本發(fā)明涉及生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的，涉及一株抗紫外線的高毒力金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：小菜蛾、紅火蟻等害蟲可危害多種作物，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長期的化學(xué)農(nóng)藥使用造成害蟲抗藥性的產(chǎn)生，防治更加困難。在抗藥性小菜蛾、紅火蟻等害蟲的防治上，多采用傳統(tǒng)的大量使用化學(xué)農(nóng)藥的化學(xué)防治方法，但是，小菜蛾、紅火蟻等害蟲對(duì)常用的大多數(shù)化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了高水平的抗藥性，而且紅火蟻生活在土壤中，化學(xué)農(nóng)藥較難防治。生物防治是病害防治的較理想、環(huán)保的方法。在生物農(nóng)藥防治方面，有研究顯示，金龜子綠僵菌可用于防治小菜蛾和紅火蟻。但是，我國現(xiàn)有用于防治小菜蛾、紅火蟻等害蟲的金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）菌株的毒力不強(qiáng)，而且對(duì)紫外線的耐受能力差，因而防治效果差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中抗藥性小菜蛾、紅火蟻等害蟲防治技術(shù)的的缺陷和不足，提供一株抗紫外線的高毒力金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae(Metsch.)Sorokin誘變菌株MaUV-1及其在防治抗藥性小菜蛾、紅火蟻等害蟲方面的應(yīng)用。本發(fā)明的金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1是在野生菌株的基礎(chǔ)上通過紫外線誘變、篩選而獲得，具有高毒力，而且具有較強(qiáng)的抗紫外線能力。本發(fā)明的目的是提供一株抗紫外線的高毒力金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1。本發(fā)明的另一目的是提供上述金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1在防治小菜蛾和/或紅火蟻等害蟲方面的應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的是提供一種防治小菜蛾和/或紅火蟻等害蟲的生物制劑，所述制劑含有金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的。一株抗紫外線的高毒力金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）誘變株MaUV-1，該菌株于2016年5月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），菌種保藏號(hào)：CCTCCNO：M2016250；分類命名號(hào)為：MetarhiziumanisopliaeMaUV-1；保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。所述金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1是對(duì)野生型金龜子綠僵菌進(jìn)行紫外線照射誘變，從誘變菌株中篩選而純化獲得的，所述野生型金龜子綠僵菌是從西藏地區(qū)被自然侵染的金龜子幼蟲上分離得到的。所述金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1屬肉座菌目，綠僵菌屬。本發(fā)明所述金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1的形態(tài)特征如下：在查氏培養(yǎng)基上菌落呈絨毛狀至棉絮狀，開始時(shí)為白色，產(chǎn)孢時(shí)呈黃綠色，菌落為不規(guī)則的放射狀，菌落背面呈黃綠色，菌絲具有分隔和分枝，透明，直徑1.5～2.0μm，分生孢子梗很難與菌絲區(qū)分開，直徑2.0μm，其末端產(chǎn)生瓶形小梗，（8.0～16.4）μm×（1.5～2.0）μm，從瓶梗的末端以向基式連續(xù)形成長串鏈的分生孢子。分生孢子長橢圓形，兩端鈍圓或鈍截形，大小變化甚大，（5.0～7.3）μm×（2.0～3.2）μm。上述金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1對(duì)抗藥性小菜蛾、紅火蟻等多種害蟲具有很好的防效，而且抗紫外線能力強(qiáng)，應(yīng)用更方便、廣泛、持久。因此，所述金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1可應(yīng)用于制備防治抗藥性小菜蛾、紅火蟻等害蟲的藥物。由上述的金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1體內(nèi)提取得到的可防治小菜蛾和/或紅火蟻的毒素，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，所述防治小菜蛾和/或紅火蟻的毒素的提取方法為：將金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1的分生孢子分別接入查氏培養(yǎng)液中培養(yǎng)發(fā)酵后，除去菌絲獲得發(fā)酵液；將發(fā)酵液與等體積的乙酸乙酯（1:1）混合，收集有機(jī)相并濃縮（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A，上海亞榮生化儀器廠）獲得到粗毒素。另外，一種包含有所述金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1或上述毒素的防治抗藥性小菜蛾和/或紅火蟻等害蟲的生物制劑，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，所述生物制劑中金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1孢子懸浮液的濃度為1×105~1×108孢子/mL。更優(yōu)選地，所述生物制劑中金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1孢子懸浮液的濃度為1×107孢子/mL。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明公開的金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1是通過對(duì)野生菌株進(jìn)行紫外線誘變、從誘變菌株中篩選而獲得，經(jīng)侵染生物學(xué)研究和室內(nèi)生物測定，該誘變菌株MaUV-1對(duì)抗藥性小菜蛾、紅火蟻等害蟲具有較強(qiáng)的侵染殺蟲效果，防效大大提升，而且具有很好的抗紫外線能力。與野生菌株相比，誘變株MaUV-1對(duì)小菜蛾的毒力提高了75%，對(duì)紅火蟻的毒力提高了39%~78%。而且測試顯示，在紫外線照射條件下，該誘變菌株MaUV-1的孢子萌發(fā)率比野生菌株提高了70%~189%，即表明誘變菌株MaUV-1的抗紫外線能力提高了70～189%。該菌株為中國本土的菌株，并非從國外引進(jìn)，能適應(yīng)本地的自然環(huán)境，應(yīng)用方便且范圍廣泛。該金龜子綠僵菌是一種昆蟲病原真菌，作為一種活體生物農(nóng)藥，具有不同于現(xiàn)有化學(xué)殺蟲劑的全新的作用機(jī)理、對(duì)環(huán)境無污染、無殘留的特征，適應(yīng)了有機(jī)食品生產(chǎn)的要求。附圖說明圖1為金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1在Czapek培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖；A：菌落正面；B：菌落背面。圖2為金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1菌絲和分生孢子形態(tài)。圖3為金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1和野生型金龜子綠僵菌在PDA培養(yǎng)基上26℃培養(yǎng)的菌株菌落形態(tài)圖；A：菌落正面；B：菌落背面；UV代表金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1，SM04代表野生菌株。圖4為金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1粗毒素的HPLC圖譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例1野生菌株的誘變與分離鑒定1、材料金龜子綠僵菌誘變株是在野生菌株的基礎(chǔ)上誘變而來，野生型金龜子綠僵菌菌株采集于西藏地區(qū)被自然侵染的金龜子（PhylloperthahorticolaL.）幼蟲蟲尸。查氏培養(yǎng)基（Czapek-Dox）：NaNO32g，K2HPO41g，KCl0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，加入水使總體積為1000ml并煮沸。后經(jīng)高壓滅鍋滅菌（121℃，30min）。無菌操作條件：所有器皿和用具須經(jīng)高壓滅鍋滅菌（121℃，30min），接種等操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。培養(yǎng)條件：置于25℃光照（14L：10D）恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到PDA斜面，再轉(zhuǎn)入4℃冰箱貯存。2.野生菌株的誘變?nèi)∫欢舛鹊慕瘕斪泳G僵菌野生菌株的分生孢子懸浮液，置于紫外線下照射40分鐘，將照射后的孢子懸浮液涂布在Czapek平板中，倒置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，挑取新產(chǎn)生的單菌落、并轉(zhuǎn)移到新的Czapek平板中培養(yǎng)，獲得共50個(gè)左右的誘變株，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代以上。3.誘變株的初步篩選觀察50個(gè)誘變株的培養(yǎng)特性，從中挑選培養(yǎng)性狀穩(wěn)定、菌絲生長快、菌落直徑大的誘變株8個(gè)置于Czapek平板上培養(yǎng)，待產(chǎn)生分生孢子后放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.誘變株的形態(tài)描述對(duì)誘變株的培養(yǎng)性狀、菌絲、分生孢子和產(chǎn)孢器的形態(tài)進(jìn)行描述。將獲得的8個(gè)分離株接種到Czapek平板上，于25℃條件下培養(yǎng)。3～5天可觀察見到有白色的菌絲長出，菌落呈絨毛狀至棉絮狀，開始時(shí)為白色，產(chǎn)孢時(shí)呈黃綠色，菌落為不規(guī)則的放射狀，菌落背面呈黃綠色，如圖1所示。菌絲具有分隔和分枝，透明，直徑1.5～2.0μm，分生孢子梗很難與菌絲區(qū)分開，直徑2.0μm，其末端產(chǎn)生瓶形小梗，（8.0～16.4）μm×（1.5～2.0）μm，從瓶梗的末端以向基式連續(xù)形成長串鏈的分生孢子。分生孢子長橢圓形，兩端鈍圓或鈍截形，大小變化甚大，（5.0～7.3）μm×（2.0～3.2）μm，如圖2所示。5、金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1的篩選蟲生真菌在遺傳、生態(tài)及生物學(xué)等方面具有多樣性，又存在有準(zhǔn)性生殖現(xiàn)象，同種真菌的不同分離株對(duì)目標(biāo)害蟲的致病力差異顯著，分離株不同，其LD50、LT50可相差數(shù)倍至數(shù)十倍。高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的篩選與獲得，是取得較好防治效果的首要前提。菌株篩選常用的指標(biāo)分別為致病力、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、菌落生長速率。本發(fā)明以這些指標(biāo)為依據(jù)，從金龜子綠僵菌誘變株中篩選優(yōu)勢菌株。（1）供試菌株的處理隨機(jī)挑選經(jīng)誘變、純化后性狀穩(wěn)定的金龜子綠僵菌誘變株A、B、C、D、E、F、G、H共8個(gè)，在Czapek平板于25±0.5℃的恒溫箱（14L：10D）中培養(yǎng)。（2）供試?yán)ハx與寄主植物小菜蛾，將網(wǎng)室中飼養(yǎng)在芥藍(lán)上的小菜蛾成蟲，接種到無蟲的芥藍(lán)幼苗上，產(chǎn)卵12h后，清除成蟲，將芥藍(lán)幼苗置于25±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中，待小菜蛾發(fā)育至2齡若蟲時(shí)待用。芥藍(lán)BrassicacampestrisL.，購自廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所，試驗(yàn)苗均采用4～6片展開葉的盆栽苗。（3）菌落生長直徑和產(chǎn)孢量的測定將8個(gè)誘變株分別配制成1×106孢子/ml的分生孢子懸液，分別取1ml懸液滴入Czapek培養(yǎng)基上，用三角玻璃棒涂勻，待1～2d長出菌絲后用直徑為5mm的打孔器取新鮮菌落，接種于Czapek平板上，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（L:D=14:10）。每個(gè)菌株5次重復(fù)。第12d測定菌落直徑，第14d收集分生孢子用血球計(jì)數(shù)板記數(shù)測定產(chǎn)孢量。具體操作如下：測量菌落直徑，并用直徑為13mm的滅菌打孔器在培養(yǎng)皿中取菌絲生長均勻的菌塊，然后放入加有20ml0.3%吐溫-80無菌水中，用磁力攪拌器使孢子分散，制成孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)、測定產(chǎn)孢量。8個(gè)誘變株和野生菌株的菌落生長直徑和產(chǎn)孢量如表1所示，誘變株的菌落生長直徑與WT（野生菌株）相比差異顯著，其中B誘變株的菌落生長直徑最大，G誘變株的菌落生長直徑最小。生長14d后，所有誘變株與WT相比產(chǎn)孢量差異顯著，其中B誘變株的產(chǎn)孢量最高。表1金龜子綠僵菌8個(gè)誘變株和野生菌株的生長直徑和產(chǎn)孢量菌株菌落生長直徑M±SE(mm)（12d）產(chǎn)孢量（×109孢子/mL）(14d)A48.3±1.2ab2.47±0.12aB53.7±1.6a2.62±0.11aC47.7±0.8ab2.50±0.16aD50.3±0.4ab2.37±0.12aE44.3±0.4b2.10±0.08abF46.3±1.2ab2.13±0.12abG41.3±1.6b1.93±0.12bH47.3±1.2ab2.50±0.04aWT34.7±1.2c0.41±0.02c注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。A、B、C、D、E、F、G和H分別為誘變株，WT為野生菌株。（4）孢子萌發(fā)率的測定將8個(gè)誘變株分別培養(yǎng)14d后，用無菌水收集孢子并制成懸液，用載玻片萌發(fā)法試驗(yàn)。將孢子懸液滴在帶有查氏培養(yǎng)基的無菌載玻片上，置于底部鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在皿內(nèi)滴加3～4滴無菌水保濕（100，RH），培養(yǎng)24h后鏡檢。每個(gè)處理3次重復(fù)。8個(gè)誘變株中，B、E分別與WT野生菌株的孢子萌發(fā)率差異顯著（見表2）。其中B分離株的孢子平均萌發(fā)率最高，E分離株的孢子萌發(fā)率最低。表2金龜子綠僵菌8個(gè)誘變株和野生菌株的孢子萌發(fā)率（24h）誘變株檢測的孢子數(shù)量萌發(fā)率(%)(M±SE)Ａ65363.3±0.4bB69874.3±2.2aC58268.3±1.5abD74363.8±1.1bE66355.1±0.8cF65161.0±0.3bG80169.2±1.1abH71560.0±1.7bcWT85765.7±0.7b注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。A、B、C、D、E、F、G和H分別為誘變株，WT為野生菌株。（5）誘變株對(duì)小菜蛾2齡幼蟲的致病力測定將8個(gè)誘變株培養(yǎng)14d后，用無菌水收集孢子，配制成濃度為106分生孢子/mL的孢子懸液。將帶有2齡小菜蛾幼蟲的芥藍(lán)葉片浸入懸液中，對(duì)照浸入無菌水中，10s后取出，自然晾干。每處理為6～8片葉，每葉5頭若蟲，3次重復(fù)。處理過的葉片置于透明的保鮮盒內(nèi)。再置于25±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中（L:D=14:10）。每日鏡檢并記錄感染死亡率，連續(xù)觀察8d。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)中處理完成。致病力研究結(jié)果表明，所有誘變株對(duì)2齡小菜蛾幼蟲的死亡率均高于野生菌株引起的死亡率，并與對(duì)照相比差異顯著。8個(gè)誘變株在第3d開始表現(xiàn)出侵染癥狀，第3d、6d時(shí)8個(gè)誘變株與野生菌株對(duì)小菜蛾的死亡率差異顯著。從總體而言，誘變株B對(duì)小菜蛾的死亡率較強(qiáng)，平均為90.6%（6d），H誘變株對(duì)小菜蛾的死亡率較低，為66.5%（6d）（表3）。與野生菌株相比，誘變株B對(duì)小菜蛾的毒力提高了61%以上。表3金龜子綠僵菌8個(gè)誘變株和野生菌株的致病力測定分離株侵染率(%)M±SE（3d）侵染率(%)M±SE（6d）A58.6±1.1ab85.2±0.2abB62.3±1.6a90.6±1.2aC55.7±0.6ab81.6±0.9bD50.7±0.4b72.9±1.5cE48.5±0.4bc78.9±0.5bcF45.3±1.7c83.6±0.6bG52.1±1.3b71.2±1.7cH45.9±1.7c66.5±0.8cdWT30.5±0.9d56.1±1.2dCK3.3±0.6e5.6±1.4e注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。A、B、C、D、E、F、G和H分別為誘變株，WT為野生菌株。（6）金龜子綠僵菌誘變株對(duì)紫外線的耐受性評(píng)估將野生菌株（WT）和誘變菌株（B）配制成1.0×106孢子/mL的懸浮液培養(yǎng)20h后，分成兩組，一組紫外線照射40min，另一組不使用紫外線照射，然后將孢子懸浮液取5ml置于裝有200ml的查氏培養(yǎng)液的三角瓶中，在25±1℃搖床內(nèi)200rpm培養(yǎng)，分別在18、21、24、27h時(shí)觀察并記錄孢子萌發(fā)情況，以芽管長度超過孢子直徑一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。所有處理3次重復(fù)。野生菌株和誘變菌株孢子萌發(fā)率結(jié)果如表4所示。經(jīng)紫外線照射0、40分鐘后，誘變菌株和野生菌株在18、21、24、27h的孢子萌發(fā)率差異顯著，誘變菌株孢子萌發(fā)率明顯高于親本菌株。經(jīng)紫外線照射40分鐘后，野生菌株萌發(fā)率明顯降低，而誘變菌株孢萌發(fā)率變化不明顯，表明誘變菌株的抗紫外線能力明顯增強(qiáng)，與野生菌株相比增強(qiáng)了70~189%。表4供試菌株孢子萌發(fā)率（26℃）注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列中具有相同字母者表示差異不顯著。（7）金龜子綠僵菌誘變株的篩選評(píng)估在評(píng)估優(yōu)良誘變株時(shí)，對(duì)紫外線的耐受力、致病性和產(chǎn)孢量是重要的參考指標(biāo)，孢子萌發(fā)率和菌落生長速率次之。綜上研究結(jié)果顯示，本發(fā)明從菌落生長速率、產(chǎn)孢量和致病性上看，誘變株B較為優(yōu)良，具有致病性強(qiáng)、產(chǎn)孢量高、對(duì)紫外線的耐受力強(qiáng)等特點(diǎn)。綜合比較各方面的因素，B誘變株為最佳菌株，將其命名為金龜子綠僵菌誘變菌株MaUV-1，并于2016年5月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），菌種保藏號(hào)：CCTCCNO：M2016250；分類命名號(hào)為：MetarhiziumanisopliaeMaUV-1；保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。所述金龜子綠僵菌誘變菌株Metarhiziumanisopliae(Metsch.)Sorokin菌株MaUV-1，屬肉座菌目，綠僵菌屬。在查氏培養(yǎng)基上菌落呈絨毛狀至棉絮狀，開始時(shí)為白色，產(chǎn)孢時(shí)呈黃綠色，菌落為不規(guī)則的放射狀，菌落背面呈黃綠色，菌絲具有分隔和分枝，透明，直徑1.5～2.0μm，分生孢子梗很難與菌絲區(qū)分開，直徑2.0μm，其末端產(chǎn)生瓶形小梗，（8.0～16.4）μm×（1.5～2.0）μm，從瓶梗的末端以向基式連續(xù)形成長串鏈的分生孢子。分生孢子長橢圓形，兩端鈍圓或鈍截形，大小變化甚大，（5.0～7.3）μm×（2.0～3.2）μm。（8）金龜子綠僵菌誘變株的遺傳穩(wěn)定性評(píng)估將親本菌株（WT）和誘變菌株（MaUV-1）的分生孢子分別接入含有PDA培養(yǎng)的同一平板中，通過比較第10、12、14代誘變菌株的形態(tài)特征等方面的差異，明確誘變株在遺傳上的穩(wěn)定性。第10、12、14代誘變菌株在菌落形態(tài)、顏色、菌絲生長狀態(tài)與分生孢子的顏色、菌苔顏色等方面完全相同（如圖3所示），表明誘變株在菌落形態(tài)上已經(jīng)穩(wěn)定。將誘變菌株的分生孢子分別接入查氏培養(yǎng)液中，在180rpm/min、26±1℃下振蕩培養(yǎng)8d，離心除去菌絲獲得發(fā)酵液。將發(fā)酵液與等體積的乙酸乙酯（1:1）混合，收集有機(jī)相并濃縮（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A，上海亞榮生化儀器廠）獲得到粗毒素。將粗毒素用甲醇溶解、稀釋，通過液-質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）獲得相應(yīng)的圖譜。通過比較第10、12、14代誘變菌株在次生代謝產(chǎn)物等方面的差異，明確誘變株在遺傳上的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明第10、12、14代誘變菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物的HPLC圖譜（圖4）完全一致，表明誘變株在生理代謝性能上已經(jīng)穩(wěn)定。將野生菌株（WT）和誘變菌株（MaUV-1）配制成1.0×106孢子/mL的懸浮液培養(yǎng)20h后，取經(jīng)紫外線照射40min的孢子懸浮液5ml置于裝有200mL的查氏培養(yǎng)液的三角瓶中，在25±1℃搖床內(nèi)200rpm培養(yǎng)，分別在18、21、24、27h時(shí)觀察并記錄孢子萌發(fā)情況，以芽管長度超過孢子直徑一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。所有處理3次重復(fù)。通過比較第10、12、14代誘變菌株在抗紫外線方面的差異，明確誘變株在遺傳上的穩(wěn)定性。結(jié)果表明經(jīng)紫外線照射40分鐘后，誘變菌株第10、12、14代的孢子在18、21、24、27h的孢子萌發(fā)率差異不顯著（表5）。表明所篩選的誘變菌株對(duì)紫外線的抗性能穩(wěn)定遺傳。表5誘變株不同繁殖世代的孢子萌發(fā)率（26℃）注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列中具有相同字母者表示差異不顯著實(shí)施例2金龜子綠僵菌誘變株（MaUV-1）對(duì)小菜蛾的致病力測定1、生物測定是檢測蟲生真菌對(duì)目標(biāo)害蟲的致死程度和致死速率的有效手段之一，能為綜合評(píng)價(jià)該真菌的生物防治潛力提供重要的參考依據(jù)。本發(fā)明就金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1對(duì)小菜蛾的致病力進(jìn)行測定，以篩選出用于防治的最佳濃度。供試?yán)ハx與寄主植物：將網(wǎng)室中飼養(yǎng)在芥藍(lán)上的小菜蛾成蟲，接種到無蟲的芥藍(lán)苗上，產(chǎn)卵12h后，清除成蟲，將芥藍(lán)苗置于25±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中，待小菜蛾發(fā)育至2齡幼蟲時(shí)待用。芥藍(lán)BrassicacampestrisL.，購自廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所，試驗(yàn)苗均采用8～10片展開葉的盆栽苗。（1）供試菌株的處理取金龜子綠僵菌誘變株（MaUV-1）和野生菌株（WT）接種于Czapek平板，于25±0.5℃的恒溫箱（14L：10D）中培養(yǎng)14天，待產(chǎn)孢后加入0.3%吐溫-80的無菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上打散均勻后，用醫(yī)用紗布過濾去雜質(zhì)，獲得孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)、配成0、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107孢子/mL共6個(gè)濃度梯度待用。（2）金龜子綠僵菌誘變株（MaUV-1）和野生菌株對(duì)小菜蛾的致病力測定將小菜蛾2齡幼蟲浸入6個(gè)濃度梯度的綠僵菌孢子懸浮液中，10s后取出，自然晾干后放置于25±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中（L:D=14:10）。每日鏡檢并記錄感染死亡率，連續(xù)觀察6d。每處理為30頭蟲，3次重復(fù)。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。2、金龜子綠僵菌誘變株（MaUV-1）和野生菌株對(duì)小菜蛾的累計(jì)死亡率接種后的第2～3d，各處理區(qū)的小菜蛾幼蟲開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，如蟲體上有少量白色的菌絲長出，幾天后蟲體表面出現(xiàn)孢子，隨后小菜蛾幼蟲死亡。金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1和野生菌株處理小菜蛾后第3d、6d的累計(jì)死亡率如表6所示，結(jié)果表明隨著孢子濃度的增加小菜蛾幼蟲的死亡率也增加，同一濃度下隨著時(shí)間的增加，小菜蛾2齡的死亡率也增加。在相同濃度與時(shí)間時(shí)，誘變株與野生菌株對(duì)小菜蛾幼蟲的死亡率差異顯著。在第6天誘變株與野生菌株對(duì)小菜蛾幼蟲的LC50分別為1.3×103孢子/ml和5.3×103孢子/ml，誘變株的毒力提高了75%。表6金龜子綠僵菌誘變株和野生菌株對(duì)小菜蛾的累計(jì)死亡率注：表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。表中MaUV-1和WT分別表示金龜子綠僵菌誘變株和野生菌株。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。實(shí)施例3金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1對(duì)紅火蟻的致病力測定1、供試?yán)ハx：紅火蟻，自廣州大學(xué)城草坪，采集后在室內(nèi)飼養(yǎng)一段時(shí)間，待種群穩(wěn)定后挑選出大小一致的健康大型工蟻用于試驗(yàn)。（1）供試菌株的處理取金龜子綠僵菌誘變株（MaUV-1）和野生菌株（WT）接種于Czapek平板，于25±0.5℃的恒溫箱（14L：10D）中培養(yǎng)14天，待產(chǎn)孢后加入0.3%吐溫-80的無菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上打散均勻后，用醫(yī)用紗布過濾去雜質(zhì)，獲得孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)、配成0、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107孢子/mL共6個(gè)濃度梯度待用。（2）金龜子綠僵菌誘變株（MaUV-1）對(duì)紅火蟻的致病力測定將紅火蟻大型工蟻浸入6個(gè)梯度的孢子懸浮液中，10s后取出，自然晾干。每處理為30頭蟲，3次重復(fù)。處理過的紅火蟻大型工蟻放置于25±0.5℃的光照培養(yǎng)箱中（L:D=14:10）。每日鏡檢并記錄感染死亡率，連續(xù)觀察14d。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。2、金龜子綠僵菌誘變株（MaUV-1）對(duì)紅火蟻大型工蟻的累計(jì)死亡率接種后的第4～5d，各處理區(qū)的紅火蟻大型工蟻開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，如蟲體上有少量白色的菌絲長出，幾天后蟲體表面出現(xiàn)孢子，隨后紅火蟻大型工蟻死亡。金龜子綠僵菌誘變株MaUV-1處理后紅火蟻大型工蟻第7d、14d的累計(jì)死亡率如表7所示，結(jié)果表明隨著濃度的增加紅火蟻大型工蟻的死亡率也增加，同一濃度下隨著時(shí)間的增加，紅火蟻大型工蟻的死亡率也增加。第7d、14d時(shí)，所有不同濃度的處理區(qū)，紅火蟻大型工蟻的累計(jì)死亡率差異顯著。第7d時(shí)，誘變株與野生菌株對(duì)紅火蟻大型工蟻的LC50分別為2.89x107孢子/ml和4.79x107孢子/mL；第14d時(shí)，誘變株與野生菌株對(duì)紅火蟻大型工蟻的LC50分別為3.15x105孢子/ml和1.48x106孢子/mL；誘變株的毒力提高了39.67%~78.72%%。表7金龜子綠僵菌誘變株和野生菌株對(duì)紅火蟻大型工蟻的累計(jì)死亡率注：表中同行數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著（DMRT法）。表中MaUV-1和WT分別表示金龜子綠僵菌誘變株和野生菌株。上述所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3