本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群的方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)：

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)廣泛分布于海洋與淡水環(huán)境中，是一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害檢驗(yàn)檢疫對(duì)象和食源性致病菌。根據(jù)菌體(O)抗原的不同，霍亂弧菌可分為許多血清群，但僅發(fā)現(xiàn)O1和O139群能引發(fā)霍亂。其中O1群霍亂弧菌自1817年以來(lái)，在全球共引發(fā)七次霍亂大流行。因此，霍亂弧菌O1群的早期檢測(cè)和診斷對(duì)治療和預(yù)防霍亂的發(fā)生和蔓延十分重要。

傳統(tǒng)霍亂弧菌檢測(cè)方法由于檢測(cè)周期較長(zhǎng)，操作相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)效率較低，難以滿(mǎn)足現(xiàn)代社會(huì)對(duì)于食源性致病菌檢測(cè)過(guò)程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。近年來(lái)隨著核酸分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，研究人員陸續(xù)開(kāi)發(fā)出了PCR和熒光PCR技術(shù)的檢測(cè)手段，但是這兩種方法都需要專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)儀器，因此，并不適合廣泛應(yīng)用于基層檢測(cè)部門(mén)尤其是企業(yè)生產(chǎn)線(xiàn)內(nèi)部進(jìn)行的實(shí)時(shí)實(shí)地檢測(cè)。為了確保食品安全，急需快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的方法來(lái)檢測(cè)食品中的霍亂弧菌O1群。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對(duì)靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內(nèi)引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀(見(jiàn)文獻(xiàn)Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。該技術(shù)具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應(yīng)結(jié)果，以及靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、操作便捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

引物設(shè)計(jì)是LAMP技術(shù)中最為關(guān)鍵的一步，常規(guī)做法是將某待檢測(cè)生物的公認(rèn)的特異性基因?qū)隠AMP引物設(shè)計(jì)的在線(xiàn)網(wǎng)站(http://primerexplorer.jp/e)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)生成引物組。也就是說(shuō)，用戶(hù)首先必須確保該靶基因?yàn)榇郎y(cè)物種的特異序列。以發(fā)明專(zhuān)利ZL201010584749.7和ZL201310119610.9為例，它們分別針對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的霍亂弧菌的特異基因——ctxA基因和dnaA基因，采用LAMP技術(shù)進(jìn)行霍亂弧菌檢測(cè)。然而，所謂“公認(rèn)的特異性基因”往往基于滯后的知識(shí)，并未基于不斷增長(zhǎng)的微生物基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的更新，導(dǎo)致基于該靶基因序列獲得的引物在實(shí)際應(yīng)用中不一定能確保其通用性和/或特異性。本發(fā)明用表1展示了現(xiàn)有技術(shù)中存在的通用性不能確保的問(wèn)題。也就是說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)方法中所使用的霍亂弧菌O1群檢測(cè)序列實(shí)際上并非霍亂弧菌O1群所共有，即，有可能漏檢霍亂弧菌O1群的部分菌株。類(lèi)似的問(wèn)題也存在于特異性的確認(rèn)，即，有可能將非霍亂弧菌O1群錯(cuò)誤地認(rèn)定為霍亂弧菌O1群。因此，行業(yè)內(nèi)亟需一種能夠確保特異性和通用性的霍亂弧菌O1群檢測(cè)方法，同時(shí)滿(mǎn)足基層檢測(cè)部門(mén)對(duì)快速、便捷的需求，能夠方便地在企業(yè)生產(chǎn)線(xiàn)內(nèi)部開(kāi)展實(shí)時(shí)實(shí)地檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)中存在的引物通用性和特異性不足的缺陷，充分利用目前公共數(shù)據(jù)資源中豐富的微生物基因組序列信息以及相應(yīng)的序列分析工具，設(shè)計(jì)用于特異性識(shí)別霍亂弧菌O1群的引物組，并在此基礎(chǔ)上形成高靈敏度、高特異性檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的微生物基因組數(shù)據(jù)資源(截至2013年8月5日數(shù)據(jù))進(jìn)行霍亂弧菌O1群LAMP引物的設(shè)計(jì)，提供了一種快速恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)霍亂弧菌O1群的方法、引物組及試劑盒。采用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)霍亂弧菌O1群，具有高靈敏度和高特異性，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果判定簡(jiǎn)單，操作便捷，成本低的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提出一種快速檢測(cè)霍亂弧菌O1群菌株的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA；

(2)以所述基因組DNA為模板，以能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列的引物組為引物，在酶反應(yīng)體系下，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

(3)通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性，確定待測(cè)樣品中是否存在霍亂弧菌O1群。

本發(fā)明恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群菌株的方法，從待測(cè)樣品中提取基因組DNA，以其為模板，以霍亂弧菌O1群特異性擴(kuò)增引物組為引物，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，然后，通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性，確定待測(cè)樣品中是否存在霍亂弧菌O1群。其中，所述酶反應(yīng)體系包括但不限于DNA聚合酶反應(yīng)體系。

本發(fā)明中，所述霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列為GI號(hào)為15640032的霍亂弧菌O1群的170082～171001bp位序列。

本發(fā)明中，所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列的引物組為所述基因組(GI號(hào)為15640032)的170082～171001bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈的一部分。其中，所述霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列是指僅為霍亂弧菌O1群基因組所特有的，而其它微生物基因組所不包含的堿基序列。

其中，所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異堿基序列的引物組包括但不限于選自以下各引物組A～B之任意一組，或選自與該引物組序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為50％及以上的引物組之任意一組。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-CCACTTATTCGCTTTACACA-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-TTTCGATGGTGTAATCATCC-3’(SEQ ID NO：2)；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-GCAAAGTGAAACGCATGGTTGGAATTTGAACCTCGTCTG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-GTGGTATGGACGTTCAATCGTCAGAGGTTCAAAAATCCCTT-3’(SEQ ID NO：4)；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-ATCCGCCAGATGTGCGAT-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-GGGAATCCAGATCCCTAGTTTG-3’(SEQ ID NO：6)；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-GCGGATCGGTAAACAGCTGCTCCGTTGGGGTCATGCAGATG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-TGCCTGAATTTACAGGCTTACGCGATCGCCAACCCAAGTTGG-3’(SEQ ID NO：8)。

本發(fā)明中，所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異堿基序列的引物組還可以包括與前述各引物組序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為50％及以上的引物組，該引物組包括但不限于引物組C：

引物組C

上游外引物F3_C：5’-AATGGAATTTGAACCTCGTC-3’(SEQ ID NO：9)；

下游外引物B3_C：5’-CCGTTTTGATTTCGATGGT-3’(SEQ ID NO：10)(與引物B3_A 5’-TTTCGATGGTGTAATCATCC-3’同源性50％)；

上游內(nèi)引物FIP_C：5’-ATCATTGCCAGAGTGGAACTTAGCGTGTGGATAACGAAA-3’(SEQ ID NO：11)；

下游內(nèi)引物BIP_C：5’-GTGGTATGGACGTTCAATCGTTAAAGAGACCAGAGGTTCAA-3’(SEQ ID NO：12)。

本發(fā)明方法中，所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列的引物組可以包含或不包含環(huán)引物。所述環(huán)引物可以是一條或多條，包括引物L(fēng)F和/或LB。所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列的引物組為引物組C’；或與所述引物組C’序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為50％及以上的引物組之任意一組：

引物組C’：

上游外引物F3_C：5’-AATGGAATTTGAACCTCGTC-3’；

下游外引物B3_C：5’-CCGTTTTGATTTCGATGGT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_C：5’-ATCATTGCCAGAGTGGAACTTAGCGTGTGGATAACGAAA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_C：5’-GTGGTATGGACGTTCAATCGTTAAAGAGACCAGAGGTTCAA-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_C：5’-GCGCAAAGTGAAACGCAT-3’(SEQ ID NO：13)；

和/或，下游環(huán)引物L(fēng)B_C：5’-AGAATCGGCGGATTTTAAAGGG-3’(SEQ ID NO：14)。

在具體實(shí)施方案中，例如，上述引物組C’中，可以只包含一條上游環(huán)引物，或只包含一條下游環(huán)引物，或同時(shí)包含一條上游環(huán)引物和一條下游環(huán)引物。

本發(fā)明方法中，在一具體實(shí)施方案(含環(huán)引物)中，所述恒溫?cái)U(kuò)增的酶反應(yīng)體系為：1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜堿。在另一具體實(shí)施方案(不含環(huán)引物)中，所述恒溫?cái)U(kuò)增的酶反應(yīng)體系為：1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜堿。環(huán)引物有助于提高反應(yīng)效率。例如，1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液可以選用1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液中的MgSO₄和酶反應(yīng)體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發(fā)明方法中，所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)棰?0～65℃孵育10～90min，優(yōu)選地為10～60min；②80℃終止反應(yīng)2～20min。本發(fā)明不限制通過(guò)其他適宜反應(yīng)程序來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明檢測(cè)方法。

本發(fā)明方法中，檢測(cè)方法包括但不限于電泳檢測(cè)、濁度檢測(cè)或顯色檢測(cè)等。所述電泳檢測(cè)，優(yōu)選為凝膠電泳檢測(cè)法，可以是瓊脂糖凝膠，也可以是聚丙烯酰胺凝膠。電泳檢測(cè)結(jié)果中，如電泳圖呈現(xiàn)特征性階梯狀條帶，則待測(cè)樣品呈霍亂弧菌O1群陽(yáng)性，含有霍亂弧菌O1群；如電泳圖不呈現(xiàn)特征性階梯狀條帶，則待測(cè)樣品呈霍亂弧菌O1群陰性。所述濁度檢測(cè)，是用肉眼觀(guān)察或濁度儀檢測(cè)濁度，檢測(cè)管出現(xiàn)明顯混濁，則待測(cè)樣品呈霍亂弧菌O1群陽(yáng)性，含有霍亂弧菌O1群；如未見(jiàn)混濁，則待測(cè)樣品為霍亂弧菌O1群陰性。也可以經(jīng)離心后肉眼觀(guān)察反應(yīng)管底是否有沉淀，若反應(yīng)管底有沉淀，則待測(cè)樣品呈霍亂弧菌O1群陽(yáng)性，含有霍亂弧菌O1群；如反應(yīng)管底沒(méi)有沉淀，則待測(cè)樣品呈霍亂弧菌O1群陰性。

所述顯色檢測(cè)，是在反應(yīng)管中加入顯色劑，包括但不限于鈣黃綠素(50μM)或SYBR Green I(30-50×)，或羥基萘酚藍(lán)(即HNB，120-150μM)。當(dāng)采用鈣黃綠素或SYBR Green I作為顯色劑時(shí)，如反應(yīng)后顏色為橙色，則待測(cè)樣品為霍亂弧菌O1群陰性；如反應(yīng)后顏色為綠色，則待測(cè)樣品為霍亂弧菌O1群陽(yáng)性，含有霍亂弧菌O1群。當(dāng)采用羥基萘酚藍(lán)作為顯色劑時(shí)，如反應(yīng)后顏色為紫羅蘭色，則待測(cè)樣品為霍亂弧菌O1群陰性；如反應(yīng)后顏色為天藍(lán)色，則待測(cè)樣品為霍亂弧菌O1群陽(yáng)性。所述顯色檢測(cè)，除了上述通過(guò)肉眼觀(guān)察反應(yīng)結(jié)果外，也可以通過(guò)檢測(cè)儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)或終點(diǎn)檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，通過(guò)合理的設(shè)定陰性反應(yīng)的閾值，當(dāng)待測(cè)樣品反應(yīng)的結(jié)果低于或等于該閾值時(shí)，則待測(cè)樣品為霍亂弧菌O1群陰性；當(dāng)待測(cè)樣品反應(yīng)的結(jié)果大于該閾值時(shí)，則待測(cè)樣品為霍亂弧菌O1群陽(yáng)性。所述檢測(cè)儀器包括但不限于熒光分光光度計(jì)、熒光定量PCR儀、恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀和Genie II等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)等。

所述顯色檢測(cè)中，若采用鈣黃綠素或羥基萘酚藍(lán)作為顯色劑，可以在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)之前加入，也可以在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)完成之后加入，優(yōu)選地為恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)之前加入，可以有效的減少反應(yīng)污染的可能性。若采用SYBR Green I作為顯色劑，則在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)完成之后加入。若采用鈣黃綠素作為顯色劑，則在酶反應(yīng)體系中加入50μM鈣黃綠素的同時(shí)，加入0.6-1mM[Mn²⁺]，例如，0.6-1mM的MnCl₂。

本發(fā)明還提供了用于恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群菌株的方法中的引物。所述引物包括能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異堿基序列的引物組，其包括但不限于，所述引物的序列為GI號(hào)為15640032的霍亂弧菌O1群基因組的170082～171001bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈的一部分。

其中，所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列的引物組選自以下各引物組之任意一組，或選自與所述各引物組序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為50％及以上的任一引物組。其中，所述引物組包括但不限于以下引物組A～B之任意一個(gè)引物組。所述與前述引物組序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為50％及以上的引物組包括但不限于引物組C。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-CCACTTATTCGCTTTACACA-3’；

下游外引物B3_A：5’-TTTCGATGGTGTAATCATCC-3’；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-GCAAAGTGAAACGCATGGTTGGAATTTGAACCTCGTCTG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-GTGGTATGGACGTTCAATCGTCAGAGGTTCAAAAATCCCTT-3’；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-ATCCGCCAGATGTGCGAT-3’；

下游外引物B3_B：5’-GGGAATCCAGATCCCTAGTTTG-3’；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-GCGGATCGGTAAACAGCTGCTCCGTTGGGGTCATGCAGATG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-TGCCTGAATTTACAGGCTTACGCGATCGCCAACCCAAGTTGG-3’；

引物組C：

上游外引物F3_C：5’-AATGGAATTTGAACCTCGTC-3’；

下游外引物B3_C：5’-CCGTTTTGATTTCGATGGT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_C：5’-ATCATTGCCAGAGTGGAACTTAGCGTGTGGATAACGAAA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_C：5’-GTGGTATGGACGTTCAATCGTTAAAGAGACCAGAGGTTCAA-3’。

本發(fā)明用于所述恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群方法中的引物中，所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列的引物組還可以包含或不包含一條或多條環(huán)引物；所述環(huán)引物為L(zhǎng)F和/或LB。所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列的引物組為引物組C’；或選自與所述引物組C’序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為50％及以上的引物組之任意一組：

引物組C’：

上游外引物F3_C：5’-AATGGAATTTGAACCTCGTC-3’；

下游外引物B3_C：5’-CCGTTTTGATTTCGATGGT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_C：5’-ATCATTGCCAGAGTGGAACTTAGCGTGTGGATAACGAAA-3’；

下游內(nèi)引物BIP_C：5’-GTGGTATGGACGTTCAATCGTTAAAGAGACCAGAGGTTCAA-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_C：5’-GCGCAAAGTGAAACGCAT-3’；

和/或，下游環(huán)引物L(fēng)B_C：5’-AGAATCGGCGGATTTTAAAGGG-3’。

在具體實(shí)施方案中，上述引物組C’中，可以只包含一條上游環(huán)引物，或只包含一條下游環(huán)引物，或同時(shí)包含一條上游環(huán)引物和一條下游環(huán)引物。在一具體實(shí)施方案中，所述引物分別為FIP、BIP、F3、B3、LF和LB所示的引物或與前述引物序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條引物同源性為50％及以上的引物。

本發(fā)明還提供一種用于上述恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群菌株方法中的試劑盒，其包括所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異堿基序列的引物組。本發(fā)明試劑盒中，所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列的引物組，包括但不限于以基因組(GI號(hào):15640032)的170082～171001bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈的一部分作為所述引物序列；所述引物包括但不限于所述引物組A、引物組B之任意一個(gè)引物組等。還包括但不限于以與前述引物序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為50％及以上的引物組作為引物；包括但不限于引物組C等。

本發(fā)明試劑盒中，所述能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群基因組特異性堿基序列的引物組可以包含或不包含一條或多條環(huán)引物；環(huán)引物作為可選組分。所述環(huán)引物為L(zhǎng)F和/或LB。包含環(huán)引物L(fēng)F和/或LB的引物組包括但不限于引物組C’等。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒中可以包含0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB環(huán)引物。在一具體實(shí)施方案中，引物組的序列分別為FIP、BIP、F3、B3、LF和LB所示的引物、或與前述序列或其互補(bǔ)鏈序列單條引物同源性為50％及以上的引物。

本發(fā)明試劑盒中，還包括Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP溶液、Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)和甜菜堿中的一種或多種。在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒酶反應(yīng)體系包含1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L的甜菜堿。例如，1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液可以選用1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液中的MgSO₄和酶反應(yīng)體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發(fā)明試劑盒中，還包含陽(yáng)性對(duì)照模板。在一具體實(shí)施方案中，所述陽(yáng)性對(duì)照模板包括但不限于霍亂弧菌O1群的全基因組DNA、部分基因組DNA，或包含霍亂弧菌O1群全基因組DNA或部分基因組DNA的載體。

本發(fā)明試劑盒中，還包含陰性對(duì)照模板，所述陰性對(duì)照模板包括但不限于雙蒸水。

本發(fā)明試劑盒中，還包含顯色劑，顯色劑包括但不限于鈣黃綠素，SYBR Green I或羥基萘酚藍(lán)。當(dāng)顯色劑為鈣黃綠素時(shí)，試劑盒中還包含[Mn²⁺]，例如，MnCl₂。

本發(fā)明試劑盒中，還包含雙蒸水。

本發(fā)明試劑盒中，還包含核酸抽提試劑。

本發(fā)明還提出了一種載體，所述載體包含選自引物組A～B、C、C’之任意一組引物。該載體由于包含了具有霍亂弧菌O1群特異性的DNA序列，因此可應(yīng)用于微生物分類(lèi)學(xué)、比較基因組學(xué)、進(jìn)化等研究領(lǐng)域，以及微生物檢測(cè)等應(yīng)用領(lǐng)域。該載體可以是但不限于質(zhì)粒載體(如pBR322、pUC18、pUC19、pBluescript M13、Ti質(zhì)粒等)、病毒載體(如λ噬菌體等)和人造染色體載體(如細(xì)菌人造染色體BAC、酵母人造染色體YAC等)。例如，包含引物組A之任意一條引物的載體pBR322-A、包含引物組B之任意一條引物的載體pBR322-B、……包含引物組C’之任意一條引物的載體pBR322-C’等。包含引物組A之任意一條引物的載體λ噬菌體-A、包含引物組B之任意一條引物的載體λ噬菌體-B、……包含引物組C’之任意一條引物的載體λ噬菌體-C’等。

本發(fā)明還提出了選自引物組A～B、C、C’之任意一組的引物在恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述試劑盒在恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述載體在恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群中的應(yīng)用。

本發(fā)明為食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域提供了一種簡(jiǎn)單快速靈敏的檢測(cè)霍亂弧菌O1群的方法、引物/引物組、檢測(cè)試劑/試劑盒，對(duì)我國(guó)的食品安全具有較大意義。本發(fā)明有益效果包括：采用本發(fā)明霍亂弧菌O1群檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果判定簡(jiǎn)單、操作便捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)。與目前常用檢測(cè)方法相比，本發(fā)明采用的恒溫?cái)U(kuò)增法，可以在恒溫條件下進(jìn)行，只需采用簡(jiǎn)單的恒溫裝置，不需要PCR實(shí)驗(yàn)中的昂貴儀器，不需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)等步驟，因而，非常適于廣泛應(yīng)用于社會(huì)各界包括基層食品安全檢測(cè)部門(mén)推廣使用，即使在分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)知識(shí)和技能基礎(chǔ)相對(duì)不足的環(huán)境下也可充分應(yīng)用?；诒绢I(lǐng)域常識(shí)可將上述各優(yōu)選條件進(jìn)行任意組合，均屬本發(fā)明保護(hù)范圍。

附圖說(shuō)明

圖1表明本發(fā)明實(shí)施例7霍亂弧菌O1群恒溫檢測(cè)方法的特異性。

圖2表明本發(fā)明實(shí)施例8霍亂弧菌O1群檢測(cè)方法的靈敏度。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書(shū)為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專(zhuān)門(mén)提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。

實(shí)施例1-6霍亂弧菌O1群恒溫反應(yīng)體系和檢測(cè)方法

按照以下(1)～(3)步驟進(jìn)行檢測(cè)：

(1)基因組DNA的提取

用于檢測(cè)的霍亂弧菌O1群菌種來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，編號(hào)CGMCC1.8676。取1mL細(xì)菌培養(yǎng)物使用北京天根生物工程公司的細(xì)菌核酸提取試劑盒提取基因組DNA，DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.8，濃度為30.4ng/μL。

(2)以待測(cè)霍亂弧菌O1群基因組DNA為模板，分別采用自配的試劑盒(見(jiàn)表2，表3)，并按照表3中所述條件，配制反應(yīng)體系，以霍亂弧菌O1群特異性擴(kuò)增引物組為引物，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。實(shí)施例1～6中的引物分別為引物組A，B，C，C’(2條環(huán)引物)，C’(1條環(huán)引物)，B。

(3)按照表3中所述條件，通過(guò)電泳檢測(cè)、濁度檢測(cè)或顯色檢測(cè)，進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果確認(rèn)。

由表3可以看出，本發(fā)明檢測(cè)方法及其所采用的引物組及反應(yīng)體系能夠很好地對(duì)霍亂弧菌O1群特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增并得到檢測(cè)結(jié)果。此外，當(dāng)采用檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，縮短反應(yīng)時(shí)間至10min時(shí)也有很好的檢測(cè)效果(如實(shí)施例6)。因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于檢測(cè)樣本中是否含有霍亂弧菌O1群。

實(shí)施例7霍亂弧菌O1群特異性檢測(cè)

收集非霍亂弧菌O1群28株(表4和圖1中的1～28)，將這些菌株與霍亂弧菌O1群菌株(表4和圖1中的29)分別進(jìn)行培養(yǎng)，取1mL菌液，采用試劑盒IA，提取細(xì)菌DNA，并參照實(shí)施例1的反應(yīng)體系和條件，分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增(引物組為A)和加入顯色劑觀(guān)察。

其檢測(cè)結(jié)果如表4和圖1所示，圖1中，1-28分別為金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種、表皮葡萄球菌、馬紅球菌、蠟狀芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、單核增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、伊氏李斯特菌、腸沙門(mén)氏菌腸亞種、腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大腸埃希氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌、阪崎克羅諾腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和弗氏弧菌，NTC：陰性對(duì)照，29：霍亂弧菌O1群。圖1中，僅有霍亂弧菌O1群菌株擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物呈現(xiàn)為亮綠色，為陽(yáng)性結(jié)果，如第29號(hào)管所示。而其他非霍亂弧菌O1群菌株及陰性對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物均呈現(xiàn)為橙色，為陰性結(jié)果，如第1～28號(hào)管以及NTC陰性對(duì)照管所示。

由圖1和表4結(jié)果可以看出，本發(fā)明檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法具有良好的霍亂弧菌O1群菌株特異性，即，只有霍亂弧菌O1群菌株擴(kuò)增陽(yáng)性，其他非霍亂弧菌O1群菌株為陰性。

配制檢測(cè)試劑盒，試劑盒中采用的引物分別為引物組B，引物組C，引物組C’，按上述特異性檢測(cè)方法，分別得到同樣的檢測(cè)結(jié)果，即，非霍亂弧菌O1群菌株及陰性對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物為陰性結(jié)果，霍亂弧菌O1群菌株擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物為陽(yáng)性結(jié)果。

此外，按照表1中所述方法，分別對(duì)引物組A～B，引物組C，引物組C’的特異性進(jìn)行理論分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各條引物最多允許三個(gè)錯(cuò)配的情況下，各引物組最多同時(shí)有兩條引物比對(duì)到非霍亂弧菌O1群菌上，表明各引物組的特異性均較好。

實(shí)施例8靈敏度檢測(cè)

按實(shí)施例1的方法提取細(xì)菌CGMCC 1.8676的DNA，采用試劑盒IB，并按照10ng、2ng、400pg、80pg、16pg、320fg、64fg DNA梯度加入反應(yīng)體系，其他反應(yīng)條件參照表3實(shí)施例1的方法分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增(引物組為A)和加入顯色劑觀(guān)察。如圖2所示，1-7分別為10ng、2ng、400pg、80pg、16pg、320fg和64fg，NTC：陰性對(duì)照。圖2中10ng、2ng、400pg、80pg、16pg處理的反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)為亮綠色，為陽(yáng)性結(jié)果，320fg和64fg處理和陰性對(duì)照的反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)為橙色，為陰性結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果表明，每個(gè)反應(yīng)管中最低含16pg(約相當(dāng)于3600個(gè)細(xì)菌)的DNA時(shí)可被檢出。

按上述檢測(cè)方法，其他步驟及條件同上，分別用引物組B，引物組C，引物組C’，每個(gè)反應(yīng)管中低至16pg～320fg的DNA可被檢出。

實(shí)施例9通用性檢測(cè)

按照表1中所述方法，分別對(duì)引物組A～B，引物組C，引物組C’的通用性進(jìn)行理論分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各引物組的引物區(qū)域與8個(gè)霍亂弧菌O1群菌株1號(hào)染色體(GI號(hào)分別為15640032、147671401、227080237、227116370、229606122、360034408、379739908和384423362)的完全匹配，各引物組理論上可以用于上述8株霍亂弧菌O1群菌株的檢測(cè)，表明各引物組的通用性均較好。

表1霍亂弧菌O1群的現(xiàn)有檢測(cè)方法中引物的通用性和特異性分析

注：a)每個(gè)霍亂弧菌菌株有兩條染色體，將專(zhuān)利中引物F3和B3間的序列與霍亂弧菌O1群的8個(gè)菌株的16個(gè)染色體基因組序列進(jìn)行Bowtie比對(duì)，確定檢測(cè)區(qū)域在GI號(hào)15640032#1/15600771#2基因組中的位置，#1代表該菌株的第一條染色體的基因組序列，#2代表該菌株的第二條染色體的基因組序列。b)將檢測(cè)區(qū)域序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源中進(jìn)行Blast比對(duì)，引物區(qū)域完全匹配為通用性好。c)將檢測(cè)區(qū)域序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源中進(jìn)行Blast比對(duì)，引物區(qū)域匹配程度越高，特異性越差；若引物不能同時(shí)比對(duì)到非霍亂弧菌株上，表明特異性好。

表2恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群的試劑盒種類(lèi)及主要組成成分

表3實(shí)施例1-6本發(fā)明恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群的方法中的反應(yīng)條件及檢測(cè)結(jié)果

表4試驗(yàn)所用菌株及檢測(cè)結(jié)果

注：a)CGMCC：中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，CICC：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CMCC：中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。b)+：陽(yáng)性結(jié)果，-：陰性結(jié)果。