本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建、制備病毒樣顆粒方法。
背景技術(shù)：
：在過(guò)去的30年里，桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)BEVS從未實(shí)現(xiàn)的概念轉(zhuǎn)變成重組蛋白生產(chǎn)的必要系統(tǒng)。由于桿狀病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生物工藝放大明確、重組抗原的表達(dá)水平高、有能力生產(chǎn)復(fù)雜蛋白結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在BEVS系統(tǒng)被廣泛視為疫苗生產(chǎn)的強(qiáng)有力工具；而且已經(jīng)用于7種疫苗、1種癌癥免疫治療重組蛋白(Provenge)和1種基因治療產(chǎn)品(Glybera)的商品化生產(chǎn)中。這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使BEVS成為生產(chǎn)VLP疫苗的理想載體，目前一些基于BEVS的病毒樣顆粒VLP疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)(CHIKVVLP)。現(xiàn)有的常規(guī)做法是將人乳頭瘤病毒HPV18L1蛋白基因克隆到病毒載體上，但通常具有以下缺點(diǎn)：只有單拷貝，蛋白表達(dá)量很低，制備出的病毒樣顆粒量也不大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，本發(fā)明的主要目的在于提供人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建、制備病毒樣顆粒方法，所述方法制備的人類(lèi)乳頭瘤病毒(HPV)病毒樣顆粒產(chǎn)量高，活性好。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質(zhì)粒，是將人乳頭瘤病毒18型L1基因序列經(jīng)酶切后得到的兩段基因插入到表達(dá)載體中構(gòu)建而成，所述人乳頭瘤病毒18型L1基因序列根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞偏愛(ài)密碼子優(yōu)化，所述優(yōu)化后的人乳頭瘤病毒18型L1基因序列如SEQIDNO:1所示。人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，所述方法包括如下步驟：(1)根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞偏愛(ài)密碼子對(duì)野生型HPV18L1氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，對(duì)優(yōu)化后的含所述HPV18L1基因的兩段序列分別進(jìn)行雙酶切后得到兩段基因，將所述兩段基因分別克隆到質(zhì)粒pUC57中，分別命名為pUC57-HPV18L1-1和pUC57-HPV18L1-2；(2)酶切所述pUC57-HPV18L1-1和pFastBacDUAL，回收HPV18L1基因和pFastBacDUAL片段，并將兩片段連接，轉(zhuǎn)化，篩選，獲得重組質(zhì)粒pL1；(3)酶切所述pUC57-HPV18L1-2和所述質(zhì)粒pL1，回收HPV18L1片段和pL1，將兩片段連接，轉(zhuǎn)化，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHPV18L1-DUAL；(4)將所述重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHPV18L1-DUAL轉(zhuǎn)化含有AcBacmid及helper質(zhì)粒的DH10B大腸桿菌中，篩選白色陽(yáng)性菌落，測(cè)序驗(yàn)證，得到重組質(zhì)粒AcHPV18L1。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(1)中，所述酶切的位點(diǎn)分別在所述HPV18L1基因序列的上、下游，所述上游采用EcoRI/HindIII酶切位點(diǎn)，所述下游采用XhoI/KpnI酶切位點(diǎn)。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(2)和(3)中，所述轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化DH5α受體菌，所述篩選為慶大霉素和氨芐青霉素雙抗篩選。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(4)中，所述篩選為在含有IPTG/X-gal以及Kan、Gen、Tet抗生素的LB固體平板中篩選白色陽(yáng)性菌落。人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質(zhì)粒制備病毒樣顆粒方法，所述方法包括如下步驟：a)用所述重組質(zhì)粒構(gòu)建重組桿狀病毒；以及b)用所述重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，表達(dá)所述人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白，形成病毒樣顆粒。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述昆蟲(chóng)細(xì)胞為Sf9細(xì)胞。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述方法還包括：純化所述病毒樣顆粒。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述病毒樣顆粒的形成方法包括：1)用培養(yǎng)液培養(yǎng)HighFiveTn5細(xì)胞，將所述重組桿狀病毒在所述培養(yǎng)液中接種，置于搖床懸浮培養(yǎng)；2)將懸浮培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液離心，棄上清；3)用預(yù)冷的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)復(fù)懸步驟2)的細(xì)胞沉淀，混勻后離心，棄掉上清，清洗；4)用預(yù)冷的PBS復(fù)懸步驟3)的細(xì)胞沉淀，超聲破碎細(xì)胞；5)離心步驟(4)細(xì)胞，取上清，除去大細(xì)胞碎片；6)將步驟5)的上清加入蔗糖溶液，離心，棄上清，沉淀加預(yù)冷的PBS過(guò)夜復(fù)懸并吹打均勻；7)將步驟6)復(fù)懸的樣品與氯化銫溶液等體積混勻，離心；分層收集樣品，取樣進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)為病毒樣顆粒的樣品；作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟1)中，所述細(xì)胞密度為1.5×106cells/mL。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述蔗糖溶液為40％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖水溶液，所述氯化銫溶液為80％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化銫溶液。本發(fā)明的有益效果是：1、本發(fā)明密碼子優(yōu)化是根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞的tRNA的使用頻率，選用高頻使用的密碼子來(lái)表達(dá)人乳頭瘤病毒18亞型L1基因，由此更適應(yīng)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)；另外，本發(fā)明將優(yōu)化后的人乳頭瘤病毒18亞型L1基因序列酶切后得到兩段基因，使用載體構(gòu)建雙拷貝HPVL1基因，轉(zhuǎn)錄出的mRNA是雙份的，表達(dá)量也增大，由此制備出的病毒樣顆粒產(chǎn)量增加。2、本發(fā)明的表達(dá)方法顯著提高了病毒樣顆粒的產(chǎn)量，且產(chǎn)品性質(zhì)均一、穩(wěn)定。附圖說(shuō)明圖1a為本發(fā)明實(shí)施例1中結(jié)合到重組蛋白上抗體的熒光素的熒光示意圖。圖1b為對(duì)比例中結(jié)合到重組蛋白上抗體的熒光素的熒光示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1基因雙拷貝組與對(duì)比例原始序列組的表達(dá)量對(duì)比示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1HPV18病毒樣顆粒的負(fù)染電鏡檢測(cè)觀察圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明通過(guò)提供一種人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建、制備病毒樣顆粒方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中制備的病毒樣顆粒量少的問(wèn)題。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例的主要思路是：人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質(zhì)粒，是將人乳頭瘤病毒18型L1基因序列經(jīng)酶切后得到的兩段基因插入到表達(dá)載體中構(gòu)建而成，所述人乳頭瘤病毒18亞型L1基因序列根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞偏愛(ài)密碼子優(yōu)化，所述優(yōu)化后的人乳頭瘤病毒18亞型L1基因序列如SEQIDNO:1所示。再用所述重組質(zhì)粒構(gòu)建重組桿狀病毒；以及用所述重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，表達(dá)所述人乳頭瘤病毒18型衣殼蛋白，形成病毒樣顆粒。本發(fā)明使用載體構(gòu)建雙拷貝HPVL1基因，轉(zhuǎn)錄出的mRNA是雙份的，表達(dá)量也增大，由此制備出的人類(lèi)乳頭瘤病毒(HPV)病毒樣顆粒產(chǎn)量高，活性好。本發(fā)明實(shí)施例在不改變野生型HPV18L1氨基酸序列的前提下，將每個(gè)氨基酸的密碼子替換成昆蟲(chóng)細(xì)胞中使用頻率最高或次高的，同時(shí)避免局部出現(xiàn)連續(xù)多個(gè)的GC、AT，并保證G+C含量在30％-70％之間。為了讓本發(fā)明之上述和其它目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉數(shù)實(shí)施例，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明所述之人乳頭瘤病毒18型的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建、制備病毒樣顆粒方法。實(shí)施例1密碼子優(yōu)化在不改變野生型HPV18L1氨基酸序列的前提下，將每個(gè)氨基酸的密碼子替換成昆蟲(chóng)細(xì)胞中使用頻率最高或次高的，同時(shí)避免局部出現(xiàn)連續(xù)多個(gè)的GC、AT，并保證G+C含量在30％-70％之間。最后在這段基因上下游分別加上EcoRI/HindIII和XhoI/KpnI酶切位點(diǎn)，將上述兩段基因分別克隆到質(zhì)粒pUC57中，分別命名為pUC57-HPV18L1-1和pUC57-HPV18L1-2。密碼子優(yōu)化及全基因合成均在武漢金開(kāi)瑞完成。如序列表1所示。載體構(gòu)建用EcoRI/HindIII酶切pUC57-HPV18L1-1和pFastBacDUAL，瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收HPV18L1基因和pFastBacDUAL片段，連接，轉(zhuǎn)化DH5α受體菌，經(jīng)慶大霉素和氨芐青霉素雙抗篩選，獲得重組質(zhì)粒pL1。同時(shí)用XhoI/KpnI酶切pUC57-HPV18L1-2和質(zhì)粒pL1，回收，回收HPV18L1片段和pL1，連接，轉(zhuǎn)化DH5α，獲得克隆pHPV18L1-DUAL，克隆提取質(zhì)粒備用。Bacmid制備將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHPV18L1-DUAL轉(zhuǎn)化含有AcBacmid及helper質(zhì)粒的DH10B大腸桿菌中，在含有IPTG/X-gal以及Kan、Gen、Tet抗生素的LB固體平板中篩選白色陽(yáng)性菌落。陽(yáng)性菌落用mini-attTn7位點(diǎn)外的M13上下游引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物理論值為5.5kb，包括引物之間的mini-attTn7位點(diǎn)、轉(zhuǎn)座上去的pFastBacDUAL自身片段以及HPV18L1基因。PCR鑒定結(jié)果表明目的基因已經(jīng)正確轉(zhuǎn)座到Bacmid上，重組Bacmid命名為AcHPV18L1。Bacmid轉(zhuǎn)染1)取10μL鑒定正確的重組Bacmid加入至100μL無(wú)血清培養(yǎng)基中并混勻；2)取10μLCellfectinReagent加入至100μL無(wú)血清培養(yǎng)基中并上下顛倒5-10次混勻；將上述兩種液體輕輕混合，室溫放置30min；3)將Sf9細(xì)胞以5×105cells/mL密度接種細(xì)胞至6孔板，每孔2mL，28℃貼附1h；4)取2mL無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面，并吸棄；5)每孔加入800μL無(wú)血清培養(yǎng)基，再加入含有重組Bacmid和CellfectinReagent的混合液并輕輕旋轉(zhuǎn)六孔板混勻；另一孔細(xì)胞加空Bacmid及CellfectinReagent所用稀釋液作為陰性對(duì)照；6)28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4h；7)上述兩孔分別吸棄上清并加入2mL細(xì)胞維持液，28℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置培養(yǎng)72h；8)顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞變大變圓，胞核變大，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡且顆粒增多的病變現(xiàn)象后，收獲上清液至無(wú)菌1.5mLEP管中，500g離心10min，取上清至一新無(wú)菌EP管，并小量分裝，此即為重組桿狀病毒，分別命名為rBacmidHPV18L1WT、rBacmidHPV18L1-DUAL。置于-70℃冰箱避光保存。重組桿狀病毒制備1)取0.1mL第一代重組桿狀病毒rBacmidHPV18L1-DUAL稀釋于5mL的完全培養(yǎng)基中，加入T25瓶長(zhǎng)滿(mǎn)約70-80％處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞中。輕輕混勻，使病毒液均勻分布；28℃培養(yǎng)；2)鏡下見(jiàn)細(xì)胞核變大，充滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞折光率發(fā)生變化，部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡且顆粒增多，并且開(kāi)始有細(xì)胞出現(xiàn)裂解時(shí)，收獲病毒；3)吸出培養(yǎng)上清，500g離心10min，吸取上清分裝于無(wú)菌凍存管中，1mL/管，此即為含重組病毒的P2代毒種；4)以同樣操作制備重組桿狀病毒的P3代毒種。病毒樣顆粒的大量制備1)培養(yǎng)HighFiveTn5細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度約為1.5×106cells/mL時(shí)，將HPV18重組桿狀病毒以每100mL培養(yǎng)液接種3mL病毒液的比例接種，置于27℃搖床懸浮培養(yǎng)；2)第四天時(shí)收獲細(xì)胞，將細(xì)胞懸液于4℃4000rpm離心30min，棄上清；3)用預(yù)冷的PBS復(fù)懸細(xì)胞沉淀，混勻后于4℃4000rpm離心10min，棄掉上清，共洗兩遍；4)將細(xì)胞用20mL預(yù)冷的PBS復(fù)懸，用超聲破碎儀冰浴條件下以200W13s/次×30次不連續(xù)超聲破碎細(xì)胞；5)4℃12000rpm,1h離心取上清，以除去大細(xì)胞碎片；6)將上清加入40％的蔗糖之上，4℃30000rpm離心3h，棄上清，沉淀加1mL預(yù)冷的PBS過(guò)夜復(fù)懸并吹打均勻；7)將復(fù)懸的樣品與80％氯化銫等體積混勻，4℃40000rpm離心20h；分層收集樣品1mL/層加至EP管中，取樣進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)；8)將免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)為病毒樣顆粒的樣品，置于超速離心管中，加滿(mǎn)PBS并混勻，4℃30000rpm離心3h以置換氯化銫，沉淀用2mLPBS復(fù)懸，即得到初步純化的樣品。對(duì)比例密碼子優(yōu)化在野生型HPV18L1在這段基因上下游分別加上EcoRI/HindIII酶切位點(diǎn)，將上述基因克隆到質(zhì)粒pUC57中，分別命名為pUC57-HPV18L1-wt。全基因合成在武漢金開(kāi)瑞完成。載體構(gòu)建用EcoRI/HindIII酶切pUC57-HPV18L1-wt和pFastBac1，瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收HPV18L1-wt基因和pFastBac1片段，連接，轉(zhuǎn)化DH5α受體菌，經(jīng)慶大霉素和氨芐青霉素雙抗篩選，獲得克隆pHPV18L1-wt，克隆提取質(zhì)粒備用Bacmid制備將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pHPV18L1-wt轉(zhuǎn)化含有AcBacmid及helper質(zhì)粒的DH10B大腸桿菌中，在含有IPTG/X-gal以及Kan、Gen、Tet抗生素的LB固體平板中篩選白色陽(yáng)性菌落。陽(yáng)性菌落用mini-attTn7位點(diǎn)外的M13上下游引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物理論值為5.5kb，包括引物之間的mini-attTn7位點(diǎn)、轉(zhuǎn)座上去的pFastBac1自身片段以及HPV18L1-wt基因。PCR鑒定結(jié)果表明目的基因已經(jīng)正確轉(zhuǎn)座到Bacmid上，重組Bacmid命名為AcHPV18L1-wt。Bacmid轉(zhuǎn)染1)取10μL鑒定正確的重組Bacmid加入至100μL無(wú)血清培養(yǎng)基中并混勻；2)取10μLCellfectinReagent加入至100μL無(wú)血清培養(yǎng)基中并上下顛倒5-10次混勻；將上述兩種液體輕輕混合，室溫放置30min；3)將Sf9細(xì)胞以5×105cells/mL密度接種細(xì)胞至6孔板，每孔2mL，28℃貼附1h；4)取2mL無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面，并吸棄；5)每孔加入800μL無(wú)血清培養(yǎng)基，再加入含有重組Bacmid和CellfectinReagent的混合液并輕輕旋轉(zhuǎn)六孔板混勻；另一孔細(xì)胞加空Bacmid及CellfectinReagent所用稀釋液作為陰性對(duì)照；6)28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4h；7)上述兩孔分別吸棄上清并加入2mL細(xì)胞維持液，28℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置培養(yǎng)72h；8)顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞變大變圓，胞核變大，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡且顆粒增多的病變現(xiàn)象后，收獲上清液至無(wú)菌1.5mLEP管中，500g離心10min，取上清至一新無(wú)菌EP管，并小量分裝，此即為重組桿狀病毒，分別命名為rBacmidHPV18L1WT。置于-70℃冰箱避光保存。余下重組蛋白制備步驟同實(shí)施例1。下述提供若干實(shí)驗(yàn)例，以證實(shí)本發(fā)明實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)及效果，具體如下：實(shí)驗(yàn)例一病毒樣顆粒表達(dá)量1.免疫熒光檢測(cè)目的蛋白將本發(fā)明實(shí)施例1的P3代重組桿狀病毒以MOI＝5接種于生產(chǎn)狀態(tài)良好的sf9細(xì)胞，27℃，培養(yǎng)48h，同時(shí)以對(duì)比例的野毒株為陰性對(duì)照組。以4％多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫放置30min；透化封閉：1)棄去4％多聚甲醛，以0.01MPBS洗細(xì)胞3次，500μL/孔，每次5min；2)加入透化封閉液，200μL/孔，室溫靜置30min；HPV18L1鼠源單抗做為一抗，羊抗鼠Alexa-488作為二抗，熒光顯微鏡下檢測(cè)，接種六組不同重組桿狀病毒的實(shí)驗(yàn)組48h后，在相同細(xì)胞數(shù)目情況下，可見(jiàn)較多的綠色熒光且各組與原始序列有差異，陰性對(duì)照組則看不到熒光。初步判斷，本發(fā)明實(shí)施例1雙拷貝組的熒光數(shù)多于對(duì)比例原始序列組熒光數(shù)。見(jiàn)圖1a和1b的對(duì)比。2.ELISA法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量在6孔板里培養(yǎng)適合濃度的sf9細(xì)胞(1×106/孔)，用第三代重組桿狀病毒感染細(xì)胞，選取每組最佳MOI值＝5，表達(dá)時(shí)間為96小時(shí)，每個(gè)樣品做6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置未感染的sf9細(xì)胞作為陰性對(duì)照。1)樣品處理:取六孔板內(nèi)的細(xì)胞，用PBS洗三次，用PBS液反復(fù)吹至懸浮后離心，收集細(xì)胞，用500μLPBS液懸浮，反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞破碎，4℃，12000rpm，離心10min。2)取上述上清，用PBS遞倍稀釋至合適濃度，以同樣稀釋度的樣品，加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，37℃包被2h。3)洗板3次，用含1％BSA的PBS溶液封閉1h。4)洗板3次，加入含0.1％BSA的PBS稀釋500倍HPV18L1單抗，每孔100μL，室溫反應(yīng)2h。5)洗板3次，加入用0.1％BSA的PBS稀釋5000倍的HRP一羊抗小鼠IgG，每孔100μL,室溫反應(yīng)2h。6)洗板4次，加入顯色底物A和顯色底物B各50μL，37℃孵育10分鐘，加入100μL硫酸(2M)終止反應(yīng)。7)酶標(biāo)儀上450nm、570nm波長(zhǎng)下讀取光密度值。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HPV18L1蛋白含量。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索合適的包被濃度1μg/mL，包被體積為100μL，結(jié)果如表1所示。A列為對(duì)比例原始序列組，F(xiàn)為本發(fā)明實(shí)施例1基因雙拷貝組。表1AF10.5671.64520.5841.65230.5681.58640.5591.66650.5691.65960.5161.568再根據(jù)表1中各組的平均值作柱狀圖，如圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例1基因雙拷貝組相對(duì)于對(duì)比例原始序列組，目的蛋白提高了1.5-2倍。實(shí)驗(yàn)例二病毒樣顆粒驗(yàn)證和免疫原性分析1.電鏡檢測(cè)1)將樣品混勻后取1滴，滴加到銅網(wǎng)上，1min后用濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸干；2)在樣品上滴加1滴磷鎢酸染色液(用蒸餾水配成2％的磷鎢酸溶液，以1mol/L的氫氧化鈉或氫氧化鉀調(diào)整pH6.8，濾過(guò)后置4℃，可長(zhǎng)期使用)；3)90s后用濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸干；4)將制備好的負(fù)染色樣品送往中科院武漢病毒研究所，電子顯微鏡觀測(cè)并照像。圖3為負(fù)染電鏡檢測(cè)觀察的本發(fā)明實(shí)施例1得到的HPV18病毒樣顆粒。2.ELISA檢測(cè)IgG抗體表2中BALB/c小鼠免疫程序如下：于第0d、14d、28d小鼠眼眶采血，第35d將小鼠眼眶采血后處死，血清于37℃水浴中孵育1h，4℃過(guò)夜，次日4℃，7000rpm，離心10min取上層血清，凍存于-70℃冰箱中待用。a.抗原包被1)將Merck公司的HPV18VLPs稀釋為2μg/mL，100μL/孔加到96孔板，4℃下孵育過(guò)夜；2)倒掉包被液，用洗液洗去未結(jié)合的抗原，洗滌3-5次。加入封閉液(200μL/孔)，4℃下孵育過(guò)夜或者37℃下放置1-2小時(shí)；3)倒掉封閉液，干燥箱中37℃烤干(3-4小時(shí))，分裝于密封袋，4℃保存。b.血清抗體效價(jià)檢測(cè)1)用樣品稀釋液將待檢測(cè)血清倍比稀釋(1:100-1:1000,000)，混勻后100μL/孔加到包被有抗原的96孔板，37℃孵育1小時(shí)。2)洗板機(jī)上用洗液洗滌5次，洗去未結(jié)合的抗體，加入HRP-羊抗小鼠IgG(1:4,000)，37℃孵育30分鐘。3)洗板機(jī)上用洗液洗滌5次，加入顯色底物A和顯色底物B各50μL，37℃孵育10分鐘，加入100μL2M硫酸終止反應(yīng)。4)酶標(biāo)儀上450nm波長(zhǎng)下讀取光密度值。OD450值≥2倍平均空白OD值±3SD判為陽(yáng)性。c.抗血清檢測(cè)結(jié)果將對(duì)照組、低劑量組(4μg)、中劑量組(8μg)和高劑量(18μg)組分別于第0、14d、28d和35d小鼠眼眶采血，樣品處理后進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。小鼠IgG抗體水平檢測(cè)在不同劑量組抗體水平隨免疫劑量升高而升高，隨免疫時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，高劑量組第5周抗體滴度達(dá)到最高值(GMT，15000-20000)。3.抗體中和活性實(shí)驗(yàn)將含有重組桿狀病毒rBacmidHPV18L1-DUAL的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清用PBS一倍稀釋后孵育6孔培養(yǎng)板中哺乳動(dòng)物細(xì)胞293FT(1×106/well)，600g水平離心1h后更換為DMEM完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2h后加入CsCl密度梯度離心純化的pN31-EGFP質(zhì)粒和脂質(zhì)體lipofectMINE2000的混合物，12h后換液，48h后收集細(xì)胞，用反復(fù)凍融的方法收集細(xì)胞的裂解上清，為假病毒。1)將293FT細(xì)胞鋪于96孔板中，每孔細(xì)胞1.5×104cells/100μL，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h；2)用DMEM中和培養(yǎng)基將假病毒分別按照MOI＝0.01進(jìn)行稀釋?zhuān)?)用DMEM中和培養(yǎng)基將待測(cè)血清作系列稀釋?zhuān)?：1000為起始稀釋度做2倍倍比稀釋?zhuān)♂?0個(gè)梯度；4)在96孔稀釋板上，每孔加入60μL抗血清稀釋液及60μL假病毒稀釋液，假病毒液和血清混勻后每種組均做雙復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔為中和培養(yǎng)基組、空白對(duì)照為培養(yǎng)基組；5)將稀釋板置于冰上孵育1h；6)從稀釋板各孔中吸取100μL的假病毒抗血清混合物，加入鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板相應(yīng)孔內(nèi)，混合均勻；7)將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)72h；8)將消化后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，500g離心10min棄上清，用含5％胎牛血清的多聚甲醛重新懸浮。經(jīng)200目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算感染抑制率。公式如下：感染抑制率(％)＝(陰性對(duì)照組的熒光細(xì)胞比值－血清組的熒光細(xì)胞比值)/陰性對(duì)照組的熒光細(xì)胞比值×100％。本發(fā)明實(shí)施例1雙拷貝組純化樣品免疫動(dòng)物后中和抗體結(jié)果顯示，HPV18L1VLPs高劑量(16μg)組有較好的抗體滴度并能產(chǎn)生中和抗體。4.免疫原性分析-細(xì)胞免疫a.小鼠免疫取加強(qiáng)免疫后第7天(即5周)的小鼠，分離脾單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度3.5×106cells/mL，即為淋巴細(xì)胞懸液，進(jìn)行共刺激培養(yǎng)：1)將每只小鼠分離的脾淋巴細(xì)胞加入到24孔板中，每孔加1mL；2)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組各加2μg的Merck苗共培養(yǎng)；PMA做陽(yáng)性對(duì)照；3)將24孔板放入37℃，5％CO2孵箱中共培養(yǎng)72h。b.脾單個(gè)核細(xì)胞分離1)取加強(qiáng)免疫后第7天(即5周)的小鼠，摘眼球取血，拉頸處死，75％乙醇浸泡5分鐘；2)無(wú)菌操作下剪開(kāi)腹部皮膚，暴露腹膜，于脾臟處剪開(kāi)腹膜，取出脾臟，除去脂肪及結(jié)締組織，剪成數(shù)段，放入盛有約2mL無(wú)血清小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液的研磨管中；3)將研磨液滴加到200目的尼龍網(wǎng)上，篩網(wǎng)濾過(guò)液轉(zhuǎn)移到已加入5mL淋巴細(xì)胞分離液的15mL離心管中；4)常溫800g，離心30min；5)離心后在1640培養(yǎng)基和淋巴細(xì)胞分離液層之間可以清晰的看到一層灰白色的細(xì)胞，吸出該層細(xì)胞至新的15mL離心管中。離心管內(nèi)加入10mL1640培養(yǎng)基，充分混勻，800g離心10min；6)棄去上清，使用1640培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度3.5×106cells/mL，即為淋巴細(xì)胞懸液，備用。c.共刺激培養(yǎng)1)將每只小鼠分離的脾淋巴細(xì)胞加入到24孔板中，每孔加1mL；2)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組各加2μg的Merck苗共培養(yǎng)；PMA做陽(yáng)性對(duì)照；3)將24孔板放入37℃，5％CO2孵箱中共培養(yǎng)72h。d.ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子細(xì)胞因子測(cè)IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10測(cè)定：實(shí)驗(yàn)于24孔反應(yīng)板進(jìn)行，每孔加入脾淋巴細(xì)胞4×106個(gè)，終體積為2mL，實(shí)驗(yàn)孔加VLP溶液20μL(終濃度為10μg/mL)，陽(yáng)性對(duì)照孔加ConA溶液20μL(終濃度為25μg/m1)，陰性對(duì)照孔以1640培養(yǎng)基代替，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃孵育，72h吸取培養(yǎng)上清，離心，上清用于細(xì)胞因子測(cè)定。雙抗體夾心ELISA法測(cè)定測(cè)IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。分離各組小鼠的脾淋巴細(xì)胞，將每只小鼠分離所得的細(xì)胞調(diào)整為3.6×106cells/mL，每組加入2μgMerck苗共培養(yǎng)72h后收獲，根據(jù)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒操作檢測(cè)IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-4各細(xì)胞因子指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組。上述本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案，至少具有如下的技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明密碼子優(yōu)化是根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞的tRNA的使用頻率，選用高頻使用的密碼子來(lái)表達(dá)人乳頭瘤病毒18型L1基因，由此更適應(yīng)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)；另外，本發(fā)明將優(yōu)化后的人乳頭瘤病毒18亞型L1基因序列酶切后得到兩段基因，使用載體構(gòu)建雙拷貝HPVL1基因，轉(zhuǎn)錄出的mRNA是雙份的，表達(dá)量也增大，由此制備出的病毒樣顆粒產(chǎn)量增加。2、本發(fā)明的表達(dá)方法顯著提高了病毒樣顆粒的產(chǎn)量，且產(chǎn)品性質(zhì)均一、穩(wěn)定。盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢華美生物工程有限公司<120>人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建、制備病毒樣顆粒方法<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1518<212>DNA<213>Humanpapillomavirustype16<400>1atgtctttgtggttgccatctgaggctactgtttacttgccaccagttccagtttctaag60gttgtttctactgacgagtacgttgctagaactaacatttactaccacgctggtacttct120agattgttggctgttggtcacccatacttcccaattaagaagccaaacaacaacaagatt180ttggttccaaaggtttctggtttgcaatacagagttttcagaatccacttgccagaccca240aacaagttcggtttcccagacacttctttctacaacccagacactcaaagattggtttgg300gcttgtgttggtgttgaggttggtagaggtcaaccattgggtgttggtatttctggtcac360ccattgttgaacaagttggacgacactgagaacgcttctgcttacgctgctaacgctggt420gttgacaacagagagtgtatttctatggactacaagcaaactcaattgtgtttgattggt480tgtaagccaccaattggtgagcactggggtaagggttctccatgtactaacgttgctgtt540aacccaggtgactgtccaccattggagttgattaacactgttattcaagacggtgacatg600gttcacactggtttcggtgctatggacttcactactttgcaagctaacaagtctgaggtt660ccattggacatttgtacttctatttgtaagtacccagactacattaagatggtttctgag720ccatacggtgactctttgttcttctacttgagaagagagcaaatgttcgttagacacttg780ttcaacagagctggtactgttggtgagaacgttccagacgacttgtacattaagggttct840ggttctactgctaacttggcttcttctaactacttcccaactccatctggttctatggtt900acttctgacgctcaaattttcaacaagccatactggttgcaaagagctcaaggtcacaac960aacggtatttgttggggtaaccaattgttcgttactgttgttgacactactagatccact1020aacatgtctttgtgtgctgctatttctacttctgagactacttacaagaacactaacttc1080aaggagtacttgagacacggtgaggagtacgacttgcaattcattttccaattgtgtaag1140attactttgactgctgacgttatgacttacattcactctatgaactctactattttggag1200gactggaacttcggtttgcaaccaccaccaggtggtactttggaggacacttacagattc1260gttactcaagctattgcttgtcaaaagcacactccaccagctccaaaggaggacgaccca1320ttgaagaagtacactttct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