本發(fā)明涉及一種具有線粒體靶向和雙光子性質(zhì)的硫化氫分子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于分析化學技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

硫化氫(H₂S)在生物體內(nèi)由酶催化產(chǎn)生，作為人體內(nèi)氣體信號分子，在調(diào)節(jié)人的生理機能方面起著極其重要的作用。例如，調(diào)節(jié)血管張力、心肌收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)和胰島素分泌等；硫化氫還能夠有效清除活性氧，活性氮物種，例如：過氧化氫、超氧陰離子、次氯酸、過氧亞硝基等；硫化氫可參與血紅蛋白改變；參與體內(nèi)亞硝基類化合物的還原；調(diào)節(jié)體內(nèi)多種酶的功能。實驗表明，硫化氫能夠有效地降低AP誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞毒性。硫化氫與FPG表現(xiàn)為負比例關(guān)系，升高二型糖尿病病人硫化氫濃度也許有助于降血糖。但是，生物體內(nèi)硫化氫失調(diào)，便會引起動脈和肺動脈高壓、老年癡呆癥、胃粘膜損傷和肝硬化等疾病。所以對生物體內(nèi)硫化氫的檢測意義極其重要。

然而目前對H₂S的檢測缺少具有靶向性的探針，不能對細胞內(nèi)某一特定的細胞器內(nèi)的硫化氫進行檢測，特別缺少對細胞內(nèi)線粒體靶向的硫化氫探針，從而缺少研究細胞病變過程中對線粒體中硫化氫濃度變化情況的檢測工具。本專利通過分子設(shè)計，實現(xiàn)了專一性識別硫化氫和在線粒體中檢測硫化氫的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前硫化氫分子熒光探針檢測所面臨的問題的現(xiàn)狀，本發(fā)明通過分子設(shè)計，合成出一種具有線粒體靶向和雙光子性質(zhì)的硫化氫分子熒光探針。

本發(fā)明還提供了一種具有線粒體靶向和雙光子性質(zhì)的硫化氫分子熒光探針的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種具有線粒體靶向和雙光子性質(zhì)的硫化氫分子熒光探針，它的分子式為：C₃₅H₂₉N₅O₃PBr，其結(jié)構(gòu)式如式I所示：

簡記為Mito-H₂S。

上述的具有線粒體靶向和雙光子性質(zhì)的硫化氫分子熒光探針的制備方法，它包括以下步驟：

1)將1eq的4-溴-1,8萘二酸酐和1.5eq的β-氨基丙酸溶于甲醇中，氮氣保護，加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，有固體析出，將固體過濾，得粗產(chǎn)品化合物1-1，直接投下一步反應(yīng)；所述化合物1-1的結(jié)構(gòu)式如下：

2)將1eq的三苯基磷，1eq的3-溴丙胺氫溴酸溶于乙腈中，氮氣保護，加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，然后分離提純得到化合物1-2；所述化合物1-2的結(jié)構(gòu)式如下：

3)將所制備的1eq的化合物1-1溶于DMF中，依次加入1eq的HOBt，1eq的EDCI，室溫反應(yīng)30min，然后再加入1eq的化合物1-2，常溫反應(yīng)4-5小時，反應(yīng)完成后，分離提純純化得到化合物1-3；所述化合物1-3的結(jié)構(gòu)式如下：

4)將1eq的化合物1-3溶于DMF中，然后向反應(yīng)液中加入1.2eq的NaN₃，氮氣保護，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完成后通過柱色譜分離得到目標化合物Mito-H₂S。

本發(fā)明探針的合成路線如下：

優(yōu)選的，所述步驟1)中加熱反應(yīng)溫度為75℃，反應(yīng)時間為6小時。

優(yōu)選的，所述步驟2)中加熱反應(yīng)溫度為85℃，反應(yīng)時間為16小時；所述步驟2)中分離提純化合物的具體方法為：將反應(yīng)產(chǎn)物加入20mL石油醚，有固體析出，將固體過濾，石油醚洗滌，得粗產(chǎn)品，然后用二氯甲烷溶解，并用柱色譜層析分離；所述柱色譜洗脫劑配比為甲醇：二氯甲烷＝1:50。

優(yōu)選的，所述步驟3)中分離提純化合物的具體方法為：將反應(yīng)產(chǎn)物用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，然后用柱色譜進行分離；所述柱色譜分離的洗脫劑配比為甲醇：二氯甲烷＝1:30。

優(yōu)選的，所述步驟4)中室溫反應(yīng)時間為16小時；所述步驟4)中分離提純化合物的方法為：將反應(yīng)產(chǎn)物用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用柱色譜進行分離；所述柱色譜分離的洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:30。

本發(fā)明還提供了一種上述的具有線粒體靶向和雙光子性質(zhì)的硫化氫分子熒光探針的應(yīng)用，該探針可以應(yīng)用于水環(huán)境和生物細胞體系中硫化氫的傳感檢測；所述的傳感檢測包含熒光檢測，目視定性檢測，細胞成像檢測。

本發(fā)明的優(yōu)點是：(1)探針的合成只需要四步就可以完成，且后處理過程相對簡單；(2)本發(fā)明通過疊氮識別位點提高化合物對硫化氫的選擇專一性，并且三苯基膦正離子加入實現(xiàn)了靶向檢測線粒體內(nèi)硫化氫的目的。該探針具有選擇性好，響應(yīng)速度快，抗其他分子干擾能力強等特點。此外，用肉眼就可以觀察到溶液顏色的變化，伴隨著紫外燈下同樣可以觀察到熒光顏色變化，是一種具有生色傳感功能的熒光探針?；谄涮禺愋郧绎@著的顏色變化，該試劑可作為顯示水溶液中和生物細胞內(nèi)硫化氫分子存在的專一性指示劑，可進行實時定性及定量的目視比色法檢測。故而，本發(fā)明是一種簡單，快速，靈敏的硫化氫分子特異性檢測試劑，在生物分子檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。其性能將在實施例中結(jié)合附圖給予詳細說明。

附圖說明

圖1是實施例一中探針Mito-H₂S的¹H NMR圖譜；

圖2是探針Mito-H₂S隨Na₂S的加入熒光譜圖的變化情況；

圖3是探針Mito-H₂S對不同離子和分子的選擇性熒光譜圖；

圖4是探針Mito-H₂S對不同離子和分子的選擇性柱狀圖數(shù)據(jù)；

圖5是探針Mito-H₂S溶液在N_a2S加入前后溶液顏色的變化；

圖6是探針Mi_to-H₂S溶液在Na₂S加入前后溶液用紫外燈照射后熒光顏色的變化；

圖7是探針Mito-H₂S應(yīng)用與細胞中對外源性H₂S進行熒光成像；a)只有熒光探針Mito-H₂S(5_μM)的熒光成像明場圖；b)只有熒光探針Mito-H₂S(5_μM)綠通道成像圖；c)明場與熒光成像圖重疊圖；d)將探針Mito-H₂S(5μM)加入到HeLa細胞中培養(yǎng)30min后，加入50μM Na₂S再培養(yǎng)20min后明場圖，e)加入Na₂S后綠通道熒光成像圖；f)明場d與熒光成像e圖重疊圖。

圖8是探針Mito-H₂S熒光探針對H₂S在細胞中的熒光成像圖，a)只經(jīng)過探針Mito-H₂S(20μM)培育后的小鼠肝臟組織雙光子成像圖；b)探針Mito-H₂S(20_μM)培育30min后再加入100μM的Na₂S培育50min后的小鼠肝臟組織雙光子熒光成像圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限制，實施例中化合物的號碼對于上述方案中化合物的號碼。

實施例1

化合物1-1的合成：

將4-溴-1,8萘二酸酐(2.77g，10mmol，1eq)，β-氨基丙酸(1.34g，15mmol，1.5eq)溶于30mL甲醇中，氮氣保護，75℃加熱回流反應(yīng)6h。用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，有固體析出。將固體過濾，干燥，得粗產(chǎn)品，產(chǎn)率為68％。直接投下一步反應(yīng)。

化合物1-2的合成：

將三苯基磷(2.0g，7.54mmol，1eq)，3-溴丙胺氫溴酸(1.65g，7.54mmol，1eq)溶于20mL乙腈中，氮氣保護，85℃加熱回流反應(yīng)16h。用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫。加入20mL石油醚，有固體析出，將固體過濾，石油醚洗滌，得粗產(chǎn)品。用二氯甲烷溶解，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:50。產(chǎn)率為79％。

化合物1-3的合成：

將化合物1-1(700mg，1.75mmol，1eq)溶于3mL DMF中，依次加入HOBt(236.3mg，1.75mmol，1eq,EDCI(336mg，1.75mmol，1eq)，室溫反應(yīng)30min。然后再加入化合物1-2(609mg，1.75mmol，1eq)，常溫反應(yīng)4-5小時。用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:30。產(chǎn)率為72％。

化合物Mito-H₂S的合成：

將化合物1-3(350mg，0.538mmol，1eq)溶于3mL DMF中，然后向反應(yīng)液中加入NaN₃(42mg，0.646mmol，1.2eq)。氮氣保護，室溫反應(yīng)16小時。用TCL板檢測反應(yīng)，反應(yīng)完全后，用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑得粗產(chǎn)品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:30。產(chǎn)率為65％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.47–8.40(m,1H),8.40–8.35(m,1H),8.25–8.18(m,1H),7.96–7.88(m,3H),7.87–7.74(m,13H),7.72(d,J＝8.0Hz,1H),4.23(t,J＝7.3Hz,2H),3.59(d,J＝14.3Hz,2H),3.20(d,J＝6.0Hz,2H),2.46(t,J＝7.3Hz,2H),1.65(s,2H)。該探針的¹H NMR圖譜見圖1。

實施例2

化合物Mito-H₂S硫化氫熒光探針隨Na₂S加入當量的增加熒光譜圖的變化

取實施例1制備的Mi_to-H₂S熒光探針溶于二甲基亞砜(DMSO)中，制成1mmol/L儲備液。從儲備液中取出30μL加入到5mL的離心管當中，用PBS緩沖溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)與DMSO體積比為2:1的溶液稀釋至3mL，加入不同當量(0-30eq)的硫化鈉標準溶液，以440nm為激發(fā)光測量其熒光性質(zhì)。熒光光譜如圖2所示。由圖2可見，隨著Na₂S加入當量的增加熒光逐漸增強。

實施例3

化合物Mito-H₂S熒光探針對不同分子或離子的選擇性

從實施例2中熒光探針儲備液中取出30μL加入到5mL的離心管當中，用PBS緩沖溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)與DMSO體積比為2:1的溶液稀釋至3mL，配制一系列溶液，分別加入等摩爾量的競爭分子標準溶液，其中一個加入等摩爾量的硫化鈉標準溶液，30min后以440nm為激發(fā)光檢測溶液的熒光發(fā)射光譜變化，由圖3和圖4結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，其他離子對化合物Mito-H₂S的熒光幾乎沒有影響，而硫化鈉溶液的加入使化合物Mito-H₂S的熒光顯著增強。

實施例4

化合物Mito-H₂S熒光探針對硫化氫的可視化檢測

從實施例2中熒光探針儲備液中取出30μL加入到5mL的樣品管當中，加入30摩爾量的硫化鈉標準溶液如圖5所示，硫化鈉可以使合物Mi_to-H₂S熒光探針的PBS：DMSO體積比為2:1的緩沖溶液溶液發(fā)生明顯的顏色變化，溶液顏色從淡黃色變成紅褐色(圖5)。伴隨著紫外燈下肉眼可視的硫化氫誘導(dǎo)熒光探針發(fā)出明亮的黃色熒光(圖6)，說明是一種具有生色傳感功能的熒光探針。

實施例5

化合物Mi_to-H₂S熒光探針對細胞外源性硫化氫熒光成像

我們將本發(fā)明所得到的熒光探針Mito-H₂S應(yīng)用到HeLa細胞中對硫化氫進行熒光成像應(yīng)用。具體操作步驟如下：將5μM Mito-H₂S熒光探針的DMSO溶液加入到兩個育有HeLa細胞的培養(yǎng)皿中，并對培養(yǎng)皿進行編號，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后用PBS對細胞進行洗滌三次。在一號培養(yǎng)皿中什么都不加，二號培養(yǎng)皿中加入20μM Na₂S。在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，用共聚焦顯微鏡進行成像。首先對一號培養(yǎng)皿進行成像。用488nm的激光進行激發(fā)，在明場通道可以觀看到細胞的輪廓圖，而在綠色通道(500nm-550nm)對細胞進行熒光成像時，此時觀察不到熒光發(fā)射。對二號培養(yǎng)皿進行成像研究發(fā)現(xiàn)在綠色通道下可以清醒的看到探針對H₂S的熒光成像圖，結(jié)果如圖7所示。此實驗可以說明探針Mito-H₂S能夠在細胞內(nèi)對H₂S進行熒光成像。

實施例6

化合物Mito-H₂S熒光探針對小鼠肝臟組織進行雙光子熒光成像

利用本探針對小鼠肝臟組織內(nèi)的硫化氫進行雙光子熒光成像研究，其具體的操作步驟如下：取400μm厚的小鼠肝臟組織兩份，將其浸泡在PBS培養(yǎng)液中，并對兩份組織培養(yǎng)皿進行編號，其中一號培養(yǎng)皿為參比樣，二號為測試分析樣。向兩份樣品中各加入20μM的探針Mito-H2S，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，用PBS洗滌三次后，向測試培養(yǎng)皿中加入100μM的Na2S，并在培養(yǎng)箱中培育50min后用PBS進行洗滌，將參比樣和分析樣用780nm的激光為激發(fā)光進行雙光子成像，探測發(fā)射光通道為綠色通道(500nm-550nm)，成像圖如圖8所示。通過對參比樣和分析樣的對比發(fā)現(xiàn)，探針Mito-H2S能夠?qū)π∈蟾闻K組織內(nèi)的硫化氫進行熒光成像。