本發(fā)明涉及電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)腫瘤抑制基因P53的比率電化學(xué)DNA傳感器修飾電極及其制備方法。

背景技術(shù)：

腫瘤抑制基因P53是一種被稱為“基因組的守護(hù)者”的抑癌基因，是一系列同工型蛋白質(zhì)(P53蛋白)的同源基因。由該基因編碼的一系列蛋白質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞分裂、修復(fù)和凋亡的作用。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，P53蛋白會(huì)監(jiān)測(cè)細(xì)胞基因的受損程度。在基因受損程度較小時(shí)，P53蛋白會(huì)促使細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)；而在受損基因不可修復(fù)時(shí)，P53蛋白則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，當(dāng)P53基因突變時(shí)，細(xì)胞的修復(fù)凋亡過程會(huì)受到干擾，從而使一部分受損細(xì)胞在不正常的條件下繼續(xù)分裂生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。

國際癌癥基因組協(xié)會(huì)已經(jīng)證明，P53基因是在人類癌癥有關(guān)的基因中突變最為頻繁的基因。在人類已知的所有惡性腫瘤組織中，該基因出現(xiàn)突變的概率在50％以上，是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的與癌癥相關(guān)性最高的基因。

現(xiàn)有的對(duì)于P53基因的檢測(cè)主要有毛細(xì)管電泳、變性高效液相色譜、變性梯度凝膠電泳以及酵母中分離的等位基因功能分析技術(shù)等方法，這些方法雖然有高的靈敏度，但是存在操作復(fù)雜，成本高等諸多缺點(diǎn)；同時(shí)儀器投入費(fèi)用高和耗材貴，也限制了這些方法的臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的之一是提供一種用于檢測(cè)P53基因的探針，目的之二是提供一種用于檢測(cè)P53基因的探針在制備檢測(cè)P53基因的修飾電極中的應(yīng)用，目的之三是提供一種用于檢測(cè)P53基因的修飾電極的制備方法，目的之四是提供一種用于檢測(cè)P53基因的修飾電極，目的之五是提供一種修飾電極在制備用于檢測(cè)P53基因的電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用，目的之六是提供一種基于雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)的用于檢測(cè)P53基因的比率電化學(xué)DNA傳感器的應(yīng)用方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面，提供一種用于檢測(cè)P53基因的探針，由一條單鏈DNA輔助探針S1和一條單鏈DNA捕獲探針S2組成，所述S1的DNA鏈序列為：5’-Fc-CTC TCA GTG ATT TTT TTA GTG AGA GAG-(CH₂)₆-SH-3’，所述S2的DNA鏈序列為：5’-MB-TCA CTG AGT CTT CCA GTG TGA TGA TCA CT-3’。

本發(fā)明第二方面，提供一種利用上述檢測(cè)P53基因的探針在制備檢測(cè)P53基因的修飾電極中的應(yīng)用。

本發(fā)明第三方面，提供一種用于檢測(cè)P53基因的修飾電極的制備方法，步驟如下：

(1)輔助探針S1在含有三(2-羧乙基)膦的Tris-HCl緩沖液中加熱，退火獲得單鏈輔助探針S1的Tris-HCl緩沖液；

(2)將打磨、清洗干燥后的金電極浸在步驟(1)得到的輔助探針S1的Tris-HCl緩沖液中，通過自組裝的方式將輔助探針S1修飾到金電極表面，得到S1/GE修飾電極；

(3)將步驟(2)所得電極浸在捕獲探針S2的Tris-HCl緩沖液中，水浴加熱，使捕獲探針S2與輔助探針S1結(jié)合，在金電極表面形成雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到S2/S1/GE修飾電極；

優(yōu)選：所述步驟(2)中打磨、清洗干燥的具體步驟為：將金電極用氧化鋁粉末打磨拋光成鏡面，再分別經(jīng)乙醇、二次蒸餾水超聲清洗20-60s，氮?dú)飧稍?，得到清潔金電極。

優(yōu)選：所述步驟(1)中90℃水浴加熱4-6分鐘。

優(yōu)選：所述步驟(1)中含有三(2-羧乙基)膦的Tris-HCl緩沖液的為含有濃度為110-150mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，100-120mM的NaCl，1-10mM的MgCl₂，9-11mM的三(2-羧乙基)膦的混合液，pH為7.4-7.8。

優(yōu)選：所述步驟(2)、(3)中Tris-HCl緩沖液為含有濃度為110-150mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，100-120mM的NaCl，1-10mM的MgCl₂，pH為7.4-7.8。

優(yōu)選：所述步驟(2)中將輔助探針S1修飾到金電極表面的條件為：反應(yīng)溫度為22-25℃反應(yīng)時(shí)間為10-24小時(shí)，輔助探針S1緩沖液的濃度為40-50mM(即：緩沖液中輔助探針S1的濃度)。

優(yōu)選：所述步驟(3)中加熱操作具體為：水浴35-37℃加熱1-3小時(shí)，所述捕獲探針的濃度為35-50mM。

本發(fā)明第四方面，提供一種利用上述制備方法制備得到的修飾電極以及所述修飾電極在制備用于檢測(cè)P53基因的電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用。

本發(fā)明第五方面，提供一種檢測(cè)腫瘤抑制基因P53的方法，步驟如下：

(1)將上述S2/S1/GE修飾電極在Tris-HCl緩沖液中水浴加熱后，與甘汞參比電極和鉑絲對(duì)電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，在Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行DPV檢測(cè)，得到亞甲基藍(lán)的峰電流I_0(MB)，二茂鐵的峰電流為I_0(Fc)；

(2)將上述S2/S1/GE修飾電極與不同濃度的P53基因緩沖液在加熱的條件下進(jìn)行識(shí)別后用Tris-HCl緩沖液沖洗，之后與甘汞參比電極和鉑絲對(duì)比電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，在Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行DPV檢測(cè)，以得到的二茂鐵峰電流比亞甲基藍(lán)的峰電流的值：I＝I_Fc/I_MB；以I對(duì)P53基因濃度的對(duì)數(shù)做線性回歸方程，得工作曲線；

(3)在對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，采用同樣方法對(duì)待測(cè)樣品中的P53基因進(jìn)行DPV檢測(cè)，求得二茂鐵峰電流對(duì)亞甲基藍(lán)峰電流的比值，后代入線性回歸方程即得樣品中P53基因的濃度。

優(yōu)選：所述步驟(1)、(2)中，Tris-HCl緩沖液為含有110-150mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，100-120mM的NaCl，1-10mM的MgCl₂的混合液，其pH為7.4-7.8。

優(yōu)選：步驟(1)中，加熱時(shí)間為15-30分鐘。

優(yōu)選：所述步驟(2)中，P53基因緩沖液為含有110-150mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，100-120mM的NaCl，1-10mM的MgCl₂以及10^-8-10^-12M的P53基因的混合液，其pH為7.4-7.8。

優(yōu)選：所述步驟(2)中，加熱是水浴加熱，反應(yīng)溫度為35-37℃，反應(yīng)時(shí)間為15-30分鐘。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明所提供的檢測(cè)P53基因的方法簡(jiǎn)單，操控方便，使用成本低，與毛細(xì)管電泳、變性高效液相色譜、變性梯度凝膠電泳以及酵母中分離的等位基因功能分析技術(shù)等方法相比較，本發(fā)明的方法具有樣品無需前處理，易操控，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

(2)目前由于以下的技術(shù)難題，限制了基于雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)的比率電化學(xué)分析法應(yīng)用到P53基因的檢測(cè)：第一在電極表面不易構(gòu)建雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)。首先，若輔助探針只是修飾到電極表面而未形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，則輔助探針的電活性物質(zhì)(二茂鐵)與電極表面相距過遠(yuǎn)，從而導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移在電極表面無法發(fā)生，無法檢測(cè)到電信號(hào)。其次要通過一定的實(shí)驗(yàn)條件和一定濃度的試劑誘導(dǎo)捕獲探針和輔助探針相結(jié)合，否則無法形成雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)，也就無法進(jìn)行比率的測(cè)定。第二無法構(gòu)建足夠的雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在電極表面，雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)最理想的狀態(tài)是與電極表面垂直。如果雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)平鋪在電極表面，單個(gè)雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)所占的面積就會(huì)增大，電極表面修飾的雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)就會(huì)減少，從而影響檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明克服了上述技術(shù)難題，首次將基于雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)的比率電化學(xué)分析法應(yīng)用到P53基因的檢測(cè)中來，在實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)(檢測(cè)限達(dá)到2.4×10^-12M)的同時(shí)還具有操作簡(jiǎn)便，成本低，快速高效等優(yōu)點(diǎn)。

(3)本發(fā)明利用捕獲探針與P53基因的特異性結(jié)合，基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原理(具體原理：捕獲探針與P53基因結(jié)合后，由于P53基因與捕獲探針存在19對(duì)互補(bǔ)堿基，而輔助探針與捕獲探針只存在10對(duì)互補(bǔ)堿基，導(dǎo)致P53基因與捕獲探針之間的結(jié)合力遠(yuǎn)大于輔助探針與捕獲探針之間的結(jié)合力。因此在P53基因存在的條件下，捕獲探針會(huì)與P53基因結(jié)合并被拉離電極表面從而導(dǎo)致MB的電信號(hào)減弱)，具有好的選擇性和靈敏度，能夠直接對(duì)實(shí)際樣品中的P53基因進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

(4)本發(fā)明具有良好的再生能力，將使用后的傳感器(具體指：利用本發(fā)明的修飾電極制備的檢測(cè)P53基因的電化學(xué)傳感器)或修飾電極在S2的緩沖溶液中浸泡過夜后，對(duì)于P53基因仍具有較好的檢測(cè)能力。

(5)目前還沒有關(guān)于基于雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)的比率電化學(xué)傳感器的介紹，本發(fā)明的修飾電極用于傳感器的優(yōu)點(diǎn)主要有兩個(gè)：

第一、一般的電化學(xué)傳感器難以克服電化學(xué)方法本身的缺陷，即電化學(xué)信號(hào)不穩(wěn)定，收外界影響大，重復(fù)性差等。但是由于利用本發(fā)明修飾電極的比率(即二茂鐵的電信號(hào)值比亞甲基藍(lán)的電信號(hào)值)電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)的是兩個(gè)信號(hào)，因此當(dāng)傳感器受到干擾時(shí)，兩個(gè)信號(hào)所受到的干擾相互抵消，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

第二、以DNA雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)比率電化學(xué)傳感器，使得所制備的傳感器具有良好的再生性。這是普通的比率電化學(xué)傳感器所不具備的優(yōu)點(diǎn)。如果將使用后的修飾電極重新浸泡在S2的緩沖溶液中，電極表面又會(huì)重新構(gòu)建起雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)，仍然可用于P53基因的檢測(cè)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的原理圖；

圖2是實(shí)施例3檢測(cè)P53基因的線性關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)驗(yàn)中所使用的儀器及試劑為：(1)儀器：CHI650電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；采用飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極；(2)試劑：輔助探針、捕獲探針和P53基因(上海生工生物工程股份有限公司)，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

實(shí)施例1

一種用于基于雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)的P53基因的修飾電極的制備方法，如圖1所示，包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)一條單鏈DNA輔助探針S1，該DNA鏈兩端堿基可以與捕獲探針鏈S2兩端堿基互補(bǔ)配對(duì)并且自身有10個(gè)堿基長(zhǎng)度的互補(bǔ)配對(duì)序列，能夠在固定在金電極表面后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；S1鏈的5’端修飾有二茂鐵標(biāo)記物，該標(biāo)記物可以產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)；S1鏈的53’端硫醇化，使得S1可以通過金-硫鍵修飾到金電極表面；輔助探針S1的DNA鏈序列為：5’-Fc-CTC TCA GTG ATT TTT TTA GTG AGA GAG-(CH₂)₆-SH-3’；

(2)設(shè)計(jì)一條單鏈DNA捕獲探針S2，該DNA鏈中間部分堿基可以與P53基因互補(bǔ)配對(duì)；同時(shí)兩端堿基可與輔助探針S1兩端互補(bǔ)配對(duì)，能夠在與輔助探針S1結(jié)合后形成雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)；S2鏈的5’端修飾有亞甲基藍(lán)標(biāo)記物，該標(biāo)記物可以產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)；輔助探針S2的DNA鏈序列為：5’-MB-TCA CTG AGT CTT CCA GTG TGA TGA TCA CT-3’；

(3)將金電極用氧化鋁粉末打磨拋光成鏡面，再分別經(jīng)乙醇、二次蒸餾水超聲清洗，氮?dú)飧稍?，得到清潔金電極；

(4)輔助探針S1在含有三(2-羧乙基)膦的Tris-HCl緩沖液中打開二硫鍵，后將其水浴90℃加熱6分鐘，以退火獲得單鏈輔助探針S1緩沖液；所述三(2-羧乙基)膦的Tris-HCl緩沖液為含有110-150mM Tris-HCl，100-120mM NaCl，1-10mMMgCl，9～11mM三(2-羧乙基)膦的混合液，其pH為7.4。

(5)將步驟(2)處理好的金電極浸在步驟(3)得到輔助探針S1緩沖液中，所述輔助探針S1緩沖液的濃度為40mM，反應(yīng)溫度為22℃反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)，將輔助探針S1修飾到金電極表面，得到S1/GE修飾電極。

(6)將步驟(5)所得電極浸在捕獲探針S2緩沖液中，所述捕獲探針S2的濃度為50mM，水浴加熱，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)，使捕獲探針S2與輔助探針S1結(jié)合，在金電極表面形成雙發(fā)架結(jié)構(gòu)，得到S2/S1/GE修飾電極；

實(shí)施例2

一種用于基于雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)的P53基因的修飾電極的制備方法，如圖1所示，包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)一條單鏈DNA輔助探針S1，該DNA鏈兩端堿基可以與捕獲探針鏈S2兩端堿基互補(bǔ)配對(duì)并且自身有10個(gè)堿基長(zhǎng)度的互補(bǔ)配對(duì)序列，能夠在固定在金電極表面后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；S1鏈的5’端修飾有二茂鐵標(biāo)記物，該標(biāo)記物可以產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)；S1鏈的53’端硫醇化，使得S1通過金-硫鍵修飾到金電極表面；其中，輔助探針S1的DNA鏈序列為：5’-Fc-CTC TCA GTG ATT TTT TTA GTG AGA GAG-(CH₂)₆-SH-3’；

(2)設(shè)計(jì)一條單鏈DNA捕獲探針S2，該DNA鏈中間部分堿基可以與P53基因互補(bǔ)配對(duì)；同時(shí)兩端堿基可與輔助探針S1兩端互補(bǔ)配對(duì)，能夠在與輔助探針S1結(jié)合后形成雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)；S2鏈的5’端修飾有亞甲基藍(lán)標(biāo)記物，該標(biāo)記物可以產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)；輔助探針S2的DNA鏈序列為：5’-MB-TCA CTG AGT CTT CCA GTG TGA TGA TCA CT-3’；

(3)將金電極用氧化鋁粉末打磨拋光成鏡面，再分別經(jīng)乙醇、二次蒸餾水超聲清洗60s，氮?dú)飧稍?，得到清潔金電極；

(4)輔助探針S1在含有三(2-羧乙基)膦的Tris-HCl緩沖液中打開二硫鍵，后將其水浴90℃加熱4分鐘，以退火獲得單鏈輔助探針S1緩沖液；所述三(2-羧乙基)膦的Tris-HCl緩沖液為含有110-150mM Tris-HCl，100-120mM NaCl，1-10mMMgCl,9～11mM三(2-羧乙基)膦的混合液，其pH為7.8。

(5)將步驟(2)處理好的金電極浸在步驟(3)得到輔助探針S1緩沖液中，所述輔助探針S1緩沖液的濃度為50mM，反應(yīng)溫度為25℃反應(yīng)時(shí)間為22小時(shí)，將輔助探針S1修飾到金電極表面，

(6)將步驟(4)所得電極浸在捕獲探針S2緩沖液中，所述捕獲探針S2的濃度為35mM，水浴加熱，反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)，使捕獲探針S2與輔助探針S1結(jié)合，在金電極表面形成雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到S2/S1/GE修飾電極。

實(shí)施例3

實(shí)施例1制備的修飾電極在檢測(cè)P53基因中的應(yīng)用，步驟如下：

將實(shí)施例1的修飾電極浸泡在Tris-HCl緩沖液中，所述Tris-HCl緩沖液為含有110-150mM Tris-HCl，100-120mM NaCl，1-10mMMgCl的混合液，其pH為7.4，水浴加熱15分鐘。然后與甘汞參比電極和鉑絲對(duì)比電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，在Tris-HCl緩沖液進(jìn)行DPV檢測(cè)，得到亞甲基藍(lán)的峰電流I_0(MB)，二茂鐵的峰電流為I_0(Fc)，重復(fù)多次取平均值。

配置一系列p53基因緩沖溶液，其中緩沖溶液的濃度和pH值保持不變，p53基因的濃度分別調(diào)節(jié)為10^-8，5×10^-9，10^-9，5×10^-10，10^-10，5×10^-11，10^-11，10^-12M，然后將所得的電極浸泡在p53的緩沖溶液中，水浴35℃加熱15分鐘，以三電極法測(cè)定每個(gè)樣品的電化學(xué)信號(hào)，并對(duì)測(cè)定的p53基因進(jìn)行線性擬合(即I_Fc/I_MB與p53基因濃度的對(duì)數(shù)的線性關(guān)系)。

使用所構(gòu)建的三電極系統(tǒng)采用同樣方法對(duì)實(shí)際樣品中的P53基因進(jìn)行DPV檢測(cè)，求的二茂鐵氧化電流對(duì)亞甲基藍(lán)氧化電流的比值，代入線性回歸方程確定樣品中P53基因的濃度，以檢驗(yàn)本發(fā)明在生物樣品或復(fù)雜體系中的實(shí)際分析能力，參見圖2(圖中六個(gè)點(diǎn)的的濃度為1×10^-8，5×10^-9，1×10^-9，5×10^-10，1×10^-10，5×10^-11，1×10^-11M)。

對(duì)P53基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)不同濃度P53基因峰電流曲線均變化明顯，P53基因在濃度為0.01～100nM內(nèi)成良好的線性關(guān)系，本申請(qǐng)的電化學(xué)生物傳感器對(duì)溶菌酶的檢測(cè)限度可低至2.4×10^-12M，儀器成本低，靈敏度高，快速高效。

實(shí)施例4

實(shí)施例1制備的修飾電極在檢測(cè)P53基因中的應(yīng)用，步驟如下：

將實(shí)施例1修飾電極浸泡在Tris-HCl緩沖液中，所述Tris-HCl緩沖液為含有110-150mM Tris-HCl，100-120mM NaCl，1-10mMMgCl的混合液，其pH為7.8，水浴加熱30分鐘。然后與甘汞參比電極和鉑絲對(duì)比電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，在Tris-HCl緩沖液進(jìn)行DPV檢測(cè)，得到亞甲基藍(lán)的峰電流I_0(MB)，二茂鐵的峰電流為I_0(Fc)，重復(fù)多次取平均值。

配置一系列p53基因緩沖溶液，其中緩沖溶液的濃度和pH值保持不變，p53基因的濃度分別調(diào)節(jié)為10^-8，5×10^-9，10^-9，5×10^-10，10^-10，5×10^-11，10^-11，10^-12M，然后將所得的電極浸泡在p53的緩沖溶液中，水浴35℃加熱30分鐘，以三電極法測(cè)定每個(gè)樣品的電化學(xué)信號(hào)，并對(duì)測(cè)定的p53基因進(jìn)行線性擬合(即I_Fc/I_MB與p53基因濃度的對(duì)數(shù)的線性關(guān)系)。

使用所構(gòu)建的三電極系統(tǒng)采用同樣方法對(duì)實(shí)際樣品中的P53基因進(jìn)行DPV檢測(cè)，求的二茂鐵氧化電流對(duì)亞甲基藍(lán)氧化電流的比值，代入線性回歸方程確定樣品中P53基因的濃度，以檢驗(yàn)本發(fā)明在生物樣品或復(fù)雜體系中的實(shí)際分析能力。

對(duì)P53基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)不同濃度P53基因峰電流曲線均變化明顯，P53基因在濃度為0.01～100nM內(nèi)成良好的線性關(guān)系，本申請(qǐng)的電化學(xué)生物傳感器對(duì)溶菌酶的檢測(cè)限度可低至2.4×10^-12M，儀器成本低，靈敏度高，快速高效。

上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。