本發(fā)明涉及一種微流控生物芯片，具體涉及一種用于細胞高精度排列及檢測的微流控生物芯片。

背景技術(shù)：

微流控芯片又稱微流控芯片實驗室或芯片實驗室，是一種以在微米尺度的空間中對流體、顆粒等進行操控與檢測為主要特征的技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)、分析化學(xué)及食品科學(xué)等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力，具有所需樣品體積小、檢測效率高、使用成本低且易于和其他技術(shù)設(shè)備集成、具有良好的兼容性、有望實現(xiàn)便攜式檢測等優(yōu)點，成為當(dāng)今的研究熱點之一。例如中國專利申請ZL201310602808.2，名稱為：一種用于細胞富集與提取的微流體生物芯片，利用突縮結(jié)構(gòu)使流體及細胞加速經(jīng)過突縮結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生側(cè)向運動，實現(xiàn)細胞的富集與提取。但是其通道寬度較小(80μm)、僅能在高流量條件下實現(xiàn)細胞富集與提取(最高至700微升每分鐘)。高流量條件下，細胞受到流體的強烈剪切作用易造成結(jié)構(gòu)變化，甚至破裂，從而對后續(xù)細胞的精確檢測帶來極大的影響。

細胞的高精度排列及檢測對于生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷、藥效分析等領(lǐng)域具有重要的意義。具體而言，通過將目標(biāo)細胞高精度地排列成一條直線，使其依次經(jīng)過檢測區(qū)，獲得目標(biāo)細胞種類、尺寸及其他特征信息，可實現(xiàn)對目標(biāo)細胞的高精度檢測。如臨床診斷中的血常規(guī)檢測，通常需要將血細胞進行有序地排列，使其依次經(jīng)過檢測區(qū)，結(jié)合光學(xué)等檢測手段實現(xiàn)對各類血細胞的高精度檢測，獲得各類血細胞的種類、數(shù)量等信息，對于疾病的早期診斷和病情監(jiān)測有著重要的意義。另外，以對癌癥的預(yù)防與治療為例，病情發(fā)生早期，癌細胞處于擴散期，血液中的癌細胞含量只占到血液細胞總量的億分之一，相當(dāng)于一毫升血液中最多只有一個癌細胞。因此，將血液中濃度極低的癌細胞進行高精度地排列，對于癌細胞的準(zhǔn)確精測與病情的早期診斷有著重要的意義。另一方面，通過對病變或目標(biāo)靶細胞的高精度排列及檢測，可獲得用藥前后血液中相應(yīng)細胞的濃度變化信息，對藥物開發(fā)和治療效果的評估意義重大。

對細胞進行排列與檢測的傳統(tǒng)手段主要是流式細胞儀，在流式細胞儀中，待檢測細胞的有序排列主要在流動室中實現(xiàn)，流動室的兩側(cè)設(shè)有一對鞘液管，待檢測細胞在鞘液的擠壓作用下被高精度地排列在檢測區(qū)域的中心，而后依次穿過激光檢測區(qū)域，避免待測細胞在激光檢測區(qū)的漏檢，最終準(zhǔn)確地得到待檢細胞的類型、數(shù)量、大小等諸多信息。雖然流式細胞儀已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷等各領(lǐng)域，但具有以下缺點：1)價格昂貴，成本高，限制了其在生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷等領(lǐng)域中的應(yīng)用；2)體積大、不便攜，無法被方便地應(yīng)用于現(xiàn)場急救、家庭醫(yī)療及個人保健等方面；3)儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，安裝繁瑣，維修與保養(yǎng)費用較高，后期使用成本較高；4)不同的樣本均需要在同一個檢測通道中處理，存在不同樣本間相互污染的風(fēng)險，不利于樣本的精確檢測。此外，需要指出的是利用鞘流進行細胞有序排列，高流量條件下，細胞受到較為強烈的剪切作用易造成結(jié)構(gòu)變化，甚至被破壞。因此，需要進一步研發(fā)安全性高、成本低、效率高、體積小、便攜式的細胞排列及檢測儀器，實現(xiàn)低流量條件下細胞的高精度排列，保證細胞安全與準(zhǔn)確檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于細胞高精度排列及檢測的微流控生物芯片，能對細胞等生物活性顆粒進行安全、高精度排列和檢測，具有加工容易、結(jié)構(gòu)簡單、成本低、效率高、通量高、便于攜帶等優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷與治療等領(lǐng)域，具有很好的應(yīng)用前景。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于細胞高精度排列及檢測的微流控生物芯片，由蓋片層8和置于蓋片層8下的載片10組成；所述蓋片層8上開設(shè)有緩沖液加液區(qū)1、細胞樣本液加液區(qū)9、細胞排列微通道2、入射光纖3、導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6、流體擴張區(qū)7、細胞檢測區(qū)5和液體排液區(qū)4；所述細胞排列微通道2的一側(cè)為平直壁面，另一側(cè)帶有向細胞排列微通道2內(nèi)凸出的由突縮和漸擴結(jié)構(gòu)組成的直角尖角結(jié)構(gòu)；所述細胞排列微通道2入口為二分叉結(jié)構(gòu)，用于與緩沖液加液區(qū)1和細胞樣本液加液區(qū)9連通，其中細胞樣本液加液區(qū)9的外側(cè)壁面與細胞排列微通道2帶有直角尖角結(jié)構(gòu)的側(cè)壁面位于同一平面；所述細胞排列微通道2出口與流體擴張區(qū)7連通；流體擴張區(qū)7用于擴張樣本液，降低含有細胞的樣本液流速，保證細胞安全和后續(xù)精確檢測；流體擴張區(qū)7后端與細胞檢測區(qū)5相連通；在細胞檢測區(qū)5中細胞依次經(jīng)過，實現(xiàn)對細胞的精確檢測；細胞檢測區(qū)5后端與液體排液區(qū)4相連通；所述入射光纖3與外部激光發(fā)生裝置相連，用于將激光束引入細胞檢測區(qū)5，照射經(jīng)熒光染色的細胞以激發(fā)熒光；所述導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6用于導(dǎo)出被激發(fā)的熒光或?qū)Ρ患ぐl(fā)的熒光進行光電轉(zhuǎn)化并導(dǎo)出，與外部分析系統(tǒng)相連，實現(xiàn)信號分析；所述緩沖液加液區(qū)1、細胞樣本液加液區(qū)9和液體排液區(qū)4為在蓋片層8上開設(shè)的通孔，所述細胞排列微通道2、流體擴張區(qū)7及細胞檢測區(qū)5為在蓋片層8與載片10相接觸的表面上開設(shè)的盲道；所述入射光纖3和導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6為內(nèi)嵌于蓋片層8與載片10相接觸表面的內(nèi)嵌組件，底部與載片10表面相接觸，端部與細胞檢測區(qū)5內(nèi)的流體直接接觸。

所述蓋片層8和載片10通過等離子處理結(jié)合在一起。

所述細胞排列微通道2、流體擴張區(qū)7及細胞檢測區(qū)5位于蓋片層8和載片10相結(jié)合處的中央位置。

所述細胞排列微通道2寬度為350μm，可有效降低流體速度，減少流體剪切對細胞帶來的破壞，在其擴張區(qū)細胞經(jīng)過下一個直角尖角結(jié)構(gòu)前，由于運動方向的突然改變，而向帶有尖角結(jié)構(gòu)一側(cè)的壁面運動，同時受到慣性升力作用，最后高精度地排列在一條直線上。

所述緩沖液加液區(qū)1、細胞樣本液加液區(qū)9和液體排液區(qū)4均為圓柱形孔。

所述細胞排列微通道2內(nèi)凸出的直角尖角結(jié)構(gòu)為15-60個。

所述直角尖角結(jié)構(gòu)在垂直流動方向上的直角邊長度為310μm，單個尖角結(jié)構(gòu)及其后的擴張區(qū)在流動方向上長度之和為600μm。

所述細胞檢測區(qū)5寬度小于流體擴展區(qū)7末端通道寬度，其兩側(cè)壁面由入射光纖3和導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6的端面構(gòu)成。

所述入射光纖3和導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6中所涉及的光纖直徑為100μm-200μm。

對于尺寸大于9μm的細胞進行高精度排列與檢測時，保持緩沖液加液區(qū)1封閉，含有經(jīng)熒光染色的細胞樣本液由細胞樣本液加液區(qū)9以一定的流量注入微流控芯片；對于尺寸小于9μm的細胞進行高精度排列與檢測時，將緩沖液通過緩沖液加液區(qū)1注入微流控芯片，同時含有經(jīng)熒光染色的細胞樣本液由細胞樣本液加液區(qū)9以一定的流量注入微流控芯片。

所述蓋片層8的材料為聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。

所述載片10的材料為玻璃或硅。

本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有如下優(yōu)點：

1)安全、細胞排列精度高。中國專利公布號：CN 103642671A，中國專利申請?zhí)枺?01310602808.2，名稱為：一種用于細胞富集與提取的微流體生物芯片，是利用突縮結(jié)構(gòu)使流體及細胞加速經(jīng)過突縮結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生側(cè)向運動，高流量條件下才能實現(xiàn)細胞富集與提取(最高至700微升每分鐘)。與之相比，本發(fā)明實現(xiàn)細胞高精度排列的幾何結(jié)構(gòu)和機理不同，本發(fā)明在寬度更大(350μm)的微通道內(nèi)引入直角尖角結(jié)構(gòu)，利用細胞在微通道的擴張區(qū)經(jīng)過下一個直角尖角結(jié)構(gòu)前，由于運動方向的突然改變，而向帶有尖角結(jié)構(gòu)一側(cè)壁面運動，同時結(jié)合細胞受到慣性升力作用，最后將細胞高精度地排列在一條直線上。本發(fā)明可在較低流體剪切作用條件下實現(xiàn)細胞的高精度排列與檢測(小于200微升每分鐘，最低可至20微升每分鐘)，可有效避免高流體剪切作用對細胞的破壞，保證細胞安全，為后續(xù)顆粒精確檢測奠定重要基礎(chǔ)。

2)體積小，便于攜帶，本發(fā)明基于微流體技術(shù)，細胞排列及檢測等功能性組件尺寸為微米級別，均可被設(shè)計在芯片上，因此本發(fā)明可以方便地應(yīng)用于現(xiàn)場急救、家庭醫(yī)療及個人保健等方面。

3)成本低，制作容易。本發(fā)明的微流控芯片通過簡單的標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)就可實現(xiàn)加工制作，因而本發(fā)明適合于大規(guī)模生產(chǎn)和市場推廣。

4)結(jié)構(gòu)簡單，操作容易。本發(fā)明無需對較多的緩沖液進行精確的流量控制，操作容易簡單，操作人員無需專業(yè)培訓(xùn)。

5)無相互污染的風(fēng)險。與流式細胞儀相比，本發(fā)明成本極低。因此，對不同待測樣本可使用不同的微流控芯片，可有效避免不同樣本間的相互污染，保證樣本檢測的準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明用于細胞高精度排列及檢測的微流控芯片俯視圖。

圖2為圖1沿A-A向的剖視圖。

圖3為本發(fā)明用于細胞高精度排列及檢測的微流控芯片的三維示意圖。

圖4為本發(fā)明用于模擬細胞高精度排列的實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明：

如圖1至圖3所示，本發(fā)明一種用于細胞高精度排列及檢測的微流控芯片，該芯片由標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)加工，所述微流控芯片由蓋片層8和置于蓋片層8下的載片10組成；所述蓋片層8上開設(shè)有緩沖液加液區(qū)1、細胞樣本液加液區(qū)9、細胞排列微通道2、入射光纖3、導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6、流體擴張區(qū)7、細胞檢測區(qū)5和液體排液區(qū)4；所述細胞排列微通道2的一側(cè)為平直壁面，另一側(cè)帶有向細胞排列微通道2內(nèi)凸出的由突縮和漸擴結(jié)構(gòu)組成的直角尖角結(jié)構(gòu)；所述細胞排列微通道2入口為二分叉結(jié)構(gòu)，用于與緩沖液加液區(qū)1和細胞樣本液加液區(qū)9連通，細胞樣本液加液區(qū)9的外側(cè)壁面與細胞排列微通道2帶有直角尖角結(jié)構(gòu)的側(cè)壁面位于同一平面；所述細胞排列微通道2出口與流體擴張區(qū)7連通；流體擴張區(qū)7用于擴張樣本液，降低含有細胞的樣本液流速，保證細胞安全和后續(xù)精確檢測；流體擴張區(qū)7后端與細胞檢測區(qū)5相連通；在細胞檢測區(qū)5中細胞依次經(jīng)過，實現(xiàn)對細胞的精確檢測；細胞檢測區(qū)5后端與液體排液區(qū)4相連通；所述入射光纖3與外部激光發(fā)生裝置相連，用于將檢測激光束引入細胞檢測區(qū)5，照射經(jīng)熒光染色的細胞以激發(fā)熒光；所述導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6用于導(dǎo)出被激發(fā)的熒光或?qū)Ρ患ぐl(fā)的熒光進行光電轉(zhuǎn)化并導(dǎo)出，與外部分析系統(tǒng)相連，實現(xiàn)信號分析；所述緩沖液加液區(qū)1、細胞樣本液加液區(qū)9和液體排液區(qū)4為在蓋片層8上開設(shè)的通孔，所述細胞排列區(qū)2、流體擴張區(qū)7及細胞檢測區(qū)5為在蓋片層8與載片10相接觸的表面上開設(shè)的盲道，；所述入射光纖3和導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6為內(nèi)嵌于蓋片層8與載片10相接觸表面的內(nèi)嵌組件，底部與載片10表面相接觸，端部與細胞檢測區(qū)5內(nèi)的流體直接接觸。本實施例緩沖液加液區(qū)1、細胞樣本液加液區(qū)9、液體排液區(qū)4腔體的直徑皆為1-2mm，高度與蓋片層8高度一致。緩沖液加液區(qū)1、細胞樣本液加液區(qū)9、細胞排列微通道2、入射光纖3、導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6、流體擴展區(qū)7、細胞檢測區(qū)5和液體排液區(qū)4形成的微通道位于蓋片層8與載片10相結(jié)合的中央位置。細胞排列微通道2寬度為350μm，深度為40μm，前端連接二分叉結(jié)構(gòu)，二分叉結(jié)構(gòu)夾角α滿足0°<α≤180°，作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，α＝45°。細胞排列微通道2包括15-60個位于通道一側(cè)的直角尖角結(jié)構(gòu)，作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，尖角個數(shù)為30，θ＝90°。尖角角度β滿足0°<β<90°，作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，β＝60°，直角尖角結(jié)構(gòu)在垂直流動方向上的直角邊長度為310μm，單個尖角結(jié)構(gòu)及其后的擴張區(qū)在流動方向上長度之和為600μm。流體擴展區(qū)7為對稱漸擴結(jié)構(gòu)，具體寬度可根據(jù)具體流速要求靈活設(shè)計，作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，流體擴展區(qū)7末端通道寬度為800μm；細胞檢測區(qū)5寬度略小于流體擴展區(qū)7末端通道寬度，其兩側(cè)壁面由入射光纖3、導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6的端面構(gòu)成；也可設(shè)計多個導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6實現(xiàn)對細胞多種性質(zhì)的有效檢測。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明中微流控芯片使用標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)加工，所述蓋片層8和載片10通過等離子處理結(jié)合在一起。也可以使用其他材料或方法，如干法、濕法刻蝕等在硅片等材料上加工本發(fā)明的微通道。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述緩沖液加液區(qū)1、細胞樣本液加液區(qū)9和液體排液區(qū)4均為圓柱形孔。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述細胞排列微通道2入口為二分叉結(jié)構(gòu)，用于與緩沖液加液區(qū)1、細胞樣本液加液區(qū)9連通，緩沖液加液區(qū)1對于較小尺寸的細胞實現(xiàn)擠壓排列，細胞樣本液加液區(qū)9的外側(cè)壁面與細胞排列微通道2帶有直角尖角結(jié)構(gòu)的側(cè)壁面位于同一平面，有利于減少流動阻力，便于細胞直接進入細胞排列微通道2實現(xiàn)高精度排列。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，直角尖角結(jié)構(gòu)在垂直流動方向上的直角邊長度為310μm，單個尖角結(jié)構(gòu)及其后的擴張區(qū)在流動方向上長度為600μm，擴張區(qū)在流動方向上長度較小可保證細胞在擴張區(qū)產(chǎn)生運動方向的突然改變而向帶有尖角結(jié)構(gòu)一側(cè)壁面運動。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述細胞排列微通道2內(nèi)凸出的尖角結(jié)構(gòu)θ＝90°，β＝60°，個數(shù)為30。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述入射光纖3和導(dǎo)出光纖或微型光電檢測器6中所涉及的光纖直徑為100μm-200μm。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述蓋片層8的材料為聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述載片10的材料為玻璃或硅。

下面以一實施例說明本發(fā)明的實施過程：

采用本發(fā)明微流控生物芯片對細胞高精度排列及檢測的具體操作如下，對于尺寸大于9μm的細胞高精度排列與檢測時，保持緩沖液加液區(qū)1封閉，樣本液由細胞樣本液加液區(qū)9以一定的流量注入微流控芯片。經(jīng)熒光染色后的細胞運動進入細胞排列微通道2，經(jīng)過直角尖角結(jié)構(gòu)進入其后的擴張區(qū)，細胞在擴張區(qū)由于運動軌跡的突然改變而產(chǎn)生顯著的動量變化，而向帶有尖角結(jié)構(gòu)一側(cè)壁面運動，同時細胞在微通道中還受到慣性升力的作用，顆粒最終被高精度地排列在一條直線上。而后經(jīng)流體擴展區(qū)7，速度進一步變慢，有效保證后續(xù)檢測精度與準(zhǔn)確度。經(jīng)高精度排列的細胞流依次進入細胞檢測區(qū)5，通過入射光纖3導(dǎo)入特定波長的激光，激光照射到每個待檢測細胞上，激發(fā)熒光通過導(dǎo)出光纖將光線導(dǎo)后出進行分析或通過微型光電檢測器6轉(zhuǎn)換成電信號再導(dǎo)出到外部分析系統(tǒng)，進而實現(xiàn)對細胞類型、數(shù)量、尺寸等屬性的快速、準(zhǔn)確、便攜式檢測。經(jīng)檢測后的細胞樣本通過液體排出區(qū)4排出微流控芯片進行滅活等處理。

對于尺寸小于9μm的細胞高精度排列與檢測時，將緩沖液(通常為磷酸緩沖液)通過緩沖液加液區(qū)1注入微流控芯片，同時含有經(jīng)熒光染色的細胞樣本液由細胞樣本液加液區(qū)9以一定的流量注入微流控芯片，由于流量差異，樣本細胞在緩沖液的擠壓作用下將依次有序地排列在細胞排列微通道2帶有尖角結(jié)構(gòu)一側(cè)壁面。而后經(jīng)流體擴展區(qū)7，速度進一步變慢，有效保證后續(xù)檢測精度與準(zhǔn)確度。經(jīng)高精度排列的細胞流依次進入細胞檢測區(qū)5，通過入射光纖3導(dǎo)入特定波長的激光，激光照射到每個待檢測細胞上，激發(fā)熒光通過導(dǎo)出光纖將光線導(dǎo)后出進行分析或通過微型光電檢測器6轉(zhuǎn)換成電信號再導(dǎo)出到外部分析系統(tǒng)，進而實現(xiàn)對細胞類型、數(shù)量、尺寸等屬性的快速、準(zhǔn)確、便攜式檢測。經(jīng)檢測后的細胞樣本通過液體排出區(qū)4排出微流控芯片進行滅活等處理。

由于本發(fā)明中細胞的高精度排列對后續(xù)細胞的準(zhǔn)確的檢測尤為重要，為驗證本發(fā)明細胞排列的精度與效率，使用本發(fā)明對9.9μm聚苯乙烯顆粒(模擬血液中細胞)的高精度排列進行實驗驗證。保持緩沖液加液區(qū)1封閉，采用注射泵以一定的流量將含有聚苯乙烯顆粒的樣本液通過細胞樣本液加液區(qū)9注入微流控芯片內(nèi)，利用顯微鏡和CCD攝相機拍攝流體擴張區(qū)7中的顆粒排列情況。實驗證明本發(fā)明在流量為20微升每分鐘到200微升每分鐘的范圍內(nèi)，可以將顆粒高精度地排列在一條直線。由于流量較低，流體對細胞的剪切作用較弱，可有效保證細胞的活性與安全。圖4為流量為40微升每分鐘及100微升每分鐘時，流體擴展區(qū)7中的顆粒排列實驗結(jié)果圖。實驗驗證本發(fā)明可實現(xiàn)對細胞的高精度排列，通過結(jié)合后續(xù)光學(xué)等檢測手段，可實現(xiàn)對細胞的精確、便攜式檢測，在生物醫(yī)學(xué)、分析化學(xué)及食品科學(xué)等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用潛力。