專利名稱：對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及對鱗翅目害蟲具有高毒力的Btcry1Ah基因及其一種部分核苷酸序列和由該基因及其部分序列所編碼的蛋白質(zhì)及多肽。
本發(fā)明的研究背景蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革藍(lán)氏陽性產(chǎn)芽孢土壤細(xì)菌，廣泛分布于土壤、蟲尸、植物根圍、糧倉塵埃等區(qū)域。眾所周知，它在芽孢形成期能產(chǎn)生蛋白性質(zhì)的晶體，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、食毛目、同翅目等昆蟲，甚至線蟲等動(dòng)物均具有毒殺活性，而對人類、高等動(dòng)物、植物等非靶標(biāo)生物安全無害，已被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、衛(wèi)生害蟲的防治。
1981年，Schnepf和Whiteley等克隆了第一個(gè)Bt殺蟲蛋白基因cry1Aa，于1985年完成了核苷酸序列分析，該基因?qū)[翅目害蟲具有活性。隨后，對鞘翅目、雙翅目等害蟲有活性的菌株和基因相繼被發(fā)現(xiàn)和分離克隆(Krieg，A.et al，J.Appli.Entomology，1983，96500-508；Ward，E.S.，andD J.Ellar.1986.J.Mol.Biol.1911-11.Herrnstadt，C.et al，Gene，1987，57(1)37-46；Payne，J.，K.E.Narva，and J.Fu.December 1996.U.S.Patent 5,589,382.)。隨著生物技術(shù)的突飛猛進(jìn)，Bt轉(zhuǎn)基因工程菌和抗蟲植物的商業(yè)化取得巨大成功，各國均加大投入，以期獲得新的高毒力、新活性的Bt菌株和基因。截止到2004年10月底，全球共發(fā)現(xiàn)和公布了323種Bt殺蟲蛋白基因(可參見http//www.biols.susx.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/list.html)。
1996年全世界第一例轉(zhuǎn)基因抗蟲植物在美國獲準(zhǔn)應(yīng)用，它所使用的基因主要部分就是來自Bt cry1Ac。在接下來的幾年里，轉(zhuǎn)cry1Ab基因的抗蟲玉米、轉(zhuǎn)cry3Aa基因的抗蟲土豆等GMO相繼問世，截止到2003年底，在美國抗蟲棉種植面積占總棉花種植的73％，玉米占到40％(Clive James，International Service for the Acquisition ofAgri-Biotech Application，preview，No.30，2003)。在中國，自1998年開始正式推廣含有cry1Ac/1Ab基因的抗蟲棉以來，累計(jì)種植已達(dá)9千萬畝，僅2004年種植面積就高達(dá)3700萬畝。在我國獲準(zhǔn)商業(yè)化的還有轉(zhuǎn)基因抗蟲楊樹，它所使用的基因與抗蟲棉幾乎相同。與此同時(shí)，國內(nèi)相關(guān)研究單位正在進(jìn)行環(huán)境釋放的抗蟲轉(zhuǎn)基因植物有水稻(cry1Ac/1Ab或者cry1Ab)、玉米(cry1Ac/Ab)。但無論是已商品化還是處于研究評價(jià)階段的抗蟲工程植物所用的基因都具有種類單一的缺點(diǎn)，因此如果大面積推廣這些抗蟲作物將存在害蟲避難所減少、抗藥性上升過快的風(fēng)險(xiǎn)。解決這一問題的有效方法是尋找新的高毒力基因或基因組合作為新的替代和補(bǔ)充。美國孟山都公司的第二代抗蟲棉就采用了對棉鈴蟲高毒的cry2Ab基因進(jìn)行組合(Bruce E.Tabashnik et al.，APPLIEDAND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Aug.2002，p.3790-3794；Nicholas，D.et al，Transgenic Plant and Insect Pests Biocontrol，John Wiley & Sons Press，USA，1997，1-18)。
因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲蛋白基因，將能豐富殺蟲基因資源，為轉(zhuǎn)基因工程菌和抗蟲植物的研制提供新的基因來源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的抗蟲效果，并有望降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風(fēng)險(xiǎn)，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。
本發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的針對目前世界上防治鱗翅目害蟲所使用的Bt制劑以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品基因品種單一、害蟲易于產(chǎn)生抗性、殺蟲譜較窄和毒力較低等不足，本發(fā)明從國內(nèi)Bt菌株中分離克隆了新的基因cry1Ah，該基因表達(dá)產(chǎn)物對多種鱗翅目害蟲毒力顯著強(qiáng)于目前已知的Cry蛋白。這種新的基因可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)對相關(guān)害蟲的高毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉(zhuǎn)基因植物抗藥性的產(chǎn)生。
本發(fā)明的技術(shù)方案1.出發(fā)菌株Bt BT8菌株中cry基因的鑒定采用Kuo(Kuo and Chak，Appl.Environ.Micro.1996，6280-86)和宋福平的PCR-RFLP鑒定體系對國內(nèi)Bt分離株(宋福平、張杰、黃大昉等，《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》，1998，第31卷，第3期，第13-18頁)進(jìn)行cry基因分析，發(fā)現(xiàn)該菌株中存在cry1Aa、cry1Ba cry2Aa、cry2Ab等已知基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種尚不能定名的新基因cry1X。
2.BT8菌株中cry1Ah基因的克隆采用快速克隆方法對該菌株中的新cry基因進(jìn)行分離克隆。
按照Narva(Narva，K.E.et al，EP0462721 A2，1991，8)等的方法從Bt BT8菌株(該菌株來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，可向公眾提供)中提取質(zhì)粒DNA，用Sau3AI酶部分消化質(zhì)粒DNA，從凝膠中回收4-7kb DNA片段，純化后與經(jīng)BamHI消化、堿性磷酸酶處理的pUCP18載體進(jìn)行連接(Schweizer HP，Gene，1991 Jan2；97(1)109-21.)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM107(購自美國NEBiolab公司，32 Tozer Road Beverly，MA01915-5599，USA)后，用cry1基因通用引物K5un2/K3un2對能在抗生素Amp上正常生長的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，篩選含有Bt cry基因的陽性轉(zhuǎn)化子。引物分別為正向引物(Forward primer)TCCTGCAGTTGACTTCAAATAGG；反向引物(Reverse primer)CAGTCGACTCATCCGATAAACACGCCAC’通過附圖6所示的程序及條件對pHT59進(jìn)行亞克隆。對篩選得到的重組質(zhì)粒pHT59，進(jìn)行DNA序列分析，結(jié)果表明該質(zhì)粒含有cry1Ah基因全長DNA片段。該基因全序列如SEQ ID NO 1所示，共含有3549bp；由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，該蛋白質(zhì)共由1182個(gè)氨基酸組成，分子量為134kDa，等電點(diǎn)為pI 4.985。Btδ--內(nèi)毒素基因國際命名委員會(huì)把該基因命名為cry1Ah1。
3.穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)cry1Ah1全長基因3549bp的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對引物，并在引物5’端加上限制性酶位點(diǎn)，用于基因與表達(dá)載體的連接，引物序列如下正向引物5’CGGGATCCATGAAAAACAGTATCAA 3’BamHI反向引物5’ACGCGTCGACCTATTCCTCCATAAGGAG 3’SalI3549bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI、SalI消化后克隆于含有Bt復(fù)制子的Bt-E.coli穿梭質(zhì)粒pSXY422(7.3kb)。該質(zhì)粒由pUC18改造而成，加入了Bt質(zhì)粒的復(fù)制子、Bt cry基因營養(yǎng)期表達(dá)啟動(dòng)子Pcry3Aa和來自pET21b質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，成為穿梭表達(dá)載體(該質(zhì)粒來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，可向公眾提供)。所獲得的重組表達(dá)載體質(zhì)粒命名為pSXY422-1Ah。采用Lereclus等轉(zhuǎn)化方法(Lereclus，D.et al，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters，1989，60211-217)，利用pSXY422-1Ah轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株HD73--(該菌株來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，可向公眾提供)。對能在紅霉素抗性平板上生長出的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行多種分子檢測，證明轉(zhuǎn)化成功。將該轉(zhuǎn)化子命名為工程菌Biot1Ah。該菌能在Bt無晶體突變株HD73-穩(wěn)定遺傳，穩(wěn)定性大于90％。
4.工程菌的培養(yǎng)和觀察采用GT培養(yǎng)基(配方為液體GT每升中加入10ml 0.8％CaCl2，10ml G-Tris鹽(0.025％FeSO4.7H2O，0.05％CuSO4.5H2O，0.05％ZnSO4.7H2O，0.5％MnSO4.H2O，2.0％MgSO4)，10ml20％(NH4)2SO4，10ml 5％ K2HPO4，10ml 20％葡萄糖，50ml 1M Tris-HCl，pH7.5，1.5g酵母提取物，pH7.4；固體GT在液體GT中加入1.3％瓊脂)、1/2 LB培養(yǎng)基(配方為液體LBTryptone 1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0；固體LB在液體培養(yǎng)基中加1.3％瓊脂)分別培養(yǎng)Biot1Ah工程菌，用電子掃描顯微鏡和光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果顯示在Biot1Ah中存在雙錐體形晶體，證明該基因正常表達(dá)。
5.cry1Ah1基因5’-端活性區(qū)確定和表達(dá)研究根據(jù)其它c(diǎn)ry1A基因活性區(qū)大于1.8kb的情況，設(shè)計(jì)引物B.2001bp部分基因引物正向引物5’CGGGATCCATGAAAAACAGTATCAA 3’BamHI反向引物5’ ACGCGTCGACTGATCAATATGATAATCCG 3’SalI把2001bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI、SalI消化后克隆于E.coli表達(dá)載體pET21(購自于美國Novagen Inc，601 Science Drive Madison，Wi 53711)，把所獲得的重組表達(dá)載體質(zhì)粒命名為pET1Ah-2。利用pET1Ah-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Dubendorff，J.W.and Studier，F(xiàn).W.1991，J.Mol.Biol.219，45-59.)，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了75kD的多肽。
6.殺蟲生物活性測定利用的鱗翅目害蟲包括小菜蛾(Plutella xylostella)為二齡幼蟲；棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、亞洲玉米螟(Ostrina furnacalis)、水稻二化螟(Chilo supperssalis)為一齡幼蟲。上述測試?yán)ハx為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)種群。
還有大豆食心蟲(Leguminivora glycinivorella)在自然種植的大豆田中誘捕成蟲，室內(nèi)產(chǎn)卵孵化的1～2幼蟲。
以不同濃度的Bt毒蛋白為樣品進(jìn)行單獨(dú)測試和組合測試，時(shí)間4-7天。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)處理。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明分離克隆的Bt cry1Ah基因和其一種部分序列及其它們的基因表達(dá)產(chǎn)物能夠?qū)[翅目害蟲產(chǎn)生強(qiáng)毒力，這種毒力強(qiáng)于目前國際上發(fā)現(xiàn)的同類自然菌株的基因。通過cry1Ah基因與cry1Ab、cry1Ba、cry2Ab等基因表達(dá)產(chǎn)物組合，可擴(kuò)大對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目害蟲的殺蟲譜。通過應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使它們表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性，可克服或延緩昆蟲對工程菌和轉(zhuǎn)基因植物抗藥性的產(chǎn)生。


圖1為BT8 cry1型基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及RFLP。
其中M代表pUC DNA混合Marker(1116，883，692，501，489，404，331，242，190，147，111，110bps)，1為Kun3引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.4kb，2為1/PstI and EcoRI酶切，3為4/PstI andXbaI酶切，4為Kun2引物擴(kuò)增產(chǎn)物1.6kb。
圖2為含有目的基因的重組質(zhì)粒pHT59 PCR-RFLP鑒定。
其中M代表pUC DNA混合Marker，1為Kun2引物擴(kuò)增產(chǎn)物/PstI+XbaI，2為Kun3引物擴(kuò)增產(chǎn)物/PstI+EcoRI。
圖3為pHT59單酶切分析。
其中1、2、3、4、5、6和M分別代表pHT59/EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、XbaI和λDNA/Ecol30I marker(19.1，7.7，6.2，4.2，3.4，2.7，1.9，1.5，0.9，0.4kb)。
圖4為pHT59質(zhì)粒雙酶切分析。
其中1、2、3、4、5、6、7和M分別代表pHT59/EcoRI and XbaI、pHT59/EcoRI and KpnI、pHT59/EcoRI and HindIII、pHT59/EcoRI and PstI、pHT59/EcoRI and SacI、pHT59/SacIand PstI、pHT59質(zhì)粒和λDNA/EcoO130I marker。
圖5亞克隆質(zhì)粒pHT59-32、pHT59-15、pHT59-22的酶切分析。
其中1、2代表pHT59-15/HindIII，3、4代表pHT59-32/HindIII，5、6代表pHT59-22/HindIII，M為λDNA/EcoO130I marker。
圖6為cry1Ah基因/pHT59的亞克隆流程圖。
圖7為cry1Ah全長基因穿梭表達(dá)載體pSXY422-1Ah酶切分析。
其中1、2為cry1Ah全長基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3為穿梭載體pSXY422/BamHI and SalI，4為pSXY422-1Ah/BamHI and SalI，M代表λDNA/EcoO130I marker。
圖8為cry1Ah基因2.0kb片段PCR擴(kuò)增檢測。
其中1、2為E.coli表達(dá)載體pET21b/BamHI and SalI，3、4代表cry1Ah基因5’端2.0kb片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M代表λDNA/EcoO130I marker。
圖9為含有cry1Ah基因2.0kb片段重組質(zhì)粒pET1Ah-2酶切分析。
其中1、M分別代表pET1Ah-2/BamHI and SalI和λDNA/EcoO130I marker。
圖10為cry1Ah基因2.0kb片段在E.coli中表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測。
其中1、2代表表達(dá)細(xì)胞形成的包含體蛋白組分，3為可溶性蛋白組分，4為陰性對照菌(BL21pET21b)，M代表分子量marker(212，116，97，66，40kD)。
圖11為不同培養(yǎng)時(shí)間BT8中各種cry基因的表達(dá)。
其中12、18、24、30、36分別代表細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))，M代表分子量marker(212，116，97，66，40kD)。
圖12為不同培養(yǎng)時(shí)間工程菌Biot1Ah中cry1Ah基因的表達(dá)。
其中18、24、30、36、48分別代表細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))，M代表分子量marker(212，116，97，66，40kD)。
圖13為Cry1Ah蛋白晶體(工程菌Biot1Ah)的掃描電鏡結(jié)果。
圖14為cry1Ah全長基因與其它c(diǎn)ry1類基因核苷酸序列同源進(jìn)化樹。
圖15為cry1Ah 2.0kb基因與其它c(diǎn)ry1類基因相同長度核苷酸序列同源進(jìn)化樹。
圖16為Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白全長氨基酸序列同源進(jìn)化樹。
圖17為Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白N-末端667個(gè)氨基酸序列同源進(jìn)化比較。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。
實(shí)施例1、BT8菌株的基因型鑒定按照Narva(Narva，K.E.et al，EP0462721 A2，1991)的方法從Bt菌株BT8中提取質(zhì)粒DNA。以B-8-G菌株質(zhì)粒DNA為模板，用cry1的3’端引物(K5un2和K3un2)、5’端引物(K5un3和K3un3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)參數(shù)分別為94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃3分鐘，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。分別獲得了cry1型基因3’端的1.6kb、5’端的1.4kb兩種片段PCR產(chǎn)物，該DNA片段經(jīng)過氯仿抽提純化后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)，37℃1-2小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段的多態(tài)性(附圖1)。分析結(jié)果(見表1)表明BT8菌株含有cry1Aa，cry1Ba，cry2Aa，cry2Ab和一個(gè)未知的新的cry1基因(cry2基因結(jié)果從略)。
表1 BT8菌株cry1型基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和限制性酶切長度多態(tài)性基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(K5un3/K3un3)(bp) EcoRI和PstI酶切片段(bp)cry1Aa1463 726，493，244cry1BaNPcry1Ax1460 940，520基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(K5un2/K3un2)(bp) XbaI和PstI酶切片段(bp)cry1Aa1635 1117，518cry1Ba1686 1015，655，16cry1？1630 780 540 310實(shí)施例2、BT8菌株新基因的克隆經(jīng)鑒定BT8菌株中含有一個(gè)未知的新的cry1基因，采用以下方法進(jìn)行分離克隆。BT8質(zhì)粒經(jīng)Sau3AI部分酶切，回收4-7kb片段，與BamHI酶切的載體pUCP19連接轉(zhuǎn)化JM107，經(jīng)PCR擴(kuò)增和RFLP分析(附圖2)獲得含有BT8菌株新cry1型基因的陽性轉(zhuǎn)化子ETG59，把重組質(zhì)粒命名為pHT59。
依據(jù)已有的cry1類基因的酶切圖譜分析，選擇EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、XbaI等分別對pTG59進(jìn)行單一酶切分析(附圖3)，結(jié)果表明pHT59上克隆的外源片段為6.9kb。經(jīng)過EcoRI和XbaI、EcoRI和KpnI、EcoRI和HindIII、EcoRI和PstI、EcoRI和SacI、SacI和PstI雙酶切分析(附圖4)，構(gòu)建了該基因大片段的物理圖譜。根據(jù)多種酶切分析結(jié)果選擇HindIII酶切片段進(jìn)行亞克隆，pHT59經(jīng)HindIII完全消化為6.7kb(2.2kb和pUCP19 4.5kb)、3.2kb、1.5kb三個(gè)片段，分別將3.2kb、1.5kb與HindIII酶切的pBlueScriptSK+連接，6.7kb片段自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)質(zhì)粒酶切分析篩選獲得了三個(gè)亞克隆，所含重組質(zhì)粒命名為pHT59-32、pHT59-15、pHT59-22(附圖5)。附圖6為此亞克隆流程圖。
對三個(gè)亞克隆進(jìn)行序列測定，再與其它c(diǎn)ry1基因進(jìn)行同源序列比較，表明該基因?yàn)槿L新基因。該基因編碼區(qū)3549bps(SEQ ID NO 1)，編碼1182個(gè)氨基酸的蛋白(SEQ ID NO2)，分子量為134kDa，等電點(diǎn)為pH4.985。該基因由Btδ內(nèi)毒素基因國際命名委員會(huì)命名為cry1Ah1。
實(shí)施例3、cru1Ah全長基因穿梭載體的構(gòu)建為了便于克隆和表達(dá)，根據(jù)cry1Ah1基因編碼區(qū)全長核苷酸序列，設(shè)計(jì)了一對分別含有BamHI和SalI酶切位點(diǎn)的特異性引物。PCR擴(kuò)增條件為94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃3分鐘，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘，采用高保真性能的pfu聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。獲得了3.5kbcry1Ah全長片段，如附圖7中A的第1、2樣品所示。經(jīng)BamHI和SalI雙酶切完全反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，從凝膠中回收該片段，與經(jīng)同樣的酶切處理的Bt-E.coli穿梭表達(dá)載體pSXY422進(jìn)行連接反應(yīng)，12℃12小時(shí)；取連接產(chǎn)物2μL轉(zhuǎn)化E.coli受體菌JM110，以Amp抗性平板篩選陽性重組質(zhì)粒。將所獲得的陽性重組質(zhì)粒分別接種于液體LB試管中，37℃230rpm培養(yǎng)12小時(shí)，以常用的堿解法提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行BamHI和SalI的單、雙酶切反應(yīng)，通過凝膠電泳鑒別得到含有cry1Ah基因全長片段3.5kb的重組表達(dá)克隆pSXY422-1Ah，附圖7中B為雙酶切檢測結(jié)果，其中3號為pSXY422空載體，4號為pSXY422-1Ah。
實(shí)施例4、Bt工程菌Biot1Ah的構(gòu)建將來自JM110的重組表達(dá)克隆pSXY422-1Ah用電激方法轉(zhuǎn)化E.coli甲基化突變株SCS110，電激條件為2500V，400Ω，25μF，100μL感受態(tài)細(xì)胞，1μL質(zhì)粒DNA。37℃溫浴1小時(shí)，100rpm；從SCS110中提取去甲基化的pSXY422-1Ah質(zhì)粒。
制備Bt無晶體突變株HD-73-感受態(tài)，用電激轉(zhuǎn)化方法將去甲基化的pSXY422-1Ah質(zhì)粒導(dǎo)入其中。電激條件2200V，1000Ω，25μF，100μL感受態(tài)細(xì)胞，1μL質(zhì)粒DNA。30℃溫浴2小時(shí)，100rpm；以25μg/mL Ery(紅霉素)平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過提取質(zhì)粒、酶切分析、PCR擴(kuò)增等分子檢測，獲得了含有pSXY422-1Ah表達(dá)質(zhì)粒的Bt陽性轉(zhuǎn)化子，將該轉(zhuǎn)化子命名為工程菌Biot1A。
實(shí)施例5、Bt工程菌Biot1Ah的培養(yǎng)、觀察和檢測活化工程菌Biot1Ah(30℃，12小時(shí))；1％接種于1LGT培養(yǎng)基中，加入紅霉素，終濃度為25μg/mL，30℃，230rpm，振蕩培養(yǎng)20～48小時(shí)；在培養(yǎng)期間，每隔6小時(shí)取1mL培養(yǎng)液，進(jìn)行蛋白表達(dá)的時(shí)空研究；同時(shí)培養(yǎng)出發(fā)菌株BT8，作為參照。取少量培養(yǎng)物進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢測，觀察細(xì)胞裂解、芽孢的釋放和晶體的形成。待40％的營養(yǎng)體細(xì)胞裂解時(shí)，停止培養(yǎng)，離心收集菌體，加入100mL 1M NaCl/10mM Tris·Cl(pH7.5)溶液洗滌2次，無菌水洗滌3次，以除去發(fā)酵次生代謝物和鹽分，4℃，6,000rpm，離心10分鐘(這些培養(yǎng)物可以-20℃保存?zhèn)溆?。取上述胞晶混合物進(jìn)行掃描電鏡的觀察和記錄。結(jié)果(附圖13)顯示，cry1Ah基因在Bt無晶體突變株HD-73-中能正常表達(dá)，形成cry1基因所特有的雙錐體型晶體。
取上述胞晶混合物20mg，懸浮于100μL水中，加入25μL0.5N NaOH，25℃作用5分鐘；加入65μL 3×樣品緩沖液，100℃煮沸5分鐘，離心去除沉淀；分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如附圖11和12所示。圖11表明在出發(fā)菌株BT8中，130kD左右的蛋白自18小時(shí)能夠被檢測到，至36小時(shí)均能穩(wěn)定存在和積累，晶體數(shù)量相應(yīng)較多。而在工程菌Biot1Ah中，自24小時(shí)以后可以檢測到134kDa的Cry1Ah蛋白(圖12)，并隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而不斷積累，能形成相當(dāng)數(shù)量的穩(wěn)定的雙錐體狀晶體(圖13)，與天然菌株相同。連續(xù)繼代和稀釋涂板測定，結(jié)果表明工程菌遺傳穩(wěn)定性在98％以上。
實(shí)施例6、cry1Ah基因活性區(qū)2.0kb片段克隆、表達(dá)與檢測克隆根據(jù)cryAh1基因從5’-段其始密碼子ATG至2001bp處核苷酸序列，設(shè)計(jì)了一對分別含有BamHI和SalI酶切位點(diǎn)的特異性引物。PCR擴(kuò)增條件為94℃1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘，反應(yīng)用酶為pfu聚合酶。擴(kuò)增獲得2.0kbcry1Ah活性區(qū)片段(見附圖8中第3、4樣品)，經(jīng)BamHI和SalI雙酶切完全反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，從凝膠中回收該片段，與經(jīng)同樣的酶切處理的E.coli表達(dá)載體pET21b進(jìn)行連接反應(yīng)，18℃4小時(shí)，取連接產(chǎn)物2μL轉(zhuǎn)化E.coli受體菌BL21，以Amp抗性平板篩選陽性重組質(zhì)粒。將所獲得的陽性重組質(zhì)粒接種于LB試管中37℃ 230rpm培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行BamHI和SalI的單、雙酶切反應(yīng)，得到含有cry1Ah基因2.0kb片段的陽性克隆pET1Ah2，附圖9為雙酶切檢測結(jié)果。
誘導(dǎo)表達(dá)活化陽性克隆BL21(pET1Ah2)(37℃，12小時(shí))；1％接種于1L LB培養(yǎng)基中，37℃，230rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8，(約2小時(shí))；加入誘導(dǎo)物IPTG，終濃度為0.7mM，150rpm，20℃低溫誘導(dǎo)18小時(shí)；離心收集菌體，加入50mL 10mM Tris·Cl(pH8.0)懸??；超聲波破碎細(xì)胞壁(B.Braun U Labsonic，230V，T間隔＝0.5sec)，處理10分鐘，反應(yīng)控制在0℃；4℃，12,000rpm，離心10分鐘；收集上清及沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。
SDS-PAGE電泳對上述蛋白樣品的處理取100μL上清液，或包涵體沉淀懸浮于100μL 10mM Tris·Cl緩沖液中，分別加入50μL 3x樣品緩沖液(25μL上樣緩沖液+75μLβ-巰基乙醇)，100℃煮沸5分鐘，離心除去沉淀；將樣品依次加入濃縮膠中，4℃下電泳；完成染色、脫色和凝膠掃描和數(shù)據(jù)記錄分析。在Cry1Ah活性區(qū)2.0kb表達(dá)產(chǎn)物為75kD，與預(yù)測結(jié)果一致。cry1Ah基因2001kb的部分核苷酸序列如SEQ ID NO 3，其編碼的多肽即Cry1Ah的一半共667個(gè)氨基酸的序列如SEQ ID NO 4所示。
實(shí)施例7、Cry1Ah對幾種害蟲毒力測定1.小菜蛾采用甘藍(lán)葉片稱重后浸葉法，取100g新鮮葉片，Cry1Ah全長蛋白按不同樣品稀釋濃度浸葉10秒，取出后室溫自然涼干，置于廣口瓶中，每瓶接2齡幼蟲20頭，25℃，每日光∶暗為12∶12小時(shí)，設(shè)Cry1Ac等不同的Bt Cry蛋白作為對照，96小時(shí)調(diào)查結(jié)果。
2.棉鈴蟲、亞洲玉米螟、水稻二化螟生測采用一齡幼蟲，將Cry1Ah全長蛋白樣品按預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)適宜的濃度梯度，按10g人工飼料/mL蛋白樣品比例均勻混合，分裝于指形管、24孔板等器皿中25～26℃培養(yǎng)，96、120、168小時(shí)分別調(diào)查，計(jì)算LC50。
3.大豆食心蟲將在田間捕到的三千頭成蟲(雌雄比接近1∶1)放入事先罩好網(wǎng)的大豆田(已接莢)內(nèi)飼養(yǎng)，讓其自然產(chǎn)卵，待孵化后1～2幼蟲即用于生測。
以不同濃度的Bt Cry1Ah全長蛋白為樣品進(jìn)行測試。將青豆在稀釋好的待測樣品浸濕10秒鐘，晾干，放入剝開的豆莢中，然后把該豆莢謝謝生測瓶中，每瓶接蟲20頭，每個(gè)處理重復(fù)3次，25℃培養(yǎng)24、48、96小時(shí)調(diào)查大豆食心蟲死亡數(shù)。計(jì)算死亡率、校正死亡率。
Cry1Ah全長蛋白生物活性測定結(jié)果詳見表2-表5。
表2 Cry1Ah蛋白對小菜蛾(Plutella.Xylostella)二齡幼蟲殺蟲活性濃度 正 LC50樣品 試蟲數(shù) 蟲數(shù) ％ug/ml ％ ug/mlCK 60 2 3.3312.8 60 59 98.3398.276.4 60 55 91.6791.381.393.2 60 46 76.6775.87Cry1Ah(1.15-1.67)1.6 60 29 48.3346.550.8 60 18 30 27.590.4 60 11 18.3315.52表3 Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)一齡幼蟲殺蟲活性濃度 蟲 正 LC50樣品 試蟲ug/ml 數(shù) ％ ％ ug/mlCK 48 0 0.004548 33 68.75 68.7512.8 48 28 58.33 58.336.066.4 48 23 47.92 47.92Cry1Ah (3.99-11.94)2.56 48 19 39.58 39.581.6 48 14 29.17 29.170.8 48 11 22.92 22.92表4 Cry1Ah蛋白對二化螟(Chilo supperssalis)一齡幼蟲殺蟲活性正濃度 LC50樣品 試蟲 蟲數(shù)g/g ％ g/g％CK 502 4.00205048 96.00 95.83105042 84.00 83.330.9045 5038 76.00 75.00Cry1Ah (0.142-1.922)2 5036 72.00 70.831 5031 62.00 60.420.5 5015 30.00 27.08表5 Cry1Ah蛋白對玉米螟(Ostrina furnacalis)一齡幼蟲殺蟲活性濃度蟲數(shù) 正 LC50樣品 濃度 試蟲ug/g％％ ug/gCK 144 9 6.25 0.05012Cry1Ah 18144 144 100.00100.00 (0.024-0.096)5 144 143 99.31 99.261 144 139 96.53 96.30
0.1 144 9364.5862.220.01 144 4531.2526.670.005144 106.94 0.74根據(jù)上述各表結(jié)果可知，Cry1Ah對小菜蛾、棉鈴蟲、亞洲玉米螟、水稻二化螟均具有顯著的殺蟲活性，對四種測試害蟲的LC50數(shù)值分別低于幾種已知的高毒力Bt殺蟲蛋白。目前國際上所發(fā)現(xiàn)的對這四種害蟲毒力最高的Bt Cry蛋白分別為小菜蛾，Cry1Ac(LC50＝1.85μg/ml)；棉鈴蟲，Cry1Ac(LC50＝12.26μg/ml；亞洲玉米螟，Cry1Ac(LC50＝0.134μg/g)；水稻二化螟Cry1Ab(LC50＝1.81μg/g)。
由此可知本發(fā)明的Cry1Ah的毒力均強(qiáng)于這幾種已知的殺蟲蛋白。
以上結(jié)果均為Cry1Ah全長蛋白134kDa組分殺蟲活性。
對于Cry1Ah活性區(qū)的研究表明，自起始密碼子ATG至200lbp(如SEQ ID NO 3所示)共667個(gè)氨基酸的多肽片段(75kDa)(如SEQ ID NO 4所示)同樣具有高毒力，是活性必需區(qū)段，對大豆食心蟲、小菜蛾、棉鈴蟲和二化螟的毒殺作用與全長的Cry1Ah蛋白相當(dāng)。此片段完全能用于抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建。
實(shí)施例8、cry1Ah全長基因和2.0kb片段與其它Bt cry1基因同源性比較同源比較的結(jié)果分別如下表6、7、8、9所示表6 cry1Ah全長基因與其它Bt cry1A基因同源性比較

表7 cry1Ah基因2kb片段與其它Bt cry1A基因同源性比較

表8 Cry1Ah全長蛋白與其它Bt Cry1A蛋白同源性比較

表9 Cry1Ah 75kDa多肽與其它Bt Cry1A多肽同源性比較

同源比較結(jié)果表明，cry1Ah全長基因和2kb片段與cry1Ac全長基因核苷酸同源性最高，達(dá)到84％(表6，7)；Cry1Ah蛋白與Cry1Ac蛋白氨基酸同源性為86％(見表8)；而Cry1Ah74kDa多肽與Cry1Ac蛋白氨基酸同源性則為82％(見表9)，與其它Cry1A蛋白的同源性均低于此值，例如與Cry1Ab同源性為67％，與Cry1Aa同源性為59％。
附圖14-圖17分別為cry1Ah全長基因與其它c(diǎn)ry1類基因核苷酸序列、cry1Ah 2.0kb基因與其它c(diǎn)ry1類基因相同長度核苷酸序列、Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白全長氨基酸序列、Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白N-末端667個(gè)氨基酸序列的同源進(jìn)化樹。無論是從核苷酸序列還是從氨基酸序列的分析比對，也無論是全長還是半長，cry1Ah(Cry1Ah)與cry1Ac(Cry1Ac)、cry1Ab(Cry1Ab)、cry1Ae(Cry1Ae)、cry1Ad(Cry1Ad)和cry1Af(Cry1Af)的遺傳距離較近；但是在生物活性上卻相差較大。
因此可得知，若選用cry1Ah半長基因(2001kb，SEQ ID NO 3)作為轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的研制材料，能夠更為有效地克服目前基因同源性高、種類單一的問題，同時(shí)可望獲得抗蟲性能更好的工程植物。
附本發(fā)明所涉及的DNA序列和蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO 1(cry1Ah基因的核苷酸序列)atgaaaaaca gtatcaaatt atcagaactt tggtatttca atgaaagaaa atggaggtat 60tttatggaga tagtgaataa tcagaatcaa tgcgtgcctt ataattgttt gaataatccc120gaaatcgaaa tattagaagg cggaagaata tcagttggta ataccccaat tgatatttct180ctttcgctta ctcagtttct tttgagtgaa tttgtcccag gtgcggggtt tgtattagga240ttaattgatt taatatgggg atttgtaggt ccttcccaat gggacgcatt tcttgctcaa300gtggaacagt taattaacca aagaatagca gaagctgtaa gaaatacagc aattcaggaa360ttagagggaa tggcacgggt ttatagaacc tatgctactg cttttgctga gtgggaaaaa420gctcctgatg acccagagct aagagaagca ctacgtacac aatttacagc aactgagact480tatataagtg gaagaatatc cgttttaaaa attcaaactt ttgaagtaca gctgttatca540gtgtttgccc aagctgcaaa tttacattta tctttattaa gagacgttgt gttttttggg600caaagatggg gtttttcaac gacaaccgta aataattact acaatgattt aacagaaggg660attagtacct atacagatta tgctgtacgc tggtacaata cgggattaga acgtgtatgg720ggaccggatt ctagagattg ggtaaggtat aatcaattta gaagagaatt aacactaact780gtattagata tcgttgctct gttcccgaat tatgatagta gaagatatcc aattcgaaca840gtttcccaat taacaagaga aatttataca aacccagtat tagaaaattt tgatggtagt900tttcgaggct cggctcaggg catagaaaga agtattagga gtccacattt gatggatata960cttaacagta taaccatcta tacggatgct cataggggtt attattattg gtcagggcat 1020caaataatgg cttctcctgt cggtttttcg gggccagaat tcacgtttcc gctatatgga 1080accatgggaa atgcagctcc acaacaacgt attgttgctc aactaggtca gggcgtgtat 1140agaacattat cctctacttt ttatagaaga ccttttaata tagggataaa taatcaacaa 1200ctatctgttc ttgacgggac agaatttgct tatggaacct cctcaaattt gccatccgct 1260gtatacagaa aaagcggaac ggtagattcg ctggatgaaa taccaccaca gaataacaac 1320gtgccaccta ggcaaggatt tagtcatcga ttaagccatg tttcaatgtt tcgttcaggc 1380tctagtagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct 1440gaatttaata atataattgc atcggatagt attactcaaa tccctgcagt gaagggaaac 1500tttcttttta atggttctgt aatttcagga ccaggattta ctggtgggga cttagttaga 1560ttaaatagta gtggaaataa cattcagaat agagggtata ttgaagttcc aattcacttc 1620ccatcgacat ctaccagata tcgagttcgt gtacggtatg cttctgtaac cccgattcac 1680ctcaacgtta attggggtaa ttcatccatt ttttccaata cagtaccagc tacagctacg 1740tcattagata atctacaatc aagtgatttt ggttattttg aaagtgccaa tgcttttaca 1800tcttcattag gtaatatagt aggtgttaga aattttagtg ggactgcagg agtgataata 1860gacagatttg aatttattcc agttactgca acactcgagg ctgaatataa tctggaaaga 1920gcgcagaagg cggtgaatgc gctgtttacg tctacaaacc aactagggct aaaaacaaat 1980gtaacggatt atcatattga tcaagtgtcc aatttagtta cgtgtttatc ggatgaattt 2040tgtctggatg aaaagcgaga attgtccgag aaagtcaaac atgcgaagcg actcagtgat 2100gaacgcaatt tactccaaga ttcaaatttc aaagacatta ataggcaacc agaacgtggg 2160tggggcggaa gtacagggat taccatccaa ggagtggatg acgtatttaa agaaaattac 2220gtcacactat caggtacctt tgatgagtgc tatccaacat atttgtatca aaaaatcgat 2280gaatcaaaat taaaagcctt tacccgttat caattaagag ggtacatcga agatagtcaa 2340gatttagaag tttatttgat ccgttacaat gcaaaacacg aaacgttaaa cgtgccaggt 2400
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atgaaaaaca gtatcaaatt atcagaactt tggtatttca atgaaagaaa atggaggtat 60tttatggaga tagtgaataa tcagaatcaa tgcgtgcctt ataattgttt gaataatccc120gaaatcgaaa tattagaagg cggaagaata tcagttggta ataccccaat tgatatttct180ctttcgctta ctcagtttct tttgagtgaa tttgtcccag gtgcggggtt tgtattagga240ttaattgatt taatatgggg atttgtaggt ccttcccaat gggacgcatt tcttgctcaa300gtggaacagt taattaacca aagaatagca gaagctgtaa gaaatacagc aattcaggaa360ttagagggaa tggcacgggt ttatagaacc tatgctactg cttttgctga gtgggaaaaa420gctcctgatg acccagagct aagagaagca ctacgtacac aatttacagc aactgagact480tatataagtg gaagaatatc cgttttaaaa attcaaactt ttgaagtaca gctgttatca540gtgtttgccc aagctgcaaa tttacattta tctttattaa gagacgttgt gttttttggg600caaagatggg gtttttcaac gacaaccgta aataattact acaatgattt aacagaaggg660attagtacct atacagatta tgctgtacgc tggtacaata cgggattaga acgtgtatgg720ggaccggatt ctagagattg ggtaaggtat aatcaattta gaagagaatt aacactaact780gtattagata tcgttgctct gttcccgaat tatgatagta gaagatatcc aattcgaaca840gtttcccaat taacaagaga aatttataca aacccagtat tagaaaattt tgatggtagt900tttcgaggct cggctcaggg catagaaaga agtattagga gtccacattt gatggatata960cttaacagta taaccatcta tacggatgct cataggggtt attattattg gtcagggcat 1020caaataatgg cttctcctgt cggtttttcg gggccagaat tcacgtttcc gctatatgga 1080accatgggaa atgcagctcc acaacaacgt attgttgctc aactaggtca gggcgtgtat 1140agaacattat cctctacttt ttatagaaga ccttttaata tagggataaa taatcaacaa 1200ctatctgttc ttgacgggac agaatttgct tatggaacct cctcaaattt gccatccgct 1260gtatacagaa aaagcggaac ggtagattcg ctggatgaaa taccaccaca gaataacaac 1320gtgccaccta ggcaaggatt tagtcatcga ttaagccatg tttcaatgtt tcgttcaggc 1380tctagtagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct 1440gaatttaata atataattgc atcggatagt attactcaaa tccctgcagt gaagggaaac 1500tttcttttta atggttctgt aatttcagga ccaggattta ctggtgggga cttagttaga 1560ttaaatagta gtggaaataa cattcagaat agagggtata ttgaagttcc aattcacttc 1620ccatcgacat ctaccagata tcgagttcgt gtacggtatg cttctgtaac cccgattcac 1680ctcaacgtta attggggtaa ttcatccatt ttttccaata cagtaccagc tacagctacg 1740tcattagata atctacaatc aagtgatttt ggttattttg aaagtgccaa tgcttttaca 1800tcttcattag gtaatatagt aggtgttaga aattttagtg ggactgcagg agtgataata 1860gacagatttg aatttattcc agttactgca acactcgagg ctgaatataa tctggaaaga 1920gcgcagaagg cggtgaatgc gctgtttacg tctacaaacc aactagggct aaaaacaaat 1980gtaacggatt atcatattga t 2001SEQ ID NO4(crylAh2kb基因編碼的蛋白的氨基酸序列)MKNSIKLSEL WYFNERKWRY FMEIVNNQNQ CVPYNCLNNP EIEILEGGRI SVGNTPIDIS 60LSLTQFLLSE FVPGAGFVLG LIDLIWGFVG PSQWDAFLAQ VEQLINQRIA EAVRNTAIQE120LEGMARVYRT YATAFAEWEK APDDPELREA LRTQFTATET YISGRISVLK IQTFEVQLLS180VFAQAANLHL SLLRDVVFFG QRWGFSTTTV NNYYNDLTEG ISTYTDYAVR WYNTGLERVW240GPDSRDWVRY NQFRRELTLT VLDIVALFPN YDSRRYPIRT VSQLTREIYT NPVLENFDGS300FRGSAQGIER SIRSPHLMDI LNSITIYTDA HRGYYYWSGH QIMASPVGFS GPEFTFPLYG360TMGNAAPQQR IVAQLGQGVY RTLSSTFYRR PFNIGINNQQ LSVLDGTEFA YGTSSNLPSA420
VYRKSGTVDS LDEIPPQNNN VPPRQGFSHR LSHVSMFRSG SSSSVSIIRA PMFSWIHRSA480EFNNIIASDS ITQIPAVKGN FLFNGSVISG PGFTGGDLVR LNSSGNNIQN RGYIEVPIHF540PSTSTRYRVR VRYASVTPIH LNVNWGNSSI FSNTVPATAT SLDNLQSSDF GYFESANAFT600SSLGNIVGVR NFSGTAGVII DRFEFIPVTA TLEAEYNLER AQKAVNALFT STNQLGLKTN660VTDYHID 66權(quán)利要求
1.一種對昆蟲具有毒性的Bt crylAh基因，其特征是該基因具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.一種對昆蟲具有毒性的蛋白質(zhì)，其特征是該蛋白質(zhì)是由權(quán)利要求1的基因所編碼，且具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種權(quán)利要求1的Bt crylAh基因的部分序列，其特征是該部分序列具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
4.一種對昆蟲具有毒性的多肽，其特征是該多肽是由權(quán)利要求3的部分序列所編碼，且具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。
5.一種轉(zhuǎn)化微生物或植物的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求1的crylAh基因。
6.權(quán)利要求5的方法在轉(zhuǎn)化微生物或植物使之表現(xiàn)出對昆蟲的毒性并克服或延緩昆蟲抗藥性產(chǎn)生中的應(yīng)用。
7.一種轉(zhuǎn)化微生物或植物的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求3的crylAh基因的部分序列。
8.權(quán)利要求7的方法在轉(zhuǎn)化微生物或植物使之表現(xiàn)出對昆蟲的毒性并克服或延緩昆蟲抗藥性產(chǎn)生中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為“對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt crylAh基因”，屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及對鱗翅目害蟲具有抗性的Bt crylAh基因及其一種部分序列和由該基因及其部分序列所編碼的蛋白質(zhì)及多肽序列。進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及這些基因及其部分序列和由它們所編碼的蛋白質(zhì)及多肽在鱗翅目害蟲生物防治中的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/32GK1614022SQ200410009918
公開日2005年5月11日 申請日期2004年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月1日
發(fā)明者張 杰, 宋福平, 黃大昉, 何康來, 韓嵐嵐 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所