突出優(yōu)勢：過氧麥角甾醇能有效地抑制流感病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞過表達(dá)病原識(shí)別的模式識(shí)別受體RIG-I；從而抑制模式識(shí)別受體下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的異常免疫炎癥及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。文中未特別說明，均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)其掌握的公知常識(shí)或常規(guī)技術(shù)手段所能理解或知曉的，對此不再一一贅述。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，故凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3