本發(fā)明涉及一種分離純化鄰羥基化合物的方法，尤其涉及一種基于溫敏型嵌段聚合物的雙水相浮選體系分離純化鄰羥基化合物的方法，屬于天然產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

作為一類重要的天然產(chǎn)物，天然鄰羥基化合物（如多糖，花青素，原花青素等）以其良好的抗氧化、抗癌及防衰老性能而備關(guān)注，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健領(lǐng)域。當(dāng)前在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的分離提純方法為有機溶劑萃取法。但是該方法過程中大量使用有機溶劑，必然會導(dǎo)致較高的物耗與嚴重的環(huán)境污染。更重要的是，大量有機溶劑使用可能會對天然鄰羥基化合物的結(jié)構(gòu)造成某些不可逆的損害，從而導(dǎo)致其變性與特殊生理作用的喪失。因此，尋找一種經(jīng)濟、綠色和高效的天然鄰羥基化合物的新型分離純化方法就顯得非常重。

雙水相浮選是在雙水相萃取和溶劑浮選技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的分離純化技術(shù)。相較于傳統(tǒng)有機溶劑萃取、雙水相萃取以及溶劑浮選技術(shù)，雙水相浮選技術(shù)具有環(huán)境友好、溶劑用量少、富集倍數(shù)和分離效率高的優(yōu)點，在分離純化領(lǐng)域展現(xiàn)了十分誘人的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外有關(guān)雙水相萃取的文獻報道很多，而對雙水相浮選的研究報道很少。對于已經(jīng)報道的雙水相浮選研究，主要是基于發(fā)酵液或是浸提液中目標物自身的憎水性或表面活性差異直接進行浮選分離，適用面窄，選擇性不佳。

從天然產(chǎn)物提取料液中選擇性浮選分離水溶性目標產(chǎn)品長期以來一直是雙水相浮選分離的技術(shù)難點，限制了這一技術(shù)在水溶性天然產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域的應(yīng)用，浮選捕集劑對于實現(xiàn)這一目標至關(guān)重要，合適的補集劑可以與目標物結(jié)合，基于補集劑的表面活性，不具備疏水性或表面活性的目標物就可以被雙水相浮選體系成功浮選分離。眾所周知，作為一種親水性極強的染料，茜素紅在水中具有良好的溶解性，所以，在正丙醇—鹽雙水相浮選體系中，大部分茜素紅更傾向于分配在水相中，而目前也未見報道合適高效的補集劑運用于浮選茜素紅，因此無法達到理想的浮選分離茜素紅的效果。本發(fā)明中合成一種苯硼酸功能化嵌段聚合物PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀，以這種苯硼酸功能化聚合物作為浮選捕集劑：一方面苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀中的硼酸基團可與茜素紅有效結(jié)合；同時，改性PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀作為一種表面活性劑其疏水嵌段PPO可以在疏水性氣泡界面有效吸附。茜素紅分子在捕集劑的作用下形成了具有表面活性的復(fù)合物，最終成功實現(xiàn)了水溶性茜素紅的浮選分離。這一研究工作的成功開展為后續(xù)親水性較強的鄰羥基化合物的選擇性浮選分離奠定了基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)有機溶劑萃取、雙水相萃取和溶劑浮選技術(shù)物耗大、效率低、污染大和破壞生物活性等缺點，并解決從天然產(chǎn)物提取料液中難以選擇性浮選分離水溶性目標的問題，提供一種以溫敏型嵌段聚合物為捕集劑的雙水相浮選體系分離純化鄰羥基化合物的方法，實現(xiàn)模型化合物水溶性茜素紅的浮選分離。該方法具有富集倍數(shù)大、分離效率高、環(huán)境友好和溶劑用量少等優(yōu)點。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種分離純化鄰羥基化合物的方法，按照下述步驟進行：

（1）向50 mL比色管中加入一定量的茜素紅以及K₂HPO₄，接著加入一定量的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀作為浮選捕集劑并用蒸餾水稀釋至50 mL，充分震蕩溶液體系混合均勻。所得溶液靜置15min后倒入浮選柱中，接著加入5 mL正丙醇，調(diào)節(jié)氣體流量到一定值并開始浮選。一段時間后，體系分為兩相。

其中，茜素紅加入量為0.1-1 mg，K₂HPO₄量為8-16 g，苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀量為0.05-0.4 g；氣體流速為5-25 mL/min；浮選時間為10-50 min。

其中，所述的硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀的合成方法按照如下步驟進行：

將間羧基苯硼酸加入一定量的二氯甲烷中，充分溶解后向其中加入草酰氯，并滴加少量N,N-二甲基甲酰胺以引發(fā)反應(yīng)；所得溶液在固定溫度下攪拌反應(yīng)一段時間，接著減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾除去溶劑得到黃色液態(tài)產(chǎn)物，即3-甲酰氯苯硼酸；將全部產(chǎn)物3-甲酰氯苯硼酸溶于一定量的二氯甲烷中得到溶液A；將PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀溶于一定量的二氯甲烷中，并向其中加入三乙胺得到溶液B；接著在冰水浴冷卻下，將溶液A滴入溶液B中；滴加完全后撤去冰水浴，混合溶液體系在固定溫度下攪拌反應(yīng)一段時間；接著減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾除除去溶劑，向體系中加入水，并加熱分相，收集下相干燥可得產(chǎn)品。

其中，所述的間羧基苯硼酸與二氯甲烷的用量為0.12g：5-30mL；

所述間羧基苯硼酸與草酰氯、N,N-二甲基甲酰胺的用量比例為0.12g：124μL：1-20 滴；

所述溶液攪拌反應(yīng)為15-40 ℃，反應(yīng)2-13 h；

所述溶解3-甲酰氯苯硼酸的二氯甲烷的為5-30mL，優(yōu)選為3-甲酰氯苯硼酸與二氯甲烷用量為0.12g：17.5mL；

所述溶解PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀的二氯甲烷與PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀、三乙胺的用量為5-60mL：0.50 g：150 μL；

所述溶液A與溶液B的體積比為1:2；

所述混合溶液體系攪拌反應(yīng)為15-40 ℃反應(yīng)2-13 h。

（2）分相后，記錄上相體積并測定其中茜素紅濃度。茜素紅濃度測量方法如下：取1.00 mL待測樣品與9.00 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料離心管中，充分震蕩溶液使其混合均勻。接著以蒸餾水作為空白試劑，并于424nm處測定樣品吸光度。重復(fù)上述測定三次，并記錄其平均值。并根據(jù)紫外-可見分光光度法得到茜素紅濃度。最后計算茜素紅的回收率。

其中，茜素紅回收率計算如下：

E = C_TV_T/M_b

式中，E——茜素紅回收率；

C_T——浮選后上相中的茜素紅濃度；

V_T——浮選后上相體積。

M_b——向浮選體系中加入的茜素紅的總量。

（3）在最優(yōu)化的浮選條件下，進行對比試驗：分別對不加入捕集劑和加入0.3 g的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀兩種體系進行浮選，得到兩種體系中茜素紅回收率，以此對比浮選效果。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點及有益效果：

（1）本發(fā)明建立了雙水相浮選體系浮選分離鄰羥基化合物茜素紅。由于該模型化合物茜素紅不具備疏水性與表面活性，很難從浮選體系中分離出，本發(fā)明加入了合成的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀作為補集劑，可與茜素紅有效結(jié)合，同時，功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀作為一種表面活性劑其疏水嵌段PPO可以在疏水性氣泡界面有效吸附，實現(xiàn)了水溶性茜素紅的浮選分離。這樣得到的茜素紅富集倍數(shù)大，純度高，非常有利于提高產(chǎn)品的收率。

（2）本發(fā)明使用雙水相浮選法分離鄰羥基化合物，與傳統(tǒng)有機溶劑萃取法相比，浮選不需要使用大量的有機溶劑，更重要的是避免對天然鄰羥基化合物的結(jié)構(gòu)造成某些不可逆的損害，從而保護了其性質(zhì)與特殊生理作用不被破壞。

（3）本發(fā)明采用正丙醇—K₂HPO₄雙水相浮選，兩相組成均具有綠色環(huán)保、保護目標天然產(chǎn)物活性、成本低的優(yōu)點，這種簡單方便的體系和操作方法也有利于放大生產(chǎn)。

（4）本發(fā)明采用堿性鹽K₂HPO₄作為成相物質(zhì)，隨著K₂HPO₄加入量的提高，鹽析作用增強，體系分相完全得到更大的上相體積，且K₂HPO₄濃度的增大使得溶液pH值升高，更有利于捕集劑-茜素紅復(fù)合物的生成，由此可獲得更高的茜素紅的回收率。

（5）本發(fā)明考慮到浮選體系的浮選效果會隨著浮選時間的延長而提升的效果以及考慮到時間成本，考察了10-50 min不同時間的浮選效果，在40 min內(nèi)可得到最大的茜素紅回收率，選擇該浮選時間既能得到最好浮選效果又節(jié)約了時間。相比于一般雙水相萃取，選擇該浮選體系所需時間較短，效率更高。

附圖說明

圖1是苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀ H¹NMR圖。

具體實施方式

下面的實施實例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解本發(fā)明，但不以任何方式限定本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠做出的任何顯而易見的改進替換或變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。

下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1：苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀的合成

將0.12 g間羧基苯硼酸加入17.50 mL二氯甲烷中，充分溶解后向其中加入124 μL草酰氯，并滴加4滴N,N-二甲基甲酰胺以引發(fā)反應(yīng)。所得溶液在室溫下攪拌反應(yīng)12 h，接著減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾除去溶劑得到黃色液態(tài)產(chǎn)物即3-甲酰氯苯硼酸0.12 g。將0.12 g產(chǎn)物3-甲酰氯苯硼酸溶于17.50 mL二氯甲烷中得到溶液A；將0.50 g PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀溶于35.00 mL二氯甲烷中，并向其中加入150 μL三乙胺得到溶液B。接著在冰水浴冷卻下，將全部17.50 mL溶液A滴入35.00 mL溶液B中。滴加完全后撤去冰水浴，體系在室溫下攪拌反應(yīng)12 h。接著減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾除除去溶劑，向體系中加入5 mL水，并加熱分相。收集下相干燥得苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀產(chǎn)品。

該實施例下得到的產(chǎn)物H¹NMR圖如圖1所示，由圖可知，苯硼酸基團對應(yīng)的氫證實了苯硼酸基團的成功引入。

（2）苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀的性能鑒定：

濁點測定：分別向兩個25.00 mL比色管中加入0.10 g的PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀和0.10 g功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀，與10 mg山梨醇（一種鄰二羥基化合物），向比色管中加入一定量的蒸餾水，使體系總質(zhì)量達到20 g。將溶液充分混合搖勻后，再調(diào)節(jié)溶液pH至8。用濁度法測得PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀濁點為58.1 ℃，用濁度法和紫外法分別測得功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀的濁點為42.4 ℃和41.8 ℃。可以發(fā)現(xiàn)，PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀的濁點不受山梨醇加入量的影響，而兩種濁點測量方法結(jié)果基本一致，都顯示了改性后的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀的濁點隨山梨醇加入量的增加發(fā)生了顯著的升高；該結(jié)果也證實了硼酸基團的成功引入。

鹽析實驗：分別向兩個5.00 mL比色瓶中加入0.20 g PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀和0.20 g功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀，并加入適量蒸餾水使體系總質(zhì)量達到2.00 g。接著向體系中加入一定量的K₂HPO₄，使體系中K₂HPO₄終濃度為30%，充分震蕩體系，待K₂HPO₄完全溶解后，將體系靜置15min后，觀察到PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀沒有析出，而功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀有大量析出。說明此時功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀受鹽濃度影響，析出效果很好，疏水性很強；兩種聚合物不同析出情況也證明了苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀的成功改性。

實施例2：雙水相浮選體系分離純化鄰羥基化合物

（1）向50 mL比色管中加入0.1 mg茜素紅以及8 g的K₂HPO₄，接著加入

0.05g實施例1中制備的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀作為浮選捕集劑并用蒸餾水稀釋至50 mL，充分震蕩溶液體系混合均勻。所得溶液靜置15min后倒入浮選柱中，接著加入5 mL正丙醇，調(diào)節(jié)氣體流量至5 mL/min并開始浮選。10 min后，體系分為兩相。

（2）待分相后，記錄上相體積為2.9 mL，并用如下方法測定茜素紅濃度：取1.00 mL待測樣品與9.00 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料離心管中，充分震蕩溶液使其混合均勻。接著以蒸餾水作為空白試劑，并于424nm處測定樣品吸光度。重復(fù)上述測定三次，并記錄其平均值。并根據(jù)紫外-可見分光光度法得到茜素紅濃度為0.0104 mg/mL。最后計算茜素紅的回收率為30.2%。

實施例3：雙水相浮選體系分離純化鄰羥基化合物

（1）向50 mL比色管中加入1 mg茜素紅以及16 g的K₂HPO₄，接著加入

0.4 g實施例1中制備的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀作為浮選捕集劑并用蒸餾水稀釋至50 mL，充分震蕩溶液體系混合均勻。所得溶液靜置15min后倒入浮選柱中，接著加入5 mL正丙醇，調(diào)節(jié)氣體流量至25 mL/min并開始浮選。50 min后，體系分為兩相。

（2）待分相后，記錄上相體積為4.1 mL，并用如下方法測定茜素紅濃度：取1.00 mL待測樣品與9.00 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料離心管中，充分震蕩溶液使其混合均勻。接著以蒸餾水作為空白試劑，并于424nm處測定樣品吸光度。重復(fù)上述測定三次，并記錄其平均值。并根據(jù)紫外-可見分光光度法得到茜素紅濃度為0.1310 mg/mL。最后計算茜素紅的回收率為53.7%。

實施例4：雙水相浮選體系分離純化鄰羥基化合物

（1）向50 mL比色管中加入0.2 mg茜素紅以及12 g的K₂HPO₄，接著加入

0.3 g實施例1中制備的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀作為浮選捕集劑并用蒸餾水稀釋至50 mL，充分震蕩溶液體系混合均勻。所得溶液靜置15min后倒入浮選柱中，接著加入5 mL正丙醇，調(diào)節(jié)氣體流量至15 mL/min并開始浮選。50 min后，體系分為兩相。

（2）待分相后，記錄上相體積為4.4 mL，并用如下方法測定茜素紅濃度：取1.00 mL待測樣品與9.00 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料離心管中，充分震蕩溶液使其混合均勻。接著以蒸餾水作為空白試劑，并于424nm處測定樣品吸光度。重復(fù)上述測定三次，并記錄其平均值。并根據(jù)紫外-可見分光光度法得到茜素紅濃度為0.0396 mg/mL。最后計算茜素紅的回收率為87.1%。

實施例5：雙水相浮選體系分離純化鄰羥基化合物

（1）向50 mL比色管中加入0.6 mg茜素紅以及12 g的K₂HPO₄，接著加入

0.3 g實施例1中制備的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀作為浮選捕集劑并用蒸餾水稀釋至50 mL，充分震蕩溶液體系混合均勻。所得溶液靜置15min后倒入浮選柱中，接著加入5 mL正丙醇，調(diào)節(jié)氣體流量至10 mL/min并開始浮選。40 min后，體系分為兩相。

（2）待分相后，記錄上相體積為4.4 mL，并用如下方法測定茜素紅濃度：取1.00 mL待測樣品與9.00 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料離心管中，充分震蕩溶液使其混合均勻。接著以蒸餾水作為空白試劑，并于424nm處測定樣品吸光度。重復(fù)上述測定三次，并記錄其平均值。并根據(jù)紫外-可見分光光度法得到茜素紅濃度為0.1252 mg/mL。最后計算茜素紅的回收率為91.8%。

實施例6：雙水相浮選體系分離純化鄰羥基化合物

（1）向50 mL比色管中加入0.6 mg茜素紅以及12 g的K₂HPO₄，接著加入0.3 g實施例1中制備的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀作為浮選捕集劑并用蒸餾水稀釋至50 mL，充分震蕩溶液體系混合均勻。所得溶液靜置15min后倒入浮選柱中，接著加入5 mL正丙醇，調(diào)節(jié)氣體流量至15 mL/min并開始浮選。40 min后，體系分為兩相。

（2）待分相后，記錄上相體積為4.0 mL，并用如下方法測定茜素紅濃度：取1.00 mL待測樣品與9.00 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料離心管中，充分震蕩溶液使其混合均勻。接著以蒸餾水作為空白試劑，并于424nm處測定樣品吸光度。重復(fù)上述測定三次，并記錄其平均值。并根據(jù)紫外-可見分光光度法得到茜素紅濃度為0.1461 mg/mL。最后計算茜素紅的回收率為97%。

（3）在此最優(yōu)浮選條件下，進行對比試驗：分別對不加入捕集劑和加入0.3 g的苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀兩種體系進行浮選，得到兩種體系中茜素紅回收率分別為20%和97%?？梢杂^察到模型化合物茜素紅回收率由最初的20%顯著提高至97%，表明了浮選捕集劑苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀與茜素紅的有效結(jié)合，對茜素紅的分離回收效果明顯，同時也驗證了苯硼酸功能化PEO₂₀PPO₆₀PEO₂₀對于親水性鄰二羥基化合物選擇性浮選分離的重要意義。