本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于敲除人CYP2E1基因的gRNA序列、CYP2E1基因缺失細(xì)胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：CYP2E1是細(xì)胞色素P450家族里非常重要的成員之一，CYP2E1基因位于第10號(hào)染色體上，有11413bp，含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，編碼含有493個(gè)氨基酸的蛋白。CYP2E1主要存在于肝臟和腎臟細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)，主要參與外來化學(xué)物的體內(nèi)代謝和生物轉(zhuǎn)化，還參與了機(jī)體的氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡與自噬、炎癥反應(yīng)等過程，會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷及產(chǎn)生毒性。因此，急需要構(gòu)建一種CYP2E1基因缺陷型人胚胎腎臟細(xì)胞株，用于CYP2E1相關(guān)的藥物和毒物代謝研究、外源性化學(xué)物毒性研究、致癌性研究以及藥物-藥物交互作用研究，為進(jìn)一步進(jìn)行腫瘤相關(guān)藥物研究和外源化學(xué)物代謝研究提供良好的工具和平臺(tái)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種后天免疫防御系統(tǒng)，用以保護(hù)細(xì)菌或古細(xì)菌免受外來質(zhì)?；蚴删w的侵入，這類細(xì)菌或古細(xì)菌基因組的CRISPR序列能表達(dá)與入侵者基因組序列相識(shí)別的RNA，在CRISPR相關(guān)酶(CAS9)的作用下切割外源基因組DNA，達(dá)到抵制入侵的目的，經(jīng)過人為改造后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在真核細(xì)胞中高度靈活且特異的基因組編輯，是目前基因組編輯領(lǐng)域最受歡迎的新一代基因組編輯技術(shù)，目前該技術(shù)已被用于構(gòu)建各類基因敲除細(xì)胞系和基因敲除動(dòng)物模型?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，與CRISPR/Cas9系統(tǒng)最為相似的是siRNA靶向的基因沉默技術(shù)，siRNA靶向的基因沉默是在轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)基因沉默，其對(duì)基因表達(dá)的沉默作用往往并不徹底，達(dá)不到預(yù)期的沉默效果。現(xiàn)有報(bào)道的siRNA(例：siCYP2E1)在mRNA或蛋白水平的沉默不徹底，無法完全沉默基因的表達(dá)，不能構(gòu)建真正的CYP2E1基因缺陷細(xì)胞株。目前，有必要提供一種不僅能實(shí)現(xiàn)沉默徹底、且能長(zhǎng)期穩(wěn)定體外培養(yǎng)的CYP2E1基因缺陷型人胚胎腎臟細(xì)胞株。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列、CYP2E1基因缺失細(xì)胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。第一方面，本發(fā)明提供了一種用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列為SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示序列中的至少一條。第二方面，本發(fā)明提供了一種敲除人胚胎腎臟細(xì)胞CYP2E1基因的方法，為利用CRISPR/Cas系統(tǒng)在人胚胎腎臟細(xì)胞中對(duì)CYP2E1基因進(jìn)行改造，具體包括如下步驟：(1)人工合成如第一方面所述靶DNA序列及其互補(bǔ)鏈；(2)將所合成的核酸片段插入到sgRNA骨架表達(dá)質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化，挑單克隆菌株，提取sgRNA重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定獲得測(cè)序正確的sgRNA重組質(zhì)粒；其中，sgRNA骨架表達(dá)質(zhì)粒載體還表達(dá)Cas9核酸酶；(3)將sgRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎臟細(xì)胞，即得敲除CYP2E1基因的人胚胎腎臟細(xì)胞。優(yōu)選地，所述步驟(2)具體包括：將所合成的SEQIDNO:1及SEQIDNO:2所示序列的核酸對(duì)分別插入到sgRNA骨架表達(dá)質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化，挑單克隆菌株，提取sgRNA重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定獲得測(cè)序正確的sgRNA重組質(zhì)粒；其中，sgRNA骨架表達(dá)質(zhì)粒載體還表達(dá)Cas9核酸酶；所述步驟(3)具體包括：將步驟(2)所得的兩種sgRNA重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎臟細(xì)胞，即得敲除CYP2E1基因的人胚胎腎臟細(xì)胞。第三方面，本發(fā)明提供了一種CYP2E1基因缺失細(xì)胞株的構(gòu)建方法，為采用有限稀釋法對(duì)第二方面所得的敲除CYP2E1基因的人胚胎腎臟細(xì)胞進(jìn)行傳代篩選，獲得穩(wěn)定敲除CYP2E1的人胚胎腎臟細(xì)胞。第四方面，本發(fā)明提供了一種CYP2E1基因缺失細(xì)胞株，為如采用第三方面所述的CYP2E1基因缺失細(xì)胞株的構(gòu)建方法所制得。第五方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列在敲除CYP2E1基因中的應(yīng)用。第六方面，一種用于在人基因組中進(jìn)行CYP2E基因定點(diǎn)敲入試劑盒，包括如下(1)-(3)中的任一種：(1)如第一方面所述的用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列；(2)如第二方面所述的sgRNA重組質(zhì)粒；(3)如第四方面所述的CYP2E1基因缺失細(xì)胞株。本發(fā)明提供了的技術(shù)方案具有如下有益效果：本發(fā)明提供的技術(shù)方案利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)CYP2E1基因敲除，實(shí)現(xiàn)了在基因組水平對(duì)基因的沉默作用，有效改進(jìn)了siRNA(例：siCYP2E1)在mRNA或蛋白水平的沉默不徹底或者無法沉默基因表達(dá)的缺點(diǎn)。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的SgRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建模式圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光結(jié)果；圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的SURVEYOR核酸酶消化后PCR片段結(jié)果；圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的293FT-ko-45#、293FT-ko-46#在靶點(diǎn)位置的缺失突變序列示意；圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的CYP2E1-Knockout細(xì)胞株mRNA表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果；圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的CYP2E1-Knockout細(xì)胞株P(guān)rotein表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明實(shí)施例中無特別說明外，所用試劑及耗材均為市售商品。本發(fā)明技術(shù)方案可通過如下實(shí)施例實(shí)現(xiàn)：(1)sgRNA設(shè)計(jì)：分別針對(duì)CYP2E1的第二、第三和第七外顯子(Exon2,Exon3,Exon7)設(shè)計(jì)sgRNA序列。設(shè)計(jì)、合成的三組分別針對(duì)CYP2E1第二、第三和第七外顯子的sgRNA序列具體分組與命名見表1：表1CYP2E1sgRNAoligo序列(Tab.1ThesequencesofCYP2E1sgRNAoligo)分別在sgRNA兩端加酶切位點(diǎn)，在每條sgRNA序列的正義鏈的5’端添加CACC，反義鏈的5’端添加AAAC，從而形成與PX461質(zhì)粒經(jīng)FastDigestBbsI酶切后互補(bǔ)的粘性末端。如果正義鏈的5’端第一個(gè)堿基不是G，則在5’端CACC后面增加一個(gè)G，相應(yīng)的反義鏈3’端再增加一個(gè)C。設(shè)計(jì)完成后的sgRNA送上海杰瑞公司進(jìn)行引物合成。(畫橫線為sgRNA)本發(fā)明SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示序列分別對(duì)應(yīng)表格1中SEQIDNO:8、SEQIDNO:9畫橫線部分，具體地，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示序列分別為GGAAGGACATCCGGCGGTTT和ACCCTCCGGAACTATGGGAT。重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定，構(gòu)建流程模式如圖1所示①PX461為含有U6啟動(dòng)子的sgRNA骨架表達(dá)載體，表達(dá)具有Cas9D10A切口酶突變的Cas9n，帶有GFP綠色熒光蛋白基因和氨芐青霉素抗性。用FastDigestBbsI對(duì)PX461進(jìn)行酶切，DNA凝膠電泳后回收線性化的載體。②用T4PNK分別對(duì)表1中的三組sgRNAoligo序列進(jìn)行磷酸化和退火；用T4ligase將線性的PX461質(zhì)粒載體分別與退火后的三組sgRNA雙鏈序列室溫連接1h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌Trans109，冰浴30min,42℃45s，冰上2min。在氨芐抗性的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆搖菌，送測(cè)序。測(cè)序引物為U6啟動(dòng)子的正向引物序列，5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3’(SEQIDNO:15)。測(cè)序正確的克隆提取重組質(zhì)粒。③所得重組質(zhì)粒共有三組(6種)，針對(duì)第二外顯子的一組質(zhì)粒命名為PX461-E2-1和PX461-E2-2(分別對(duì)應(yīng)Exon2的SgRNA-E2-1、SgRNA-E2-2構(gòu)建的質(zhì)粒)，針對(duì)第三外顯子的一組質(zhì)粒命名為PX461-E3-1和PX461-E3-2(分別對(duì)應(yīng)Exon3的SgRNA-E3-1、SgRNA-E3-2構(gòu)建的質(zhì)粒)，針對(duì)第七外顯子的一組質(zhì)粒命名為PX461-E7-1和PX461-E7-2(分別對(duì)應(yīng)Exon7的SgRNA-E7-1、SgRNA-E7-2構(gòu)建的質(zhì)粒)。(2)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染①293FT細(xì)胞培養(yǎng)條件：DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)、5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24h，將293FT細(xì)胞以5×105/孔接種至6孔板中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到60％-70％。使用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑分別將上述每組(Exon2、3、7)對(duì)應(yīng)的2種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染一孔293FT細(xì)胞，等量的PX461質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，6孔板質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量一般為2ug/孔,質(zhì)粒預(yù)轉(zhuǎn)染試劑之比為1:2-2.5。②轉(zhuǎn)染后24h觀察轉(zhuǎn)染效率。利用倒置熒光顯微鏡觀察熒光細(xì)胞百分比，以確定轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果如圖2所示。(4)提取細(xì)胞基因組DNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h，將293FT細(xì)胞進(jìn)行消化，取一部分(一般為消化后細(xì)胞重懸液體積1/3)進(jìn)行傳代保種。一部分(一般為消化后細(xì)胞重懸液體積2/3)用GeneJETTMGenomicDNAPurificationKit提取基因組DNA。①將細(xì)胞收集于離心管，每管5X106個(gè)細(xì)胞，用移液器緩慢吹打，250g離心5min，棄上清，加PBS重懸細(xì)胞，再次重復(fù)離心，已去除細(xì)胞中殘留培養(yǎng)基。②用200ulPBS重懸細(xì)胞，每管加入200ul裂解液和20ul蛋白酶K,充分震蕩、混合均勻。③56℃搖床孵育10min，期間每3-4分鐘震蕩混勻一次，以保證細(xì)胞裂解充分。④加入20ulRNAaseA，震蕩混勻，室溫孵育10min。⑤加入400ul50％ethanol，用槍震蕩混勻或者震蕩混勻。⑥將上述MiX加入試劑盒提供的Column柱中，6000g離心，1min，將DNA收集柱轉(zhuǎn)移至新的2ml收集管中。⑦加入500ulwashbufferⅠ，8000g離心1min，棄廢液。再加入500ulwashbufferⅡ,12000g,離心3min。⑧加入200ulElutionBuffer至收集柱濾膜中央，室溫孵育2min，8000g離心，1min，即可得所需DNA樣品。(5)PCR反應(yīng)條件和SURVEYOR分析檢測(cè)①SURVEYORPCR反應(yīng)：只有能被sgRNA識(shí)別，Cas9切割的DNA序列存在，SURVEYOR結(jié)果呈現(xiàn)陽性(3條帶)，因此需要首先針對(duì)CYP2E1基因上三個(gè)不同的外顯子進(jìn)行分析檢測(cè)，分別設(shè)計(jì)3對(duì)跨Cas9蛋白切割位點(diǎn)的SURVEYORPCR引物對(duì)，并進(jìn)行引物特異性檢測(cè),引物序列見表2。表2SURVEYORPCR反應(yīng)引物序列Tab.2PCRprimer②用Phusion超保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參照說明書50ul體系，基因組DNA100ng，50ul反應(yīng)體系如下表所示。組分?jǐn)?shù)量(uL)H2Oto50PhusionHFbuffer,5X10dNTPs,2.5mM4Phusionpolymerase0.5Forwardprimer2.5Reverseprimer2.5templateDNA100ngTotal50程序如下：取反應(yīng)后PCR產(chǎn)物5ul進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其特異性。③SURVEYOR分析步驟如下：③.1用QIAquickPCRpurificationKit試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，將回收產(chǎn)物稀釋至40ng/ul，按照SURVEYOR分析試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測(cè).③.2DNA雜化雙鏈形成(退火反應(yīng))體系：組分?jǐn)?shù)量(μl)TaqPCRbuffer,10×2NormalizedPCRproduct,20ngμl-118Totalvolume20反應(yīng)條件：循環(huán)次數(shù)條件195℃,10min295-85℃,-2℃s-1385℃,1min485-75℃,-0.3℃s-1575℃,1min675-65℃,-0.3℃s-1765℃,1min865-55℃,-0.3℃s-1955℃,1min1055-45℃,-0.3℃s-11145℃,1min1245-35℃,-0.3℃s-11335℃,1min1435-25℃,-0.3℃s-11525℃,1min1625-4℃,-0.3℃s-1174℃,hold③.3SURVEYOR核酸酶消化(在冰上操作)：反應(yīng)體系：組分用量(μl)終濃度Annealedheteroduplex20MgCl2stocksolutionsuppliedwithkit,0.15M2.515mMddH2O0.5SURVEYORnucleaseS11×SURVEYORenhancerS11×Total25反應(yīng)條件：充分震蕩、混勻上述mixture,42℃30min.③.4取10ul樣品，用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。用凝膠定量軟件計(jì)算切割效率，公式為fcut＝(b+c)/(a+b+c)，其中Indel為缺失比率，fcut為切割比率，a為未被切割條帶的灰度值，b和c表示切割產(chǎn)生的新條帶的灰度值。選擇Indel(％)最高的那一組轉(zhuǎn)染的293FT細(xì)胞做下一步的接種和篩選。SURVEYOR核酸酶消化部分結(jié)果如圖3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明僅有針對(duì)Exon3設(shè)計(jì)的sgRNA構(gòu)建的PX461-E3-1和PX461-E3-2質(zhì)粒組有效，SURVEYOR結(jié)果為陽性。(6)篩選穩(wěn)定敲除CYP2E1的293FT細(xì)胞株為進(jìn)一步獲得穩(wěn)定敲除CYP2E1的293FT細(xì)胞株，我們采用有限稀釋法，將傳代保種的經(jīng)過轉(zhuǎn)染的293FT單細(xì)胞接種至96孔板中。操作步驟如下：①用胰蛋白酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，采用有限稀釋法稀釋至100ul培養(yǎng)基0.5個(gè)細(xì)胞，按每孔100ul細(xì)胞稀釋液加至96孔板中。②接種后第5至7天用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并初步篩選出單克隆細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿96孔板底時(shí)，再用胰蛋白酶消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至24孔板中。③待細(xì)胞長(zhǎng)滿24孔板底時(shí)，一部分細(xì)胞用于傳代留種，一部分細(xì)胞提取其基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原基因組進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)靶向敲除CYP2E1基因是否成功。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，293FT-ko-45#在靶點(diǎn)位置造成了35bp的缺失突變，293FT-ko-46#在靶點(diǎn)位置也造成了37bp的缺失突變，如圖4所示。④挑選經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的成功敲除CYP2E1基因的單克隆細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增至6孔板，一部分細(xì)胞用于傳代留種，一部分細(xì)胞用M-PERMammalianProteinExtractionReagent提取蛋白，用于Westernblot檢測(cè)CYP2E1的蛋白表達(dá)水平，另一部分細(xì)胞用Trizol法提取RNA，用于RT-qPCR檢測(cè)CYP2E1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖5、6所示。圖5為CYP2E1-Knockout細(xì)胞株mRNA表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果；圖6為CYP2E1-Knockout細(xì)胞株P(guān)rotein表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果。相對(duì)于傳統(tǒng)的基因敲除方法不僅流程繁瑣，對(duì)技術(shù)要求高，而且費(fèi)用昂貴，成功率相對(duì)較低。本發(fā)明采用的CRISPR-Cas9技術(shù)是第四代基因編輯方法，其易于操作，效率更高，費(fèi)用低廉。本發(fā)明利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建的CYP2E1基因敲除細(xì)胞模型為CY2E1代謝相關(guān)的研究提供了有效平臺(tái)。具體有益效果如下：(1)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)CYP2E1基因敲除，實(shí)現(xiàn)了在基因組水平對(duì)基因的沉默作用，有效改進(jìn)了siRNA(例：siCYP2E1)在mRNA或蛋白水平的沉默不徹底或者無法沉默基因表達(dá)的缺點(diǎn)。(2)CYP2E1參與機(jī)體重要的代謝功能，CYP2E1基因敲出細(xì)胞株的建立為外源性化學(xué)物或者外源性毒物在體內(nèi)的代謝研究提供了有效的平臺(tái)。(3)CYP2E1基因敲除細(xì)胞株對(duì)于慢性疾病(如酒精性肝臟疾病及糖尿病)及腫瘤相關(guān)疾病的研究提供了有力工具。(4)CYP2E1基因敲除細(xì)胞株可用于CYP2E1代謝相關(guān)外源性化學(xué)物毒性、致癌性的研究以及藥物之間的交互作用研究。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3