專利名稱：人Corin基因的控制序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種從哺乳動(dòng)物Corin基因中分離得到的新的表達(dá)控制區(qū)。該控制區(qū)優(yōu)選地激活心臟細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還提供了用該控制區(qū)鑒定能調(diào)控Corin表達(dá)的物質(zhì)以及治療心臟病的方法及組合物。
背景技術(shù)：
Corin，一種心臟的跨膜絲氨酸蛋白酶，在前心房肽(pro-ANP)到ANP的轉(zhuǎn)化上發(fā)揮著重要作用(Yan，W.et al.(2000)PNAS，978525-8529；Wu et al.(2002)J.Biol.Chem.27716900-16905)。ANP是一種心臟激素，它通過(guò)以受體依賴性方式促進(jìn)鹽的排泄、增加尿量、減少血容量以及緩和血管張力來(lái)降低高血壓。例如高血壓和心衰的主要心血管病都與ANP有關(guān)(Burnett，J.C.et al.(1986)Science，2311145-1147)。在基因敲除小鼠中，不論ANP或其受體的缺失都引起自發(fā)性高血壓(John，S.W.et al.(1995)Science 267679-681；John，S.W.et al.(1996)Am.J.Physiol.271，R109-R114；Lopez et al.(1995)Nature 37865-68)。認(rèn)識(shí)到從前ANP轉(zhuǎn)化為ANP的活化步驟在心臟激素的調(diào)節(jié)上是至關(guān)重要的。
Corin具有推定的II型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，它含有兩個(gè)卷曲樣的富含半胱氨酸基序、八個(gè)LDL受體重復(fù)序列、一個(gè)巨噬細(xì)胞清道夫受體樣結(jié)構(gòu)域、以及細(xì)胞外區(qū)域的胰蛋白酶樣蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Yan et al.(1999)J.BioLChem.27414926-14935)。Corin的總的拓?fù)鋵W(xué)與其它II型跨膜絲氨酸蛋白酶相似，這些蛋白酶包括hepsin、腸激酶、MT-SP1/matriptase、人氣道胰蛋白酶樣蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3/TADG-12、TMPRSS4、MSPL以及Stubble-stubbloid。相似的拓?fù)鋵W(xué)以及不一樣的組成結(jié)構(gòu)說(shuō)明這些蛋白構(gòu)成了一個(gè)由祖先外顯子的重復(fù)及重排所進(jìn)化形成的基因家族。
該人基因跨越＞200kb并含有22個(gè)外顯子。內(nèi)含子/外顯子之間的界限在物種之間具有較高的保守性，且絕大多數(shù)外顯子編碼結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域。先前已經(jīng)描述了編碼Corin蛋白的小鼠和人cDNA的克隆(Yan等，ibid)。Northern分析顯示Corin mRNA大量表達(dá)于人心臟中。通過(guò)原位熒光雜交分析將人Corin基因繪制于染色體4的短臂上(4p12-13)，其中已經(jīng)定位了一種先天性心臟病的基因座，即完全異常肺靜脈回流的基因座。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及分離、克隆以及鑒定哺乳動(dòng)物Corin基因的表達(dá)控制區(qū)，包括啟動(dòng)子和其它調(diào)節(jié)元件，并涉及該心臟特異性的表達(dá)控制區(qū)在鑒定調(diào)控心房肽基因表達(dá)的新物質(zhì)以及治療心臟病中的用途。
朝著這些目標(biāo)，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種含有Corin控制區(qū)的分離的多核苷酸，其中所述控制區(qū)調(diào)控任何與其可操縱地連接的異源性多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，所述異源性多核苷酸包括但不限定于人Corin基因。
Corin表達(dá)控制區(qū)指導(dǎo)與其可操縱地連接的異源性多核苷酸的心臟特異性的轉(zhuǎn)錄，它包括選自由GATA、Tbx-5、NKx2.5、Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子、和NF-AT結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)成的組的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，并能結(jié)合轉(zhuǎn)錄蛋白，例如GATA-4。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供含有人Corin表達(dá)控制區(qū)的多核苷酸。本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸是定位于核苷酸-4037到-15(SEQ ID NO6)，更優(yōu)選的是核苷酸-1297到-15(SEQ ID NO5)，以及進(jìn)一步更優(yōu)選的是核苷酸-405到-15(SEQ ID NO4)，其中的核苷酸編號(hào)是相對(duì)于人Corin基因或如圖8所示的它的互補(bǔ)鏈(SEQ ID NO2)的翻譯起始位點(diǎn)(ATG)的編號(hào)。
根據(jù)發(fā)明的這個(gè)方面，也提供了這些多核苷酸的片段及變體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有Corin表達(dá)控制區(qū)、或其片段或變體的載體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，載體也包括可操縱地連接于Corin表達(dá)控制區(qū)的異源性多核苷酸，例如Corin。根據(jù)發(fā)明的這個(gè)方面，也提供了被這些載體所轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以及表達(dá)由這些異源性多核苷酸編碼的產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供藥用組合物，其包括存在于可藥用載體內(nèi)的含有與異源性多核苷酸可操縱地連接的Corin表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)的載體或這樣的載體所轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鑒定能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)人Corin基因表達(dá)的物質(zhì)的方法，其中方法包括(a)產(chǎn)生一種重組載體，其中一種包含哺乳動(dòng)物Corin表達(dá)控制區(qū)的分離的多核苷酸可操作地連接于一種報(bào)告基因；(b)用所述重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(c)用所述物質(zhì)處理細(xì)胞；(d)測(cè)定被處理細(xì)胞內(nèi)的報(bào)告序列的轉(zhuǎn)錄水平；以及(e)比較在有所述物質(zhì)存在時(shí)的報(bào)告序列的表達(dá)水平與未經(jīng)所述物質(zhì)處理的轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用心肌細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種調(diào)控人類對(duì)象內(nèi)的基因的心臟特異性表達(dá)的方法，方法包括(a)產(chǎn)生一種重組載體，其中一種包含哺乳動(dòng)物Corin表達(dá)控制區(qū)的分離的多核苷酸可操縱地連接于異源性多核苷酸；以及(b)將治療有效量的所述載體施用于所述對(duì)象。
本發(fā)明的這個(gè)方面的優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣一種載體，其中所述的異源性多核苷酸編碼Corin。同樣優(yōu)選的實(shí)施方案是Corin表達(dá)控制區(qū)選自具有SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的序列的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療人類對(duì)象的充血性心衰、高血壓或心肌梗死的方法，所述方法包括給所述對(duì)象施用治療有效量的分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含與一種基因可操縱地連接的Corin表達(dá)控制區(qū)，所述基因選自由Corin、心房肽(ANP)、B型利鈉肽、受磷蛋白(phosphonolamban)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)或這些基因的負(fù)顯性形式所構(gòu)成的組?；蛘?，Corin表達(dá)控制區(qū)可以可操縱地連接于編碼反義RNA分子的多核苷酸。
在發(fā)明的這個(gè)方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所選的基因是Corin基因。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種治療人類對(duì)象的心衰的方法，所述方法包含(a)產(chǎn)生一種重組載體，其中一種包含哺乳動(dòng)物Corin表達(dá)控制區(qū)的分離的多核苷酸可操縱地連接于一種編碼一種多肽的多核苷酸，所述多肽選自ANP、B型利鈉肽、受磷蛋白、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、或這些基因的負(fù)顯性形式所構(gòu)成的組；以及(b)給所述對(duì)象施用存在于可藥用載體中的所述重組載體。


圖1哺乳動(dòng)物Corin基因的結(jié)構(gòu)。顯示了(A)人與(B)小鼠的Corin基因的結(jié)構(gòu)。用鳥(niǎo)槍法將兩個(gè)BAC克隆測(cè)序并顯示了它們的組裝的插入序列的大小。垂直框表示外顯子。用限制性酶位點(diǎn)(H，Hind III；E，EcoRl)表示用于亞克隆人基因的BAC 26540的質(zhì)?？寺　＠米詣?dòng)測(cè)序用引物延伸法測(cè)序亞克隆的插入序列。在底部描述的是BAC克隆、重疊群(Contigs)以及橫跨Corin基因的質(zhì)?？寺〉奈恢?。
圖2相對(duì)于Corin的蛋白結(jié)構(gòu)域的內(nèi)含子-外顯子的分界位點(diǎn)。將Corin基因的外顯子1到22(上行)與它們的對(duì)應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)域一起排列。TM，跨膜結(jié)構(gòu)域；卷曲(Frizzled)卷曲樣富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域；LDLR，LDL受體重復(fù)序列；SRCR，清道夫受體富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域；H、D以及S，蛋白酶結(jié)構(gòu)域的催化三聯(lián)體的His、Asp以及Ser殘基。
圖3人(SEQ ID NO1)及小鼠(SEQ ID NO3)的Corin基因的5’側(cè)翼區(qū)的比對(duì)。對(duì)人與小鼠基因的5’側(cè)翼區(qū)，外顯子1以及內(nèi)含子1的一部分進(jìn)行比對(duì)。編號(hào)是相對(duì)于翻譯起始密碼子ATG(粗體及斜體)。在人與小鼠之間所顯示的編號(hào)是不同的，這是因?yàn)閮烧叩牡谝煌怙@子存在偏差。箭頭表示人Corin基因的第一外顯子與內(nèi)含子之間的連接，下劃線的是人內(nèi)含子1的供體剪接序列。推定的調(diào)節(jié)序列用粗體表示(與Tbx5結(jié)合的Tbx5位點(diǎn)，Tbx5是一種含有T盒的轉(zhuǎn)錄因子；NF-AT，活化T細(xì)胞的核因子的結(jié)合位點(diǎn)；GATA，GATA蛋白的結(jié)合元件；與Krüppel樣因子結(jié)合的GT盒；與基本轉(zhuǎn)錄因子TFIID結(jié)合的TATA盒；以及NKE，與Nxk2.5結(jié)合的基序)。下劃線標(biāo)出的是與近端GATA序列重疊的NKE序列。
圖4培養(yǎng)的心肌細(xì)胞內(nèi)的Corin基因啟動(dòng)子活性的功能分析。圖示了含有與螢光素酶基因連接的人及小鼠Corin基因的5’側(cè)翼區(qū)的連續(xù)截?cái)嗥蔚膱?bào)告基因構(gòu)建體(A)。顯示了推定的調(diào)節(jié)元件的定位。用pRL-SV40將這些構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染到小鼠HL-5細(xì)胞中，pRL-SV40是一種由SV40病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Rellina螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒。將每個(gè)構(gòu)建體所表達(dá)的螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為每個(gè)轉(zhuǎn)染的pRL-SV40表達(dá)的Rellina螢光素酶活性。每個(gè)構(gòu)建體的每個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行三次。數(shù)據(jù)表示為三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±S.D.(B)。
圖5人與小鼠Corin基因的5’側(cè)翼序列的心臟特異性表達(dá)。用所示的構(gòu)建體與對(duì)照構(gòu)建體pRL-SV40一起轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞HL5細(xì)胞以及上皮樣的HeLa細(xì)胞。用每20μl轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞提取液的光量單位表示螢光素酶及Rellina活性。每個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行三次。數(shù)據(jù)表示為三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±S.D.。
圖6核蛋白與包含近端GATA元件的調(diào)節(jié)序列的結(jié)合。
A上鏈寡核苷酸序列用作探針及競(jìng)爭(zhēng)序列。每個(gè)序列的GATA基序(SEQ ID NO11和13，相應(yīng)地為人和小鼠)都為粗體，而突變核苷酸(SEQ ID NO12和14，相應(yīng)地為人和小鼠)都為斜體。人與小鼠的近端GATA元件都來(lái)自所示的Corin 5’側(cè)翼序列區(qū)域。含有兩個(gè)GATA基序的共有序列GATA探針(SEQ ID NO15)來(lái)源于人T細(xì)胞受體特異性增強(qiáng)子區(qū)。
B在存在或不存在100倍過(guò)量的所示的標(biāo)記寡核苷酸時(shí)，將所標(biāo)記的共有序列GATA探針(SEQ ID NO15)或其突變探針(SEQ ID NO16)與HL-5細(xì)胞的核提取物一起孵育。箭頭表示GATA序列依賴性的DNA-蛋白復(fù)合物。
C在存在抗GATA蛋白抗體時(shí)，將所標(biāo)記的共有序列GATA探針與HL-5細(xì)胞的核提取物一起孵育。箭頭表示DNA-蛋白復(fù)合物，其形成被抗GATA-4抗體而不是被抗GATA-1、-3及-6抗體所阻斷。
D在存在或不存在抗GATA-4抗體時(shí)，將標(biāo)記的人Corin GATA元件與HL-5的核提取物一起孵育。箭頭表示在存在抗GATA-4抗體時(shí)，DNA-蛋白復(fù)合物的形成被完全阻斷。
圖7近端保守的GATA元件的突變分析。將在EMSA中終止了與GATA-4蛋白結(jié)合的相同突變(GATA到CTTA)引入到小鼠的從-642到-77的5’側(cè)翼區(qū)或人的-405到-15的5’側(cè)翼區(qū)所驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體中。將突變型與野生型轉(zhuǎn)染到HL-5細(xì)胞中，每種都與對(duì)照構(gòu)建體pRL-SV40一起轉(zhuǎn)染。將每個(gè)構(gòu)建體所表達(dá)的螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為每個(gè)轉(zhuǎn)染的pRL-SV40所表達(dá)的Rellina螢光素酶活性。每個(gè)突變構(gòu)建體的啟動(dòng)子活性都表示為相應(yīng)的野生型構(gòu)建體的百分比。每個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行三次。數(shù)據(jù)表示為三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±S.D.。
圖8人Corin基因的5’側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。4165個(gè)堿基對(duì)序列包括5’側(cè)翼區(qū)、第一外顯子以及第一內(nèi)含子的起始部(下面的部分)。所有的編號(hào)都相對(duì)于翻譯起始位點(diǎn)(ATG，粗體并有下劃線)。用粗體表示推定的調(diào)節(jié)元件。在圖3的圖例說(shuō)明中描述了推定的調(diào)節(jié)元件的縮寫(xiě)。
對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及分離、克隆及鑒定心臟特異性的Corin基因的表達(dá)控制區(qū)，包括啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件。用分離的Corin表達(dá)控制區(qū)、和它們的片段及變體體外和體內(nèi)構(gòu)建用于研究Corin基因表達(dá)的調(diào)控及用于鑒定新的Corin基因表達(dá)的調(diào)控物的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。表達(dá)控制區(qū)也用于靶向于心臟病變例如心衰的基因治療。
定義如在說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例以及所附的權(quán)利要求書(shū)中所使用的，除非有特殊的相反的解釋，下面的名詞都為所說(shuō)明的含義。
“核酸”或“多核苷酸”指的是單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸或它們的聚合物。名詞包括含有已知的核苷酸類似物或經(jīng)修飾的骨架殘基或連接的核酸，它們可以是合成的、天然形成的以及非天然形成的，它們具有與所參照的核酸相似的結(jié)合特性，以及它們是以與參照核苷酸相似的方式被代謝。這些類似物的實(shí)例包括但不限定于硫代磷酸酯、亞磷酰胺、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、核酸肽(PNA)。
除非有其它說(shuō)明，特殊的核酸序列也默認(rèn)包括它們的保守修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指示的序列。特別地，通過(guò)生成其中一個(gè)或多個(gè)所選定的(或所有)密碼子的第三個(gè)位點(diǎn)被混和堿基和/或脫氧次黃嘌呤殘基所取代的序列可以完成簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer et al.(1991)Nucl.Acids Res.195081；Ohtsuka et al.(1985)J.Biol.Chem.2602605-08；Rossolini et al.(1994)Mol.Cell.Probes 891-98)。名詞核酸可以與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸以及聚核苷酸交替使用。
特殊的核酸序列也默認(rèn)包括“剪接變體”。同樣，核酸編碼的特殊蛋白也默認(rèn)包括任何該核酸的剪接變體所編碼的蛋白?！凹艚幼凅w”如同名詞本身所提示的，它是基因的選擇性剪接的產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)錄后，初始的核酸轉(zhuǎn)錄體可以被剪接，使得不同的(選擇性)的核酸剪接產(chǎn)物可以編碼不同的多肽。這種剪接變體的產(chǎn)生機(jī)制多種多樣，但包括對(duì)外顯子的選擇性剪接。本定義也包括通過(guò)通讀轉(zhuǎn)錄來(lái)源于同一核酸的候補(bǔ)多肽。本定義包括剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物包括剪接產(chǎn)物的重組形式。
“Corin基因”指的是編碼與Yan等(1999)J.Biol.Chem.27414926-14935中所描述的人Corin基因氨基酸序列有著約至少60％(優(yōu)選地75％、78％、90％以及更優(yōu)選的約95％)相同性的連續(xù)氨基酸序列的基因。
“Corin表達(dá)控制區(qū)”或“表達(dá)控制區(qū)”指的是定位于天然形成的哺乳動(dòng)物Corin基因的編碼區(qū)的上游(5’)基因組序列內(nèi)的多核苷酸。在人Corin基因中，相對(duì)于Corin基因或如圖8所示的它的互補(bǔ)鏈的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(ATG)，Corin表達(dá)控制區(qū)開(kāi)始于-4165核苷酸并終止于-15核苷酸。Corin表達(dá)控制區(qū)能激活心臟組織(肌細(xì)胞)內(nèi)的Corin基因的轉(zhuǎn)錄。Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的長(zhǎng)度可以從100到5000個(gè)核苷酸；功能性的人Corin表達(dá)控制區(qū)的特殊實(shí)施方案是長(zhǎng)度為4023、1283或391個(gè)核苷酸(相應(yīng)地為SEQ ID NO6、5和4)。Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸通常與這些序列至少有70％同源性。在一些實(shí)施方案中，Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸與這些序列至少有75％、80％、85％、90％、92％、95％或100％同源性。名詞“控制區(qū)”不包括起始或終止密碼子以及Yan等已經(jīng)描述的其它序列。Corin表達(dá)控制區(qū)含有各種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，例如GATA-4，它可以按與自然或人工方式基本一樣的方式被連接。Corin表達(dá)控制區(qū)激活Corin基因或其它與其可操縱地連接的異源性多核苷酸，特別是以心臟特異性的方式。
“心臟特異性表達(dá)”意思是多核苷酸在心臟源性細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄率比在非心臟細(xì)胞中更大。因此，Corin表達(dá)控制區(qū)通常在心肌細(xì)胞中激活所連接的多核苷酸的效力比在非心臟細(xì)胞中高出至少2倍，其中在每種情況下的表達(dá)被標(biāo)準(zhǔn)化為另一種與SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或其它組成型啟動(dòng)子連接的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。
在此所用的多核苷酸的“變體”指的是與參照多核苷酸的多核苷酸序列不同的多核苷酸。通常差別是有限的，使得參照體與變體的多核苷酸序列總體上是非常相似的并且在許多地方是完全一樣的。差別是那些不改變多核苷酸功能的差別，如果多核苷酸正常地編碼多肽，那么形成的多肽或者是氨基酸序列沒(méi)有改變，或者是當(dāng)具有不同的氨基酸序列時(shí)功能仍是完全一樣的。
在此所用的“片段”指的是具有與上述的Corin表達(dá)控制區(qū)及它的變體的部分但不是全部多核苷酸序列完全一樣的多核苷酸的多核苷酸。這些片段保留了Corin表達(dá)控制區(qū)指導(dǎo)與其可操縱地連接的異源性多核苷酸的心臟特異性轉(zhuǎn)錄的能力。
“轉(zhuǎn)錄起始元件”指的是啟動(dòng)子中特異于RNA聚合酶II的起始位點(diǎn)的序列。轉(zhuǎn)錄起始元件可以包括直接起始下游25-35堿基轉(zhuǎn)錄的TATA盒，或者起始子元件，它們是定位鄰近于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)本身的序列。真核啟動(dòng)子通常包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)元件以及或啟動(dòng)子近端元件、遠(yuǎn)端增強(qiáng)子元件或兩者。
當(dāng)參照于例如細(xì)胞、核酸、蛋白或載體一起使用的“重組體”代表已經(jīng)被引入異源性核酸或蛋白或天然核酸或蛋白的變化所修飾的細(xì)胞、核酸、蛋白或載體、或來(lái)源于被修飾細(xì)胞的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞表達(dá)在天然形式細(xì)胞(非重組細(xì)胞)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的基因或表達(dá)不正常表達(dá)的、低表達(dá)的或根本不表達(dá)的天然基因。
“增強(qiáng)子”指的是一種增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。增強(qiáng)子通常是但不總是定位于近端啟動(dòng)子區(qū)外，并且可以是定位于離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)幾千堿基對(duì)或更遠(yuǎn)的地方，甚至是在編碼序列的3’端或在基因的內(nèi)含子內(nèi)。啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可以是獨(dú)立地或組合地參與組織的特異性表達(dá)。
“沉默子”指的是一種DNA調(diào)節(jié)區(qū)，當(dāng)其出現(xiàn)在Corin基因的天然序列中時(shí)，它或通過(guò)它本身作為慎重(discreet)DNA片段的作用或通過(guò)與所述元件結(jié)合并實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的陰性控制的反式作用因子的作用而造成對(duì)啟動(dòng)子引起的轉(zhuǎn)錄的抑制。該元件可能在Corin基因的限制性細(xì)胞類型表達(dá)模式上發(fā)揮著重要作用，例如在心肌細(xì)胞中表達(dá)可能是允許的，其中該沉默子可能是無(wú)活性的，但在其它的細(xì)胞類型中表達(dá)是受限的，其中該沉默子是活化。該元件可以或不可以單獨(dú)或在異源性啟動(dòng)子構(gòu)建體中發(fā)揮作用。
“分離的”，當(dāng)指的是例如多核苷酸時(shí)，意思是物質(zhì)被遠(yuǎn)離于它的原始環(huán)境(例如，如果它是天然存在的就指天然環(huán)境)，以及與它天然連接的至少一種其它成分分離或分開(kāi)。例如，存在于它的天然活宿主內(nèi)的天然存在的多核苷酸不是分離的，但與天然系統(tǒng)中的所有共存物質(zhì)分開(kāi)的同一種多核苷酸是分離的。這樣的多核苷酸可以是組合物的一部分，并且仍是分離的，這是因?yàn)樵摻M合物不是其天然環(huán)境的一部分。
“相同性百分比”或相同的百分比，當(dāng)指的是序列時(shí)，意思是在將所述的或所要求保護(hù)的序列與要比較的序列進(jìn)行比對(duì)后，將該序列與要求保護(hù)的元件或所述的序列進(jìn)行比較。用數(shù)學(xué)算法可以完成序列的比較并測(cè)定兩個(gè)序列之間的相同性和相似性百分比。這樣的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的非受限的實(shí)例被描述于Karlin等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-587中。Altschul等(1997)Nucleic Acid Res.253389-3402描述的NBLAST及XBLAST程序(2.0版本)中整合有這樣的算法。
在此所用的“高嚴(yán)格性”意思是，例如在含有例如5X SSC、0.5％SDS、100g/ml變性的鮭精DNA以及50％甲酰胺的雜交溶液中將一印跡與長(zhǎng)多核苷酸探針在42℃孵育過(guò)夜。然后在高嚴(yán)格性的條件下洗滌印跡，使得發(fā)生例如小于5％的堿基錯(cuò)配(例如在0.1x SSC和0.1％SDS 65℃洗滌30分鐘兩次)，由此選擇具有例如95％或更大序列相同性的序列。
當(dāng)多核苷酸的DNA拷貝被轉(zhuǎn)錄為RNA時(shí)，該多核苷酸被“表達(dá)”。
當(dāng)多核苷酸與Corin表達(dá)控制區(qū)在單一分子中的結(jié)合造成了多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，最優(yōu)選的是心臟特異性的轉(zhuǎn)錄(在心肌細(xì)胞中)，該多核苷酸是“被可操縱地連接于”Corin表達(dá)控制區(qū)。
“異源性多核苷酸”指的是除Corin表達(dá)控制區(qū)以外的多核苷酸，它被可操縱地連接于Corin表達(dá)控制區(qū)并優(yōu)選地表達(dá)于心臟特異性細(xì)胞內(nèi)。所連接的多核苷酸表達(dá)治療有用的分子，例如多肽、反義RNA。名詞“分離的”、“純化的”、或“生物學(xué)純度”指的是物質(zhì)基本上或完全游離于在它的天然狀態(tài)中所見(jiàn)的正常地伴隨于它的成分。用例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜的分析化學(xué)技術(shù)通?？梢源_定純度及均一性。在制劑中作為主要種類的蛋白基本上已經(jīng)被純化。具體地，分離的核酸被位于該基因側(cè)翼的并編碼其它蛋白的可讀框隔離。名詞“純化的”表示核酸或蛋白在凝膠電泳上只給出一條主要條帶。具體地，它指的是核酸或蛋白的純度是至少85％、更優(yōu)選的至少95％以及最優(yōu)選的至少99％。
名詞“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在此可以交替地用于表示氨基酸殘基的聚合物。這些名詞適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)的模擬物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸的聚合物和非天然存在的氨基酸的聚合物。
名詞“氨基酸”指的是天然存在的或合成的氨基酸，以及氨基酸類似物和氨基酸模擬物，它們具有與天然存在的氨基酸相似的功能。天然存在的氨基酸是那些遺傳密碼編碼的氨基酸，以及那些后來(lái)被修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指的是具有與天然存在的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，也就是與氫、羧基基團(tuán)、氨基基團(tuán)以及R基團(tuán)結(jié)合的碳原子，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物具有被修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或被修飾的肽骨架，但保留與天然存在的氨基酸相似的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指的是具有與氨基酸的常見(jiàn)化學(xué)結(jié)構(gòu)不一樣的結(jié)構(gòu)但具有與天然存在的氨基酸相似功能的化合物。
在此氨基酸也可以用它們的熟知的三個(gè)字母符號(hào)或IUPAC-IUB生物化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)命名委員會(huì)推薦的單個(gè)字母符號(hào)來(lái)表示。同樣，核苷酸可以用它們的常用的單個(gè)字母符號(hào)來(lái)表示。
“保守修飾的變體”適用于氨基酸及核酸序列。對(duì)于特殊的核酸序列，保守修飾的變體指的是那些編碼相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者對(duì)于不編碼氨基酸序列的核酸，指的是基本相同的序列。因?yàn)檫z傳密碼子的簡(jiǎn)并性，對(duì)于任何特定的蛋白可有大量功能相同的編碼核酸。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每一個(gè)某密碼子所具體確定的丙氨酸位點(diǎn)，該密碼子可以被變更為任何一種所述的相應(yīng)的密碼子而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變體是“沉默變體”，它是保守修飾的變體的一種。每一種在此的編碼多肽的核酸也表示核酸的每一種可能的沉默變體。本領(lǐng)域人員認(rèn)識(shí)到核酸的每一個(gè)密碼子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，以及TGG，它通常是色氨酸的唯一密碼子)都可被修飾并生成功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每一個(gè)沉默變體都包含于每一個(gè)所述的序列中。
對(duì)于氨基酸序列，本領(lǐng)域人員將認(rèn)識(shí)到，導(dǎo)致在編碼的序列中改變、添加或刪除單個(gè)氨基酸或小部分氨基酸的那些發(fā)生于核酸、肽、多肽或蛋白序列中的單個(gè)取代、缺失或添加是“保守修飾的變體”，其中的變更造成一種氨基酸被化學(xué)性質(zhì)相似的另一種氨基酸所取代。本領(lǐng)域熟知提供功能相似的氨基酸的保守取代的表。這些保守修飾的變體應(yīng)加入到本發(fā)明的多形變體、物種間同源物以及等位基因中，而不能被排除在本發(fā)明以外。
下面8組的每一組都含有能彼此保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；
5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)，見(jiàn)，例如Creighton，Proteins(1984)。
“表達(dá)載體”指的是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，以及一系列容許在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄特殊核酸的特異性核酸元件。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的一部分。通常的，表達(dá)載體包括被可操縱地連接到表達(dá)控制區(qū)的所轉(zhuǎn)錄核酸，例如Corin表達(dá)控制區(qū)。
“可藥用賦形劑”指的是可藥用載體以及任何所需的與生理?xiàng)l件相容的可藥用的輔助物質(zhì)，它們是無(wú)毒的且不會(huì)對(duì)懸浮或包含于其中的藥用組合物的生物學(xué)活性產(chǎn)生不良影響。適宜的賦形劑可以是例如甘露醇、琥珀酸鹽、甘油或血清白蛋白等化合物。
“治療有效量”指的是當(dāng)將本發(fā)明的化合物施用于所需的對(duì)象時(shí)，足以在患有心臟病的患者或很可能出現(xiàn)心臟病的患者中實(shí)現(xiàn)治療作用(如下定義)的本發(fā)明的化合物的量。構(gòu)成“治療有效量”的一種化合物的量將依賴于所述的化合物，但本領(lǐng)域的任何人員根據(jù)他自己的知識(shí)以及本文的公開(kāi)可以輕松地確定出這個(gè)量。
在此所用的“治療的”或“治療”覆蓋了心臟的治療并包括(a)預(yù)防人發(fā)生心臟病，特別是當(dāng)此人處于這些疾病的易患狀態(tài)時(shí)；(b)抑制心臟病，即阻止其發(fā)展；或(c)緩解心臟病，即造成病變的消退。
具體實(shí)施方案本發(fā)明涉及克隆及鑒定哺乳動(dòng)物Corin基因(例如，小鼠、人)的表達(dá)控制區(qū)，包括啟動(dòng)子及其它調(diào)節(jié)元件，以及涉及該表達(dá)控制區(qū)在鑒定用于調(diào)控Corin基因表達(dá)的物質(zhì)和治療心臟病的用途。具體地，本發(fā)明涉及包括新的Corin表達(dá)控制區(qū)的多核苷酸以及該控制區(qū)指導(dǎo)與其可操縱地連接的異源性多核苷酸的心臟特異性表達(dá)的能力。
Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的分離及描述本發(fā)明依賴于重組遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法。闡述有本發(fā)明所用的常用方法的基礎(chǔ)教材包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionALaboratory Manual(1990)；以及Ausubel et al，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons，New York，NY，1994)。
哺乳動(dòng)物Corin基因的結(jié)構(gòu)圖1描述了人和小鼠Corin基因的結(jié)構(gòu)以及(細(xì)菌人工染色體)BAC克隆、重疊群以及含有Corin基因和它們的5’側(cè)翼區(qū)的質(zhì)?？寺〉亩ㄎ?。人與小鼠Corin基因橫跨至少200Kb并由22個(gè)外顯子和21個(gè)內(nèi)含子組成。
Corin cDNA序列預(yù)示了一種由大量不同的結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成的蛋白。如圖2中圖表所示的，蛋白結(jié)構(gòu)域之間的界限幾乎完全對(duì)應(yīng)于基因組結(jié)構(gòu)的外顯子/內(nèi)含子界限。外顯子1和外顯子2的一半編碼N末端的胞漿尾部，緊接著的是外顯子2的另一半所編碼的跨膜結(jié)構(gòu)域。外顯子3編碼跨膜及第一個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域。每個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)域是由兩個(gè)外顯子編碼，八個(gè)LDLR的每個(gè)都由單個(gè)外顯子編碼，以及由三個(gè)外顯子編碼清道夫受體富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。C末端的蛋白酶結(jié)構(gòu)域是由外顯子19到22編碼，其中外顯子19編碼含有蛋白裂解活性位點(diǎn)及催化性組氨酸殘基的序列。外顯子20和22編碼相應(yīng)地含有其它兩個(gè)催化殘基天冬氨酸及絲氨酸的序列。
Corin表達(dá)控制區(qū)的克隆為了克隆人與小鼠的Corin基因和它們的5’側(cè)翼區(qū)，合成對(duì)應(yīng)于這些基因的已發(fā)表的Corin cDNA序列(Yan et al.(1999)J.Biol.Chem.27414926-14935)的特異寡核苷酸。在用人或小鼠基因組DNA的基于PCR的反應(yīng)中，用這些寡核苷酸引物測(cè)試擴(kuò)增特異產(chǎn)物。然后將成功地?cái)U(kuò)增特異PCR產(chǎn)物的引物對(duì)用于基于PCR的篩選方法中，該篩選方法用于鑒定含有人或小鼠Corin基因和/或它們的相應(yīng)的5’側(cè)翼區(qū)的BAC克隆。被鑒定為陽(yáng)性的BAC克隆或通過(guò)鳥(niǎo)槍法直接測(cè)序或被亞克隆進(jìn)pUC118(PanVera/Takara，Madison，WI)中進(jìn)行測(cè)序。用Stagen程序包進(jìn)行鳥(niǎo)槍序列的裝配(Bonfield et al.(1995)Nucleic Acids Res.234992-4999)。
用基于PCR的篩選方法獲得四個(gè)BAC克隆，每?jī)蓚€(gè)都含有人與小鼠Corin基因。用鳥(niǎo)槍法測(cè)序三個(gè)BAC克隆，聯(lián)合這些序列以及可獲得的Trace文檔信息(http//www.ncbi.nlm.nih.gov80/Traces/trace.cgi，http//trace.ensembl.org)用于組裝含有人Corin基因的340kb的連續(xù)序列，并確定小鼠Corin基因的5個(gè)重疊群的序列。對(duì)于小鼠Corin基因，通過(guò)各個(gè)鄰近的重疊群內(nèi)的所存在的一些配對(duì)閱讀對(duì)確認(rèn)5個(gè)重疊群的順序。這些距離容許我們確定出空隙大小為小于500bp，因?yàn)楣玫镍B(niǎo)槍文庫(kù)的插入大小已經(jīng)被很好的定義。然后分析人及小鼠的Corin基因的結(jié)構(gòu)。然而，340kb的人基因組序列不含有5’側(cè)翼區(qū)。從BAC 26540中分離得到的另一個(gè)4165bp的Hind III-EcoR I片段包括3919bp的5’側(cè)翼區(qū)、所有的外顯子1以及內(nèi)含子1的一部分(已呈交給GenBankTM/EBI data Bank，編號(hào)為AF 521006)。
在此所描述的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸都來(lái)源于分離于BAC26540的4165bp的Hind III-EcoR I片段(見(jiàn)圖8，SEQ ID NO2)。用基于PCR的方法、或限制酶消化法或聯(lián)合這兩種方法得到這些表達(dá)控制區(qū)多核苷酸。用引物F1(5′-AAGCTTCATGAGGGCAGGAG-3′)(SEQ ID NO7)和R1(5′-GAGCTCGCTTATTCTTCTGTCCACTT-3′)(SEQ ID NO8)從Hind III-EcoR I片段或人基因組DNA中擴(kuò)增得到4023bp的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸(SEQ ID NO6)。相似地，用引物F2(5′-AAGCTTATAAAAATAATAGCTTCTTC-3′)(SEQ ID NO9)和R1擴(kuò)增得到1283bp的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸(SEQ ID NO5)，以及用引物F3(5′-AAGCTTAGTAACTCTTTTGCTCCCAA-3′)(SEQ ID NO10)和R1擴(kuò)增得到391bp的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸(SEQ ID NO4)。
可以容易地從中提取出DNA的任何哺乳動(dòng)物組織例如白細(xì)胞都是用于分離哺乳動(dòng)物Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的基因組DNA的適宜的來(lái)源。
功能性的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸通過(guò)將特定的表達(dá)控制區(qū)多核苷酸可操縱地連接到報(bào)告基因上，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)心肌細(xì)胞中，以及測(cè)定特殊的表達(dá)控制區(qū)多核苷酸序列指導(dǎo)報(bào)告基因的心臟特異性轉(zhuǎn)錄的能力來(lái)測(cè)定上述的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的心臟特異性轉(zhuǎn)錄活性。報(bào)告基因通常編碼具有容易測(cè)定的酶活性而且宿主細(xì)胞天然不存在的蛋白。常見(jiàn)的真核啟動(dòng)子的報(bào)告基因蛋白包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢火蟲(chóng)或Renilla螢光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、堿性磷酸酶和綠色熒光蛋白(GFP)。優(yōu)選的報(bào)告基因是螢火蟲(chóng)螢光素酶。
將一個(gè)檢測(cè)Corin表達(dá)控制區(qū)活性的體系瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)細(xì)胞株。帶有與報(bào)告基因可操縱地連接的表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的檢測(cè)載體可以被轉(zhuǎn)染進(jìn)任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞株中用于檢測(cè)啟動(dòng)子活性；細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因的方法見(jiàn)于Ausubel et al.(2000)，supra；TransfectionGuide，Promega Corporation，Madison，WI(1998)。通過(guò)將檢測(cè)載體平行地轉(zhuǎn)染心臟源性的細(xì)胞株以及非心臟源性的細(xì)胞株可以檢測(cè)Corin控制區(qū)多核苷酸的心臟特異性轉(zhuǎn)錄活性。通常，與檢測(cè)載體一起共轉(zhuǎn)染含有已知的啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的第二個(gè)報(bào)告基因的對(duì)照載體，例如Sv40早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的Renilla螢光素酶(pRL-SV40，Promega，Madison，WI)，用于控制不同細(xì)胞株之間的轉(zhuǎn)染效率或報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的差異。
或者，通過(guò)直接測(cè)定從報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的RNA量也可以測(cè)定出Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸所驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄。在這些實(shí)施方案中，報(bào)告基因可以是任何可轉(zhuǎn)錄的已知序列的且宿主細(xì)胞所沒(méi)有表達(dá)的核酸。本領(lǐng)域的技術(shù)例如mRNA逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增、總RNA或poly A+RNA的分離、northern印跡法、斑點(diǎn)雜交、原位雜交、RNase保護(hù)、引物擴(kuò)增、高密度多核苷酸陣列檢測(cè)技術(shù)等等可用于分析Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸構(gòu)建體所表達(dá)的RNA。
常規(guī)地測(cè)定相對(duì)于對(duì)照構(gòu)建體的Corin控制區(qū)多核苷酸序列激活轉(zhuǎn)錄的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)比較與Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸連接的報(bào)告基因的表達(dá)和沒(méi)有與這樣的序列連接的同樣的報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)測(cè)定Corin控制區(qū)多核苷酸激活轉(zhuǎn)錄的能力。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，比較pRL-SV40與在螢光素酶基因的5’端插入Corin控制區(qū)多核苷酸序列的pRL-SV40之間的螢光素酶的表達(dá)(見(jiàn)實(shí)施例2，圖4)。在其它的實(shí)施方案中，可以與已知啟動(dòng)子的活性比較Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的活性。因此，比較了Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的活性與特定的啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的活性(例如，pGL3-對(duì)照的SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，Promega，Madison，WI)。
通過(guò)比較報(bào)告基因在心臟源性與非心臟源性細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄測(cè)定Corin表達(dá)控制區(qū)所指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的心臟特異性。用于測(cè)定心臟特異性轉(zhuǎn)錄的適宜的心臟源性細(xì)胞株是AT-1(Claycomb et al.(1998)Proc.Nafl.Acad.Sci.952979-2984)，HL-1(Lanson et al.(1992)Circulation 851835-1841)，以及HL-5(Wu et al.(2002)J.Biol.Chem.27716900-16905)。優(yōu)選的細(xì)胞株是HL-5細(xì)胞株。任何容易轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株都可以用于測(cè)定Corin表達(dá)控制區(qū)在非心臟源性細(xì)胞中的活性(例如，HeLa細(xì)胞，ATCCNo.CCL2)。在實(shí)施例3中(圖5)，通過(guò)比較具有和不具有這些表達(dá)控制區(qū)片段的載體在HL-5及HeLa細(xì)胞株中的螢火蟲(chóng)螢光素酶的表達(dá)來(lái)證明人(hCp405LUC)與小鼠(mCp642LUC)Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的心臟特異性活性。對(duì)于每一種檢測(cè)，將Corin表達(dá)控制區(qū)活性標(biāo)準(zhǔn)化為共轉(zhuǎn)染的SV40啟動(dòng)子活性(即pGL3-對(duì)照)來(lái)控制不同細(xì)胞株之間的變異性。
一旦在Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸中證實(shí)了心臟特異性的轉(zhuǎn)錄活性，可以構(gòu)建缺失、突變、重排以及其它的序列修飾，并用本發(fā)明的方法測(cè)定心臟特異性的轉(zhuǎn)錄。這些Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的衍生物可用于生成更緊湊的啟動(dòng)子，以減少非心源性細(xì)胞的背景表達(dá)、消除抑制序列或鑒定新的心臟特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。比較人與嚙齒動(dòng)物的Corin表達(dá)控制區(qū)序列可以鑒定保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，包括那些賦予心臟特異性表達(dá)的元件。
本領(lǐng)域已知的常規(guī)的重組DNA方法可以構(gòu)建Corin表達(dá)控制區(qū)的亞片段及衍生物。這些方法可以生成一系列Corin表達(dá)控制區(qū)序列內(nèi)的缺失衍生物(實(shí)施例2)。通過(guò)比較缺失系列的轉(zhuǎn)錄活性，可以定位出造成或減弱心臟特異性轉(zhuǎn)錄的元件。根據(jù)這些分析，可以設(shè)計(jì)出Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的改良衍生物。例如，Corin表達(dá)控制區(qū)元件可以與異源性啟動(dòng)子的心臟特異的或通用的調(diào)節(jié)元件組合以增加Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸的心臟特異性或活性。
載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體、用本發(fā)明載體遺傳學(xué)加工的宿主細(xì)胞以及重組技術(shù)生成的本發(fā)明的多肽產(chǎn)物。這些技術(shù)被描述于Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Plainview，N.Y.，1989和Ausubel，F(xiàn).M.et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1989。
為了可以表達(dá)所連接的多核苷酸編碼的產(chǎn)物例如Corin，宿主細(xì)胞可以被遺傳學(xué)加工成組合有含有本發(fā)明的Corin表達(dá)控制區(qū)的多核苷酸以及含有與Corin表達(dá)控制區(qū)可操縱地連接的編碼Corin或其它多肽的基因的多核苷酸。利用熟知的感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位、轉(zhuǎn)化技術(shù)可以將多核苷酸引入到宿主細(xì)胞內(nèi)?？梢詥为?dú)或與其它多核苷酸一起引入多核苷酸。這些其它的多核苷酸可以被單獨(dú)引入、共同引入或結(jié)合到本發(fā)明的多核苷酸后引入。
因此，例如利用例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染及選擇技術(shù)可以將本發(fā)明的多核苷酸與另一種編碼選擇性標(biāo)記物的單獨(dú)的多核苷酸一起轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。在這種情況中，多核苷酸通常被穩(wěn)定地結(jié)合于宿主細(xì)胞的基因組中。
或者，多核苷酸可以與含有選擇性標(biāo)記物的載體結(jié)合并用于在宿主中的繁殖。用前述的技術(shù)可以將載體構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞內(nèi)。通常，質(zhì)粒載體以沉淀物中的DNA，例如磷酸鈣沉淀或與帶電荷脂質(zhì)形成復(fù)合物的形式被引入。也可以用電穿孔將多核苷酸引入到宿主中。如果載體是病毒，那么它可以在體外被包裝或引入到包裝細(xì)胞內(nèi)并且被包裝的病毒可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)發(fā)明的這個(gè)部分，大量的適合于制備多核苷酸以及將多核苷酸引入到細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域人員是熟知及常規(guī)的技術(shù)。這些技術(shù)在上述引用的Sambrook等中已經(jīng)被詳細(xì)地描述，它是許多詳細(xì)描述這些技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)的一個(gè)范例。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，載體可以是例如質(zhì)粒、單鏈或雙鏈?zhǔn)删w載體、單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。用熟知的將DNA和RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞的技術(shù)可以將這些載體以多核苷酸，優(yōu)選的作為DNA形式引入到細(xì)胞內(nèi)。對(duì)于噬菌體和病毒載體，用熟知的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)也可以將載體以被包裝或包裹的病毒的形式轉(zhuǎn)染細(xì)胞。病毒載體可以是可復(fù)制的或不可復(fù)制的。在后一種情況中，病毒傳播通常只發(fā)生在互補(bǔ)的宿主細(xì)胞中。
在某些部分，優(yōu)選的載體是那些用于表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸及多肽的載體。這些載體通常包括對(duì)于表達(dá)宿主內(nèi)與宿主可操縱地連接的需表達(dá)的多核苷酸是有效的順式作用控制區(qū)。適宜的反式作用因子或由宿主提供、由互補(bǔ)載體提供或由引入到宿主內(nèi)的載體本身提供。
用多種已知的及常規(guī)的技術(shù)中的任何一種技術(shù)可以將本發(fā)明的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸插入到載體內(nèi)。一般而言，通過(guò)用一種或多種限制性內(nèi)切酶降解DNA序列和表達(dá)載體以及然后用T4 DNA連接酶將這些限制性片段連接在一起，將用于表達(dá)的DNA連接到表達(dá)載體中。用于這個(gè)目的的內(nèi)切酶限制性及連接的方法對(duì)于本領(lǐng)域人員是熟知及常規(guī)的技術(shù)。這方面的適合的方法以及用其它技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體的方法對(duì)于這些人員也是熟知及常規(guī)的技術(shù)，并且在在此引用的Sambrook等中有更多詳細(xì)的描述。
Corin表達(dá)控制區(qū)的用途本發(fā)明的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸適用于在心臟源性細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)治療性分子。治療性分子的心臟特異性表達(dá)可用于例如治療充血性心衰、高血壓以及心臟肥大。因此，含有與本發(fā)明的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸可操縱地連接的治療性多核苷酸的載體可以被構(gòu)建并被施用于患者以治療心臟病及發(fā)展新的和改進(jìn)的治療方法。
任何治療性多核苷酸都可以被可操縱地連接于Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸，包括但不限定于表達(dá)Corin的多核苷酸。通常，Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸包含于表達(dá)盒內(nèi)并插入于所表達(dá)的治療性多核苷酸的5’端。Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸可以被定位于非常接近于治療性多核苷酸的位置，盡管Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸增強(qiáng)子元件可以定位于治療性多核苷酸的數(shù)千堿基內(nèi)的任何位置，包括治療性多核苷酸的3’末端以及內(nèi)含子中。通過(guò)將Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸以相對(duì)于報(bào)告基因的合適的構(gòu)型定位并如在此所描述的檢測(cè)心臟特異性報(bào)告基因的活性可以驗(yàn)證給定位點(diǎn)的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸賦予心臟特異性表達(dá)的能力。
Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸可以被直接連接于編碼治療性分子的多核苷酸，且不需要附加序列。在Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸不包括Corin表達(dá)起始元件的實(shí)施方案中，應(yīng)當(dāng)提供例如TATA盒及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的附加元件。這些元件可以是治療性基因的天然轉(zhuǎn)錄元件，也可以是來(lái)源于異源性真核或病毒啟動(dòng)子的元件。例外，只要保留心臟特異性的表達(dá)(如本發(fā)明的檢測(cè)所測(cè)定的)，通過(guò)包含來(lái)自治療性基因或來(lái)自異源性基因的增強(qiáng)子和多腺苷酰化序列可以增加治療基因的表達(dá)水平。
在Tang et al.(2002)Methods 28259-266；Philips et al.(2002)Hypertension 39651-655；Prentice et al.(1997)Cardiovas.Res.35567-574；Beggah AT et al.(2002)PNAS 997160-7165；Monte et al.(2003)J.Physiol.54649-61中可以發(fā)現(xiàn)體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染心臟源性細(xì)胞的載體、確保體內(nèi)心臟源性細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)表達(dá)的方法、將治療性多核苷酸可操縱地連接于心臟特異性啟動(dòng)子的方法、以及體外或體內(nèi)將載體靶向于心臟細(xì)胞的方法、施用途徑以及用治療性載體治療心臟病的劑量。
因此，本發(fā)明的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸可以用于心臟特異性表達(dá)各種治療性多核苷酸。Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸所表達(dá)的治療性多核苷酸是活性多核苷酸本身(例如反義及催化性多核苷酸)或編碼具有治療作用的蛋白的多核苷酸。
反義及催化性核糖核苷酸的表達(dá)可以被Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸所表達(dá)的治療性多核苷酸的一種類型是反義RNA或RNA(Fire，A.(1999)Trends.Genet 15358-363；Sharp，P.(2001)Genes Dev.15485-490)。在這些實(shí)施方案中，Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸被可操縱地連接于多核苷酸，該多核苷酸被細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄后能與靶mRNA結(jié)合。在例如Stein & Cohen(1988)Cancer Res.482659-68和van der Krol et al.(1988)Bio Techniques 6958-76中描述了根據(jù)編碼靶蛋白的cDNA序列的反義序列的衍生物。靶蛋白通常是一種它的存在被認(rèn)為是造成了或增加了心臟病的機(jī)會(huì)的蛋白，例如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、血管緊張素II受體或NF-ATC(Stein et al.(1998)Amer.Heart J.135914-923；Levin et al.(1998)New Eng.J.Med.339321-328；Keating andGoa(2003)Drugs 6347-70)。因此，反義分子的心臟特異性表達(dá)可以優(yōu)選地減少這些蛋白在高危個(gè)體中的表達(dá)。已經(jīng)描述了心臟特異性的反義分子表達(dá)的成功應(yīng)用(Beggah AT et al.(2002)PNAS 997160-7165)。這些利用心臟特異性表達(dá)的方法已經(jīng)證實(shí)在治療心臟纖維化及心衰上是成功的(Lee et al.(1966)Anticancer Res.161805-11)。
除了反義多核苷酸，可以設(shè)計(jì)核酶以抑制靶分子的表達(dá)。核酶是一種能催化地降解其它RNA分子的RNA分子。因此，通過(guò)將編碼核酶的多核苷酸連接于Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸，可以用本發(fā)明的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸在心臟源性細(xì)胞內(nèi)特異性地表達(dá)核酶。已經(jīng)描述了不同類型的核酶，包括I組核酶、錘頭狀核酶、發(fā)夾狀核酶、RNase P、以及斧頭狀核酶(axhead ribozyme)(見(jiàn)，例如Castanotto et al.(1994)Adv.inPharmacology 25289-317對(duì)不同核酶特性的綜述)。在例如Hampelet al.(1990)Nucl.Acids Res.18299-304；Hampel et al.，歐洲專利文件No.0 360257(1990)；美國(guó)專利No.5,254,678中描述了發(fā)夾狀核酶的常見(jiàn)特性。制備核酶的方法對(duì)于本領(lǐng)域人員是熟知的(見(jiàn)，例如Wong-Staal et al.，WO 94/26877；Ojwang et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906340-44；Yamada et al.(1994)Hum.Gene Ther.139-45；Leavitt et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92699-703；Leavitt et al.(1994)Hum.Gene Ther.51115-20；和Yamada et al.(1994)Virology 205121-26)。
治療性蛋白的表達(dá)很多種治療性蛋白可以用于治療心臟病。因此，可以用本發(fā)明的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸在心臟細(xì)胞內(nèi)特異性地表達(dá)編碼治療性蛋白的多核苷酸。治療性蛋白可以是原核、真核、病毒或合成來(lái)源的蛋白。當(dāng)治療性蛋白不是哺乳動(dòng)物來(lái)源時(shí)，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法(例如，哺乳動(dòng)物密碼子選擇及同一轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))可以將蛋白的編碼序列修飾為最大化的哺乳動(dòng)物的表達(dá)。
可以將治療性蛋白可操縱地連接于Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸，使得可以進(jìn)行心臟特異性的表達(dá)并被成功地應(yīng)用于治療各種病因的心臟病，包括(但不限定于)缺血性心臟病、高血壓心臟病、瓣膜性心臟病、心肌炎、Chagas心肌病和特發(fā)性心肌病。這些治療性蛋白包括但不限定于例如Corin的蛋白，它將心房肽前體(pro-ANP)轉(zhuǎn)化為ANP以及B型利鈉肽，ANP通過(guò)促進(jìn)鈉的排泄以及血管擴(kuò)張來(lái)降低血容量和血壓。
Corin表達(dá)調(diào)控物的鑒定可以用本發(fā)明的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸鑒定新的調(diào)控物，它們可用于控制哺乳動(dòng)物尤其是人的心臟相關(guān)性疾病，實(shí)例包括心血管性高血壓、充血性心衰或心肌病。這些調(diào)控物可用于治療具有異常水平的Corin基因表達(dá)的宿主。也可以用Corin基因調(diào)控物治療Corin基因表達(dá)的水平所影響的疾病和病變，例如但不限定于機(jī)械性牽拉、血容量、鹽排泄、尿量以及血管舒縮張力。調(diào)控物也可用于治療動(dòng)物的與所選定的多肽的表達(dá)水平相關(guān)的模擬人的疾病或病變。
具體地，通過(guò)物質(zhì)所造成報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平變化的能力可以鑒定出結(jié)合并調(diào)控這些表達(dá)的物質(zhì)，報(bào)告基因例如螢光素酶，如前所述它被可操縱地連接于Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸(見(jiàn)實(shí)施例2)。
上述方法中所測(cè)定的物質(zhì)可以被隨機(jī)地選擇或有目的地選擇或設(shè)計(jì)。如在此所用的，當(dāng)不考慮任何特異的序列隨機(jī)地選擇物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)被認(rèn)為是被隨機(jī)選擇的。隨機(jī)選擇的物質(zhì)的實(shí)例是化學(xué)文庫(kù)或生物體的生長(zhǎng)培養(yǎng)基或植物提取物(Bunin，et al.(1992)J.Am.Chem.Soc.11410997-10998，在此一同并入?yún)⒖?。
如在此所用的，當(dāng)考慮靶位點(diǎn)的序列和/或其與物質(zhì)作用相關(guān)的構(gòu)象從非隨機(jī)的基庫(kù)中選擇物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)被認(rèn)為是被有目的選擇或設(shè)計(jì)的。
基因治療本發(fā)明提供了可以被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)用于體外和體內(nèi)治療目的的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸。這些核酸可以被插入到大量的用于轉(zhuǎn)染如下所述的靶細(xì)胞和生物體的熟知載體中的任何一個(gè)載體中。通過(guò)載體與靶細(xì)胞之間的相互作用，可以將核酸體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。通常，Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸與第二種治療有用的多核苷酸的可操縱地連接造成了第二種多核苷酸的心臟特異性的表達(dá)。將足量的組合物施用于患者以引發(fā)患者的治療反應(yīng)。達(dá)到這點(diǎn)的足夠多的量被稱為“治療有效劑量或治療有效量”。
這些基因治療方法已經(jīng)被用于糾正獲得性或先天性遺傳缺陷、腫瘤和病毒感染等等。在人體中表達(dá)治療有用的人工基因的能力有助于許多重要的人類疾病的預(yù)防和/或治愈，這些疾病包括許多其它治療方法所不能治療的疾病(基因治療方法的綜述，見(jiàn)Anderson(1992)Science 256808-13；Nabel & Felgner，TIBTECH(1993)，Vol.11，pp.211-17；Mitani &Caskey，TIBTECH(1993)，Vol.11，pp.162-66；Mulligan，Science(1993)，Vol.260，pp.926-32；Dillon，TIBTECH(1993)，Vol.11，pp.167-75；Miller，Nature(1992)，Vol.357，pp.455-60；Van Brunt，Biotechnology(1998)，Vol.6，pp.1149-54；Vigne，Restorative Neurol.Neurosci.(1995)，Vol.8，pp.35-36；Kremer & Perricaudet，British Medical Bulletin(1995)，Vol.51，pp.31-44；Haddada et al.，in Current Topics in Microbiology and Immunology(Doerfler& Bohm eds.，1995)；以及Yu et al.，Gene Therapy(1994)，Vol.1 pp.13-26)。
將基因或遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)是基于基因治療的疾病治療的第一步。本領(lǐng)域人員熟知大量轉(zhuǎn)移方法。優(yōu)選的，施用核酸以用于體內(nèi)或體外基因治療的用途。非病毒載體轉(zhuǎn)移體系包括DNA質(zhì)粒、裸核酸以及與轉(zhuǎn)移微粒例如脂質(zhì)體復(fù)合的核酸。病毒載體轉(zhuǎn)移體系包括DNA和RNA病毒，它在轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞后可以是游離或整合于基因組中。
核酸的非病毒轉(zhuǎn)移的方法包括脂染、微注射、biolistics、病毒核蛋白顆粒、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽(yáng)離子或脂質(zhì)核酸結(jié)合體、裸DNA、人工病毒顆粒以及物質(zhì)強(qiáng)化的DNA攝取。在例如美國(guó)專利No 5,049,386、4,946,787和4,897,355中描述了脂染，脂染試劑是可商業(yè)化獲得的(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。適合用于多核苷酸的有效的受體識(shí)別脂染的陽(yáng)離子及中性脂質(zhì)包括Felgner在WO 91/17424和WO 91/16024中所述的那些?？梢赞D(zhuǎn)移到細(xì)胞(體外施用)或靶組織(體內(nèi)施用)。
本領(lǐng)域人員熟知脂質(zhì)核酸復(fù)合物的制備，包括例如免疫脂質(zhì)復(fù)合物的靶向脂質(zhì)體(見(jiàn)例如，Crystal，Science(1995)，Vol.270，pp.404-10；Blaese et al.，Cancer Gene Ther.(1995)，Vol.2，pp.291-97；Behr et al.，Bioconjugate Chem.(1994)，Vol.5，pp.382-89；Remy et al.，BioconjugateChem.(1994)，Vol.5，pp.647-54；Gao et al.，Gene Therapy(1995)，Vol.2，pp.710-22；Ahmad et al.，Cancer Res(1992)，Vol.52，pp.4817-20；美國(guó)專利Nos.4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
使用用于轉(zhuǎn)移核酸的基于RNA或DNA病毒的體系的優(yōu)點(diǎn)是將病毒靶向于體內(nèi)的特異細(xì)胞并將病毒載量加入到核內(nèi)的高度進(jìn)化的過(guò)程?？梢灾苯訉⒉《据d體施用于患者(體內(nèi))或可以將病毒載體體外處理細(xì)胞并將經(jīng)修飾的細(xì)胞施用于患者(體外)。用于轉(zhuǎn)移核酸的常規(guī)的基于病毒的體系包括用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒以及單純皰疹病毒的載體。目前病毒載體是最有效的和用途廣泛的靶細(xì)胞與組織的基因轉(zhuǎn)移的方法。用逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)移方法可以整合于宿主基因組中，常造成插入的轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期表達(dá)。另外，在許多不同的細(xì)胞類型和靶組織中觀察到了較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。特別地，目前至少有六種病毒載體方法正被用于基因轉(zhuǎn)移的臨床試驗(yàn)，至今逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是應(yīng)用最為廣泛的體系。所有的這些病毒載體都利用涉及插入到輔助細(xì)胞株的基因?qū)θ毕葺d體的互補(bǔ)作用并生成轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的方法。
通過(guò)結(jié)合外源性的包被蛋白可以改變逆轉(zhuǎn)錄病毒的向性，擴(kuò)展?jié)撛诎邢虻陌屑?xì)胞群。慢病毒載體是能轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染非分裂細(xì)胞病通常能生成高病毒滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。因此，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移體系的選擇將依賴于靶組織。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由具有包裝最大到6-10kbp外源序列的能力的順式作用長(zhǎng)末端重復(fù)構(gòu)成。最小的順式作用LTR作用于載體的復(fù)制和包裝，然后它被用于將治療基因整合到靶細(xì)胞中以提供永久的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。被廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括那些基于小鼠白細(xì)胞病毒(MuLV)、長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)以及它們的組合載體(見(jiàn)例如Buchscher et al.，J.Virol.(1992)，Vol.66，pp.2731-39；Johann et al.，J.Virol.(1992)，Vol.66，pp.1635-40；Sommerfelt et al.，Virology(1990)，Vol.176，pp.58-59；Wilson et al.，J.Virol.(1989)，Vol.63，pp.2374-78；Miller et al.，J.Virol.(1991)，Vol.65，pp.2220-24；PCT/US94/05700)。
pLASN和MFG-S是已經(jīng)應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例(Dunbar et al.，Blood(1995)，Vol.85，pp.3048-57；Kohn et al.，Nat.Med.(1995)，Vol.1，pp.1017-23；Malech et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)，Vol.94，pp.12133-38)。PA317/pLASN是第一個(gè)應(yīng)用于基因治療試驗(yàn)的治療性載體(Blaese et al.，Science(1995)，Vol.270，pp.475-80)。在MFG-S包裝的載體中觀察到了50％或更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(Ellem et al.，Immunol.Immunother.(1997)，Vol.44，pp.10-20；Dranoff et al.，Hum.Gene Ther.(1997)，Vol.1，pp.111-23)。
在優(yōu)選為核酸的瞬時(shí)表達(dá)的申請(qǐng)中，常使用基于腺病毒的體系?；谙俨《镜捏w系在許多細(xì)胞類型中都具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并且不需要細(xì)胞分裂。用這些載體，已經(jīng)獲得高滴度及高水平的表達(dá)。在相對(duì)簡(jiǎn)單的體系中可以大量生產(chǎn)這種載體。腺相關(guān)病毒(“AAV”)也用于靶核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如在核酸及肽的體外生產(chǎn)，以及體內(nèi)及體外基因治療方法中(見(jiàn)，例如West et al.，Virology(1987)，Vol.160，pp.38-47；美國(guó)專利No.4,797,368；WO 93/24641；Kotin，Hum.Gene Ther.(1994)，Vol.5，pp.793-801；Muzyczka，J.Clin.Invest.(1994)，Vol.94，pp.1351)。在大量文獻(xiàn)中都描述了重組AAV載體的構(gòu)建，包括美國(guó)專利No.5,173,414；Tratschinet al.，Mol.Cell.Biol.(1985)，Vol.5，pp.3251-60；Tratschinet al.，Mol.Cell.Biol.(1984)，Vol.4，pp.2072-81；Hermonat & Muzyczka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1984)，Vol.81，pp.6466-70；以及Samulski et al，J.Virol.(1989)，Vol.63，pp.3822-28。
重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)是一種基于缺陷的及非致病性的細(xì)小病毒2型腺相關(guān)病毒的有前途的可選擇的基因轉(zhuǎn)移體系。所有載體都來(lái)源于一個(gè)質(zhì)粒，它只保留了轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒一側(cè)的AAV 145bp的反向末端重復(fù)。因?yàn)檎线M(jìn)所轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的基因組內(nèi)所具有的有效的基因轉(zhuǎn)移及穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移是這種載體體系的重要特點(diǎn)(Wagner et al，Lancet(1998)，Vol.351，pp.1702-03；Kearnset al.，Gene Ther.(1996)，Vol.9，pp.748-55)。
復(fù)制缺陷重組腺病毒載體(Ad)主要被用于瞬時(shí)表達(dá)的基因治療，因?yàn)樗鼈兛梢员桓叩味鹊厣刹⑶宜鼈內(nèi)菀赘腥径喾N不同的細(xì)胞類型。絕大多數(shù)腺病毒載體被加工成轉(zhuǎn)基因取代了Ad E1a、E1b和E3基因；隨后在人293細(xì)胞中擴(kuò)增復(fù)制缺陷載體，該細(xì)胞反式提供了被刪除基因的功能。Ad載體可以體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)多種類型的組織，包括例如在肝臟、腎臟和肌肉系統(tǒng)組織中所發(fā)現(xiàn)的非分裂的、已分化的細(xì)胞。傳統(tǒng)的Ad載體具有很大的攜帶能力。Ad載體在臨床試驗(yàn)上應(yīng)用的一個(gè)實(shí)例包括多核苷酸治療用于肌肉注射的抗腫瘤接種免疫(Stermanet al.，Hum.Gene Ther.(1998)，Vol.9，pp.1083-92)。腺病毒載體在基因轉(zhuǎn)移的臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用的實(shí)例還包括Rosenecker et al.，Infection(1996)，Vol.241，pp.5-10；Welsh et al.，Hum.Gene Ther.(1995)，Vol.2，pp.205-18；Alvarez et al.，Hum.Gene Ther.(1997)，Vol.5，pp.597-613；Topf et al.，Gene Ther.(1998)，Vol.5，pp.507-13；Stermanet al.，Hum.Gene Ther.(1998)，Vol.9，pp.1083-89。
在許多基因治療的應(yīng)用中，需要的是基因治療載體的轉(zhuǎn)運(yùn)應(yīng)具有對(duì)特殊組織類型的高度特異性。通過(guò)在病毒的外表面表達(dá)一個(gè)作為與病毒包膜蛋白的融合蛋白的配基，通常可將病毒載體修飾為具有對(duì)特定細(xì)胞類型的特異性。所選擇的配基具有對(duì)目標(biāo)細(xì)胞類型中存在的已知受體的親和力。例如，Han et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)，Vol.92，pp.9747-51報(bào)告，Moloney小鼠白血病病毒可以被改造成表達(dá)與gp70融合的Heregulin，該重組病毒感染特定的表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子受體的人乳腺癌細(xì)胞。這個(gè)原理可被擴(kuò)展到其它對(duì)的表達(dá)配基融合蛋白的病毒與表達(dá)受體的靶細(xì)胞。例如，絲狀噬菌體可以被加工成展示具有對(duì)任何所選定的細(xì)胞受體的特異性結(jié)合親和力的抗體片段(例如，F(xiàn)ab或Fv)。盡管上述的方法主要應(yīng)用于病毒載體，但是相同的方法也可以應(yīng)用于非病毒載體。這些載體可以被加工成具有被認(rèn)為能有利于特殊的靶細(xì)胞攝取的特殊攝取序列。
藥用組合物及施用本發(fā)明也涉及藥用組合物，它可以包括聯(lián)合有可藥用載體的Corin表達(dá)控制區(qū)，或含有表達(dá)控制區(qū)的載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可藥用載體是藥學(xué)惰性的載體。
通過(guò)施用可以將基因治療載體體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到個(gè)體患者中，經(jīng)常通過(guò)全身施用(例如，靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或顱內(nèi)灌注)或局部施用，如下面所描述的。同樣可以將載體體外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，例如從個(gè)體患者中取得的細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞、骨髓穿刺物、組織活檢物)或通用供體的造血干細(xì)胞，緊接著將細(xì)胞重新移植到患者體內(nèi)，這通常是在選擇出已經(jīng)整合有載體的細(xì)胞之后。
本領(lǐng)域人員熟知用于診斷、研究或基因治療的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法(例如，通過(guò)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新輸注到宿主體內(nèi))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從對(duì)象生物體中分離出細(xì)胞，用核酸(基因或cDNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將細(xì)胞重新輸注回對(duì)象生物體內(nèi)(例如患者)。本領(lǐng)域人員熟知各種適用于體外轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型(見(jiàn)，例如Freshney et al.，Culture of Animal Cells，A Manual ofBasic Technique(3rd ed.，1994)，以及其中所引用的關(guān)于如何從患者中分離及培養(yǎng)細(xì)胞的討論的參考文獻(xiàn))。
也可以將用于體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的含有治療性核酸的載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等)直接施用于生物體。同樣，可以施用裸DNA。通過(guò)任何正常地用于將分子引入與血液或組織細(xì)胞最后接觸的途徑施用。適合于施用這些核酸的方法是可獲得的并且是為本領(lǐng)域人員所熟知的，盡管多于一種途徑可用于施用特殊的組合物，但一種特殊的途徑常比另一種途徑提供更迅速及更有效的反應(yīng)。
所施用的具體的組合物(例如，核酸、蛋白、調(diào)控化合物或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞)以及用于施用組合物的具體方法部分地決定了所用的可藥用載體。因此，有很多種本發(fā)明的藥用組合物的適宜制劑(見(jiàn)，例如Remington’sPharmaceutical Sciences，17thed.，1989)。施用可以是任何便利的方式，例如經(jīng)注射、口服施用、吸入或經(jīng)皮使用。
適合于口服施用的制劑包括(a)液體溶液，例如懸浮于稀釋液的有效量的被包裝的核酸，稀釋液例如水、鹽水或PEG 400)；(b)膠囊、粉劑或片劑，每種都含有設(shè)定量的為液體、固體、顆粒或凝膠的活性成分；(c)適宜液體中的懸浮液；以及(d)適宜的乳劑。片劑形式可以包括一種或多種乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖、磷酸鈣、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、明膠、膠體二氧化硅、滑石、硬脂酸鎂、和其它賦形劑、顯色劑、填充劑、粘合劑、稀釋劑、緩沖劑、濕化劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料、分解劑和藥用相容性載體。除了活性成分外，糖錠形式可以包括有味道的活性成分，例如蔗糖，以及含有惰性基底的活性成分的藥片，例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠乳劑、凝膠，以及本領(lǐng)域已知的載體的類似物。
所選定的組合物單獨(dú)或與其它適宜的成分一起可以被通過(guò)制成吸入施用的氣霧劑制劑(即，它們可以被“霧化”)。氣霧劑制劑可以被放置于被壓縮的可用的推進(jìn)劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等。
適合于例如經(jīng)關(guān)節(jié)(關(guān)節(jié)內(nèi))、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下途徑施用的腸外施用的制劑包括水性和非水性、等滲無(wú)菌注射溶液，它可以包括抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得制劑與預(yù)計(jì)受體的血液等滲的溶劑；以及水性和非水性無(wú)菌懸浮液，它可以包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在本發(fā)明的實(shí)踐中，例如可以經(jīng)靜脈內(nèi)輸注、口服、局部、腹腔內(nèi)、膀胱內(nèi)、鞘內(nèi)施用組合物。腸外施用以及靜脈內(nèi)施用是優(yōu)選的施用方法。組合物的制劑放置在單劑量或多劑量的密封容器中，例如安瓿和小藥瓶。
可以從前述類型的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備出注射溶液和懸浮液。如上述也可以經(jīng)靜脈內(nèi)或腸外施用用于體外治療的核酸所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，施用于患者的劑量應(yīng)當(dāng)足夠給患者造成長(zhǎng)時(shí)間的有益治療反應(yīng)的劑量。劑量由所采用的具體載體的效率和患者的條件、以及所治療的患者的體重或體表面積所決定的。劑量的大小也由施用具體載體所伴隨的任何副作用的出現(xiàn)、性質(zhì)以及嚴(yán)重程度、或具體患者的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的類型所決定的。
在決定所施用的載體的有效量中，醫(yī)生評(píng)估載體的血漿水平、載體毒性、疾病進(jìn)展以及抗載體抗體的生成。通常的，對(duì)于常規(guī)的70公斤的患者，與之相當(dāng)?shù)妮d體的裸核酸的劑量是約1μg到100μg，并計(jì)算出包括逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的載體的劑量以得到相當(dāng)劑量的治療性核酸。
對(duì)于施用，本發(fā)明的化合物和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可以以一定的速度被施用，該速度是由抑制劑、載體或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞類型的LD50、和不同濃度的抑制劑、載體或細(xì)胞類型的副作用，如患者的體重和總的健康狀況所決定的?？梢酝ㄟ^(guò)單一劑量或分次劑量施用。
試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥用包裝和試劑盒，包括一個(gè)或多個(gè)裝有一種或多種上述的本發(fā)明的組合物的成分的容器。與這些容器相關(guān)的是管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府部門所規(guī)定的通告形式，這反映了施用人的產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的管理機(jī)構(gòu)的認(rèn)證。
轉(zhuǎn)基因小鼠本發(fā)明的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸也可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，優(yōu)選的是轉(zhuǎn)基因小鼠。這些轉(zhuǎn)基因生物體可用于，例如鑒定和/或描繪調(diào)控這樣的多核苷酸的表達(dá)和/或活性的物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可用作心臟病變的模型。在此闡述的發(fā)明也涉及非人的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在其基因組中包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸的拷貝。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以在它們的基因組中包含有多個(gè)多核苷酸的拷貝。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在它的基因組中包含有人Corin基因的表達(dá)控制區(qū)。本發(fā)明包括各種非人的轉(zhuǎn)基因生物體，例如果蠅、C.elegans、斑馬魚(yú)和酵母。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物，例如牛、山羊、綿羊、兔、非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物、或大鼠，最優(yōu)選的是小鼠。
生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法對(duì)本領(lǐng)域人員是熟知的，并包括例如同源重組、突變(例如，ENU，Rathkolb et al.(2000)Exp.Physio.，85635-644)，和四環(huán)素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)體系(例如，美國(guó)專利No.6,242,667)，在此沒(méi)有被詳細(xì)描述(見(jiàn)例如，Wu et al，Methods in Gene Biotechnology，CRC1997，pp.339-366；Jacenko，O.，Strategies in Generating Transgenic Animals，in Recombinant Gene Expression Protocols.Vol.62 of Methods in MolecularBiology，Humana Press，1997，pp 399-424)。
本發(fā)明也涉及非人的基因敲除動(dòng)物，其基因組包含有與報(bào)告基因序列可操縱地連接的人Corin的表達(dá)控制區(qū)，其中所述的控制區(qū)能有效地啟動(dòng)、終止或調(diào)節(jié)報(bào)告基因序列的轉(zhuǎn)錄。
用任何有效的方法可以完成與控制序列可操縱地連接的報(bào)告基因序列的功能裂解，包括將終止密碼子引入到編碼序列的任何部分，使得所形成的多肽是生物學(xué)無(wú)活性的(例如，因?yàn)樗鄙俅呋Y(jié)構(gòu)域、配體連接結(jié)構(gòu)域等)；將突變引入到啟動(dòng)子或其它調(diào)節(jié)序列中，使得能有效地終止轉(zhuǎn)錄，或減少外源序列的報(bào)告基因序列轉(zhuǎn)錄成使之失活的報(bào)告基因序列。具有功能性裂解基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)例是熟知的，例如在美國(guó)專利No.6,239,326、6,225,525、6,207,878中所描述的。
不需要進(jìn)一步的推敲，相信本領(lǐng)域人員可以利用前面的描述最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。所有的實(shí)施例都利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行，這些技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的，除其它詳細(xì)說(shuō)明的技術(shù)外。
如在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)例如Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，2ndEd.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989中描述的實(shí)施下面實(shí)施例的常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)。
因此，下面優(yōu)選的特殊的實(shí)施方案只作為舉例說(shuō)明，無(wú)論如何都不是對(duì)發(fā)明的剩余內(nèi)容的任何形式的限制。在此一同并入上面所引用的所有申請(qǐng)書(shū)、專利和文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考。
實(shí)施例1包括5’側(cè)翼區(qū)的人與小鼠的Corin基因的分離和描述為了克隆人和小鼠的Corin基因以及它們的5’側(cè)翼區(qū)，合成了與Corin cDNA序列的5’和3’末端相對(duì)應(yīng)的特異的寡核苷酸。在利用人或小鼠基因組DNA的基于PCR的反應(yīng)中，用這些寡核苷酸引物嘗試擴(kuò)增特異產(chǎn)物。用PCR試劑體系(Life Technologies Inc)進(jìn)行PCR反應(yīng)，為30個(gè)擴(kuò)增周期(94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，以及72℃延伸1分鐘)和最后的72℃延伸7分鐘。然后在基于PCR的篩選中用成功擴(kuò)增特異PCR產(chǎn)物的引物對(duì)鑒定含有人或小鼠Corin基因和/或它們的表達(dá)控制區(qū)的BAC克隆。根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)(Incyte Genomics，Palo Alto，CA)進(jìn)行BAC克隆的DNA分離。用利用32P標(biāo)記的人和小鼠Corin DNA探針的southern印跡分析進(jìn)一步確認(rèn)經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的細(xì)菌人工染色體(BAC)克隆。將BAC克隆直接用鳥(niǎo)槍法測(cè)序或?qū)⑵鋪喛寺〉絧UC118(PanVera/Takara，Madison，WI)內(nèi)進(jìn)行測(cè)序。用Staden軟件包進(jìn)行鳥(niǎo)槍序列的組裝(MRC Laboratory of Molecular Biology；Bonfield et al.(1995)Nucleic Acid Res.234992-4999)。
用基于PCR的篩選得到四個(gè)BAC克隆，每?jī)蓚€(gè)都含有人和小鼠Corin基因。采用染料末端化學(xué)法，以鳥(niǎo)槍法測(cè)序三個(gè)BAC克隆。聯(lián)合鳥(niǎo)槍法數(shù)據(jù)與公開(kāi)獲得的Trace文檔信息(http//www.ncbi.nlm.nih.gov80/Traces/trace.cgi，http//trace.ensembl.org)，裝配含有人Corin基因的340kb的連續(xù)序列和小鼠Corin基因的5個(gè)重疊群。通過(guò)相應(yīng)的鄰近重疊群中存在的一些配對(duì)的閱讀對(duì)確認(rèn)5個(gè)重疊群的順序。這些重疊群的距離使得我們可以確定間隔大小小于500bp，因?yàn)楣螟B(niǎo)槍文庫(kù)的插入大小已經(jīng)被很好的定義。然后分析人和小鼠Corin基因的結(jié)構(gòu)。然而340kb的人基因組序列沒(méi)有包含5’側(cè)翼區(qū)。從BAC26540中分離得到另外的4165bp的Hind III-EcoR I片段，它包括5’側(cè)翼區(qū)的最初的3919bp堿基、外顯子1以及內(nèi)含子1的部分堿基對(duì)(提交于GenBankTM/EBI數(shù)據(jù)庫(kù)，編號(hào)為AF 521006)。
利用基于PCR的方法、或限制性酶切方法、或聯(lián)合于兩者，Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸(SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)都來(lái)源于從BAC 26540中分離到的4165bp的Hind III-EcoR I片段(圖8，SEQ ID NO2)。例如，用引物F1(5′-AAGCTTCATGAGGGCAGGAG-3′)(SEQ ID NO7)和R1(5′-GAGCTCGCTTATTCTTCTGTCCACTT-3′)(SEQ ID NO8)從4165bp Hind III-EcoR I片段或人基因組DNA中擴(kuò)增得到在此所述的4023bp的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸(SEQ ID NO6)。用引物F2(5′-AAGCTTATAAAAATAATAGCTTCTTC-3′)(SEQ ID NO9)和R1從4165bp Hind III-EcoR I片段或人基因組DNA中擴(kuò)增得到在此所述的1283bp的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸(SEQ ID NO5)。用引物F3(5′-AAGCTTAGTAACTCTTTTGCTCCCAA-3′)(SEQ ID NO10)和R1從4165bp Hind III-EcoR I片段或人基因組DNA中擴(kuò)增得到在此所述的391bp的Corin表達(dá)控制區(qū)多核苷酸(SEQ ID NO4)。任何從中容易提取出DNA的哺乳動(dòng)物組織都是用于分離哺乳動(dòng)物Corin多核苷酸的基因組DNA的適宜來(lái)源。
實(shí)施例25’側(cè)翼區(qū)的啟動(dòng)子活性通過(guò)制備人或小鼠的Corin基因的5’側(cè)翼序列的連續(xù)的截?cái)嗥闻c無(wú)啟動(dòng)子的螢光素酶基因相連接(見(jiàn)圖4A)的報(bào)告基因構(gòu)建體測(cè)定Corin基因的5’側(cè)翼區(qū)的啟動(dòng)子活性。分兩步產(chǎn)生人Corin啟動(dòng)子報(bào)告基因構(gòu)建體，hCp1297LUC(與螢火蟲(chóng)螢光素酶基因相連的1283bp的Corin表達(dá)控制區(qū)(SEQ ID NO))以及hCp405LUC(與螢火蟲(chóng)螢光素酶基因相連的391bp的Corin表達(dá)控制區(qū)(SEQ ID NO))首先，用具有Sac I和Hind III的限制性位點(diǎn)的引物相應(yīng)地PCR克隆-1297或-405到-15的人Corin基因的5’側(cè)翼區(qū)；以及第二步，將相應(yīng)的PCR產(chǎn)物插入到pGL3基本載體(Promega，Madison，WI)的Sac I和Hind III位點(diǎn)中。
相似地，用上述的PCR克隆方法制備小鼠Corin啟動(dòng)子構(gòu)建體，mCp1183LUC、mCp809LUC和mCp646LUC。用EndoFree Plasmid Maxi試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)制備這些構(gòu)建體的質(zhì)粒。根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)用基于Lipofectin的方法進(jìn)行對(duì)HL-5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(Claycomb et al.(1998)Proc.Nati.Acad.Sci.，USA 952979-2984)。簡(jiǎn)要的，將10μg每種Corin報(bào)告基因構(gòu)建體的DNA加上0.1μg pSL-SV40與1ml含有20μgLipofectin的OPTI-MEM I低血清培養(yǎng)基(reduced-serum medium)混和。在室溫下孵育混合物30分鐘，然后將混合物加入到培養(yǎng)于6孔板的一個(gè)孔內(nèi)的70％融合的HL-5細(xì)胞中。孵育6個(gè)小時(shí)后，用新鮮的Ex-Cell 320培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，30小時(shí)后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞并測(cè)定螢火蟲(chóng)及Renilla螢光素酶活性。根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)(Promega)進(jìn)行二次螢光素酶活性測(cè)定。簡(jiǎn)要的，通過(guò)用250μl新稀釋的被動(dòng)裂解緩沖液(Promega)裂解轉(zhuǎn)染細(xì)胞制成細(xì)胞提取物。在13,000rpm離心5分鐘去除細(xì)胞碎片之前將裂解物凍融1次。將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，用二次螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)體系測(cè)定20μl上清液。用微量板發(fā)光計(jì)數(shù)器LB96 V(EG&Berthold)監(jiān)測(cè)標(biāo)本的熒光強(qiáng)度，它測(cè)定了10秒間期內(nèi)的光產(chǎn)物(相對(duì)發(fā)光值)。每種細(xì)胞提取物重復(fù)測(cè)定三次。每種構(gòu)建體的每個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)重復(fù)三次。將螢火蟲(chóng)螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為Renilla螢光素酶活性。
如圖4B所示，人Corin報(bào)告基因構(gòu)建體hCP1297LUC和hCP405LUC所啟動(dòng)的螢光素酶活性要顯著地高于pGL-3基礎(chǔ)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的背景活性。同樣，小鼠報(bào)告基因構(gòu)建體mCp1183LUC、mCp809LUC和mCp646LUC產(chǎn)生了比得上人構(gòu)建體所啟動(dòng)的顯著的熒光素活性。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明負(fù)責(zé)大多數(shù)啟動(dòng)子活性的順式作用序列相應(yīng)地定位于人和小鼠Corin基因的-405到-15核苷酸或-646到-77核苷酸之間。
實(shí)施例3心臟特異性表達(dá)的驗(yàn)證為了驗(yàn)證這些構(gòu)建體是否介導(dǎo)心臟特異性表達(dá)，用所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染不表達(dá)Corin mRNA和蛋白的HeLa細(xì)胞(ATCC，No.CCL2)。與hCp405LUC和mCp646LUC構(gòu)建體在HL-5細(xì)胞中的高活性相反，它們?cè)贖eLa細(xì)胞中只有很小的啟動(dòng)子活性(圖5)。作為對(duì)照，同步轉(zhuǎn)染的pRL-SV40在HeLa中比在HL-5細(xì)胞中啟動(dòng)了更高水平的Renilla螢光素酶活性，說(shuō)明在這些試驗(yàn)中HeLa細(xì)胞和HL-5細(xì)胞一樣容易被轉(zhuǎn)染。這些結(jié)構(gòu)說(shuō)明從-405到-15的人Corin基因的5’側(cè)翼序列或從-646到-77的小鼠Corin基因的5’側(cè)翼序列含有足以在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)的元件。
實(shí)施例4與GATA-4結(jié)合的近端GATA元件對(duì)于Corin啟動(dòng)子的最佳功能是必需的從人-405到-15核苷酸或從小鼠-646到-77核苷酸的5’側(cè)翼區(qū)能啟動(dòng)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞而不是HeLa細(xì)胞內(nèi)的高水平的基因表達(dá)。這說(shuō)明這些區(qū)域含有負(fù)責(zé)進(jìn)行心肌特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。對(duì)這些區(qū)域的觀察發(fā)現(xiàn)了保守的GATA共有序列(稱為近端GATA序列)。
為了確定近端GATA序列是否真的結(jié)合于GATA蛋白，我們?nèi)缜八龅膹闹笖?shù)生長(zhǎng)的HL-5細(xì)胞中制備出核提取物(Schreiber E.et al.，(1989)Nucleic Acids Res.176419)，并用已經(jīng)被描述過(guò)的共有GATA寡核苷酸探針(Redondo，J.M.et al.(1990)Science 247(4947)，1225-9)以及含有每種近端GATA序列(圖6A)的探針進(jìn)行電泳遷移率改變分析(EMSA)。含有兩個(gè)共有GATA序列或突變的GATA序列(從GATA到CTTA)的雙鏈寡核苷酸探針購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。合成并HPLC純化含有人或小鼠Corin GATA(相應(yīng)地為SEQ ID NO11和13)、或突變的人和小鼠Corin GATA(從GATA到CTTA)(相應(yīng)地為SEQ ID NO12和14)的探針序列。利用[γ-32P]ATP(3000Ci/mmol，Amersham Pharmacia Biotech)，以T4多核苷酸激酶(Life Techologies)進(jìn)行寡核苷酸的5’末端標(biāo)記。如前所述的進(jìn)行膠遷移率改變分析(Pan，J.& McEver R.P.(1993)J.Biol.Chem.26822600-22608)。與設(shè)想的一樣，當(dāng)標(biāo)記的共有GATA探針(SEQ ID NO15)與HL-5細(xì)胞的核提取物一起孵育時(shí)，它形成了序列特異性的DNA-蛋白復(fù)合物(圖6B)。加入100倍過(guò)量的未標(biāo)記探針阻止了該復(fù)合物的形成，而無(wú)關(guān)的GAS元件沒(méi)有阻斷這種形成。復(fù)合物的形成依賴于完整的GATA序列，因?yàn)镚ATA序列的突變中斷了復(fù)合物的形成。而且，在存在100倍過(guò)量的含有人或小鼠近端GATA序列的標(biāo)記探針時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到復(fù)合物。相反的，100倍過(guò)量的含有突變的近端GATA序列(SEQ ID NO12和14)的標(biāo)記探針對(duì)復(fù)合物形成只有很小的影響。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明Corin近端GATA序列以及共有的GATA探針與常見(jiàn)的GATA蛋白結(jié)合。
為了確定復(fù)合物涉及哪種GATA蛋白，我們?cè)诖嬖诳笹ATA家族成員的抗體時(shí)，用標(biāo)記的共有GATA探針進(jìn)行EMSA?？剐∈驡ATA-1(SC-1234x)、GATA-3(SC-268x)、GATA-4(SC-12237x)和GATA-6(SC-7244x)抗體都來(lái)自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。如圖6C所示，抗GATA-4抗體顯著地抑制了復(fù)合物的形成，而抗GATA-1、-3和-6抗體幾乎沒(méi)有這種作用。為了直接確認(rèn)GATA-4與近端GATA序列的結(jié)合，我們?cè)诓淮嬖诨虼嬖谙嗤目笹ATA-4抗體時(shí)使用標(biāo)記的人近端GATA探針。如圖6D所示，抗GATA-4抗體完全抑制了與用共有GATA探針形成的復(fù)合物相同遷移率的DNA-蛋白復(fù)合物的形成。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明GATA-4與近端GATA序列結(jié)合，提示GATA-4與近端GATA序列的結(jié)合可能造成Corin在心肌細(xì)胞中的基因表達(dá)。
為了驗(yàn)證近端GATA元件是否是啟動(dòng)子活性所必需的，我們將啟動(dòng)最高啟動(dòng)子活性的人或小鼠構(gòu)建體中的野生型序列AGATAA突變成ACTTAA(圖7)。用重疊PCR方法(Ho S.N.et al.，(1989)Gene(Amst)7751-59)構(gòu)建突變構(gòu)建缽hCp405mutGATA和mCp646mutGATA。簡(jiǎn)要的，用一個(gè)反義或有義突變的GATA寡核苷酸和一個(gè)外引物(outside primer)生成兩個(gè)單獨(dú)的PCR產(chǎn)物，每一個(gè)產(chǎn)物是雜交產(chǎn)物的一半。純化兩種產(chǎn)物并混和。然后用兩種外引物進(jìn)行第二次PCR。用Sac I和Hind III消化PCR產(chǎn)物并連接到用Sac I和Hind III消化的pGL3-基礎(chǔ)載體上。用限制性酶切圖和DNA測(cè)序確認(rèn)所有的構(gòu)建體。GATA元件的突變與在EMSA中所用的突變GATA探針中的突變一樣。當(dāng)突變構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)HL-5細(xì)胞時(shí)，與它們的相應(yīng)的野生型序列比較，人和小鼠突變構(gòu)建體具有10％或42％啟動(dòng)子活性。這些結(jié)果說(shuō)明近端GATA元件對(duì)于培養(yǎng)的心肌細(xì)胞內(nèi)的人或小鼠Corin基因的組成型表達(dá)是必需的。
通過(guò)替換在前述的實(shí)施例中所使用的一般或具體描述的本發(fā)明的試劑和/或操作條件可以重復(fù)出同樣成功的上述實(shí)施例。
雖然本發(fā)明被描述為關(guān)于人或小鼠Corin基因的新的表達(dá)控制區(qū)，顯而易見(jiàn)的是，只要不脫離發(fā)明的精神或范圍就可以對(duì)發(fā)明進(jìn)行變化和修改。
序列表<110>舍林股份公司<120>人Corin基因的控制序列<130>52351AWOM1<150>US 60/384,108<151>2002-05-31<160>16<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1888<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(922)..(922)<223>n is a，c，g，or t<400>1aaagaagatg aaatagaaac ttgtacttgg cctcagaatg cctgtagaaa ccttagcaat 60tgaatccagc ccttatgtta taggctgagt taactgtggc ccagaaagac tatgtgattt 120gctcacagtt cttgattccc agactggcac tgcggtgatg gtgtgtgatg aggtagtatc 180ttagtaagaa cacaatccag aagtcactgc ctcgggggaa tcccagctca gcttcttgct 240agcttgcgta ggctggttac ttcacttcag ctccctgaat ctgctttctt atctctaaaa 300taaaaataat agcttcttcc tcagagtagt tggtggaact gaaagaatac atgtaaagtg 360cttagtatga cacctgccac ataatatgaa ctgaattatt gtgaattatg ataaatttgt 420cagatactgg tttacaaatc ggatgttaga ataacatgga atcagtgttt cagtcatttt 480actatacata tgcaatattt tctacatttg atctcacttc agaaacaaaa tactgccccc 540cccattttac aaatgcatat ttttttctca gcaataatgt tcaagaacaa gtgcttggcc 600catattttgt tgtctttaca tggctttctt taaataatgg ggatggattt attaaataac 660ctcatgagta attttcaaaa tttccattaa gatcttgatt gaaattggat gaaaaatcat 720ttctaagaaa aacccaatga agtgtttttc tttgccacat ttgacaattg ccttggactt 780ggtaaagtaa tcattactgt gttgagtacc tccagtgccc tccttgacgc tgccttagaa 840aaggtagctg cttttgaatg acaggcagga atttgttcgc cttttaggtt cagcctgtag 900gtgccctctg caggaaatca gnaactaggg ttttggaagc agtcagggtg gggttctccc 960ttgtccctgc agcctcagca aagactcagg cagtctggca aaagcagttt cttcagcata1020cctaacagaa cgcaagtttc catatgcctg atgcaaataa tggcctccaa acgttaaacc1080ttttttgaga taaacttgtt ctttaattgc cagcgcctgc agttaatttt gattggctac1140
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<221>misc_feature<222>(3363)..(3363)<223>n is a，c，g，or t<400>2aagcttcatg agggcaggag tgcagttttg tttattactg taacctcaga gtagagaagc 60ctggccacat agtagatgct agtattcgtt tcctagggct gctgtaacag ataccataca120tcagttactt aaaacaacag aaatttattc tttcacagtt taggtggcca gaagtcccaa180accaagatat aacaaattat atctgcaaag cctttatttc cacagaacca cattctgagg240ttctgggtgg acattaattt ggcagggagt agtgggggga cactaaccta ctacagtgct300cagtaaatat ttattgggtg aatgaaaatt cagagtgtat tctaagctgt aaaccccttg360gatgttttca tcacagtctt ctcttaataa ctgctacaga acataaggat tagtttgtgg420tcccagattt tttaggctcc aattctgctt ctaccacttt ctacttgtga gctcttaggc480acgctattta actttgtaag cctcagtttc ttctgtaaaa tggtgacaat aagaaataac540agtaagtgcc caataagttt taactattat tatgtgtcta tagctatttt aaagcacttt600ctatatgtaa tcctcataac aaccgtatta ggtgagccta ttacacttct cattttatga660caaaggaaac tagatttgtt tcaagaatga aaaacctaga aaattatatg tcactttatg720aagtgcctgg cacatagtac atagaatagc ttagctacaa taatatagat atgtgacttt780
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<221>misc_feature<222>(623)..(623)<223>n is a，c，g，or t<400>5ataaaaataa tagcttcttc ctcagagtag ttggtggaac tgaaagaata catgtaaagt 60gcttagtatg acacctgcca cataatatga actgaattat tgtgaattat gataaatttg 120tcagatactg gtttacaaat cggatgttag aataacatgg aatcagtgtt tcagtcattt 180tactatacat atgcaatatt ttctacattt gatctcactt cagaaacaaa atactgcccc 240ccccatttta caaatgcata tttttttctc agcaataatg ttcaagaaca agtgcttggc 300ccatattttg ttgtctttac atggctttct ttaaataatg gggatggatt tattaaataa 360cctcatgagt aattttcaaa atttccatta agatcttgat tgaaattgga tgaaaaatca 420tttctaagaa aaacccaatg aagtgttttt ctttgccaca tttgacaatt gccttggact 480tggtaaagta atcattactg tgttgagtac ctccagtgcc ctccttgacg ctgccttaga 540aaaggtagct gcttttgaat gacaggcagg aatttgttcg ccttttaggt tcagcctgta 600ggtgccctct gcaggaaatc agnaactagg gttttggaag cagtcagggt ggggttctcc 660cttgtccctg cagcctcagc aaagactcag gcagtctggc aaaagcagtt tcttcagcat 720acctaacaga acgcaagttt ccatatgcct gatgcaaata atggcctcca aacgttaaac 780cttttttgag ataaacttgt tctttaattg ccagcgcctg cagttaattt tgattggcta 840cactctggtt aaaagaaaat gctttcgatg tgatatggca aatttggaga aaagtaactc 900ttttgctccc aaccagtctt ccacaactta aacttaatcg tcctgtcctt tttctgctgc 960cctcgtggag tgtaagtttt tgagggagac cagcagaaac tgactttcca tatgcccctg1020aagaataact tctttgaatg caaagaggtg gggacacgga ggatctgtca ttacgggtta1080ttatgggtgg gacccagaga cgggagtgaa gggagggtgt ggcccgcggg tgggatctgt1140agagcagaca aaatatgggg cccctggcgc ttaaagttca gtttgtctct cttgagcttg1200gagaaaatca tccgtagtgc ctccccgggg gacacgtaga ggagagaaaa gcgaccaaga1260taaaagtgga cagaagaata agc1283
<210>6<211>4023<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<222>(3363)..(3363)<223>n is a，c，g，or t<400>6aagcttcatg agggcaggag tgcagttttg tttattactg taacctcaga gtagagaagc 60ctggccacat agtagatgct agtattcgtt tcctagggct gctgtaacag ataccataca 120tgagttactt aaaacaacag aaatttattc tttcacagtt taggtggcca gaagtcccaa 180accaagatat aacaaattat atctgcaaag cctttatttc cacagaacca cattctgagg 240ttctgggtgg acattaattt ggcagggagt agtgggggga cactaaccta ctacagtgct 300cagtaaatat ttattgggtg aatgaaaatt cagagtgtat tctaagctgt aaaccccttg 360gatgttttca tcacagtctt ctcttaataa ctgctacaga acataaggat tagtttgtgg 420tcccagattt tttaggctcc aattctgctt ctaccacttt ctacttgtga gctcttaggc 480aagctattta actttgtaag cctcagtttc ttctgtaaaa tggtgacaat aagaaataac 540agtaagtgcc caataagttt taactattat tatgtgtcta tagctatttt aaagcacttt 600ctatatgtaa tcctcataac aaccgtatta ggtgagccta ttacacttct cattttatga 660caaaggaaac tagatttgtt tcaagaatga aaaacctaga aaattatatg tcactttatg 720aagtgcctgg cacatagtac atagaatagc ttagctacaa taatatagat atgtgacttt 780acctcataac tttaagacat ctcaaattga ttcacaaatc agaaaaaaaa tctgaggcat 840cagatgtgag gtgaggtgag gtgaggcatc tcagtttttg cacatatggt tactgttatt 900gagggagctc catgtcattg agggagctcc acgtcattga gggaggactg ggtgggatgc 960tggccaaagg taggggcata tttaggcagt gaaattgcag ttatgggacc cctctatagc1020actagatgtg tgagaggact aaaaataaaa ttcctttgaa atttcttaca gggtcatata1080ttacctcctt cccaatgact actgtggtat attagagtag gggattgatg tcccagaaat1140attatgtaca tcaaacagaa gatctacaca aattgtttta tcagatactg aatatatcaa1200tgggctagag tgtattatag tacatatggg tatgttgttt tccccctttt gactaaataa1260actctcccct ctctgcaaca ggtaaatttc cagtttacct ttttcttgct gtttttaatt1320ttttttattt tgaaggcttt gtatctttat atctcagctg aaaatattac attctaactc1380cccaaagcta ttctcacatt atttgcaagt attttttcat agtttacatg tttgtgtatt1440tgtttaatac attccacaag actgaaagtc ttggtgaggg caggaactct gtctaggttg1500ttcatctggc agccagcaaa cccaaaataa gtattagttg aatgaatagc taaatagatg1560
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<223>primer
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<211>27<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>probe<400>16cacttcttaa cagaaagtct taactct2權(quán)利要求
1.一種包含哺乳動(dòng)物的Corin表達(dá)控制區(qū)的分離的多核苷酸，其中所述控制區(qū)調(diào)控與其可操縱地連接的異源性多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述控制區(qū)調(diào)控哺乳動(dòng)物Corin基因的轉(zhuǎn)錄。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中轉(zhuǎn)錄發(fā)生于心臟組織。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述控制區(qū)包含選自GATA結(jié)合位點(diǎn)、Tbx-5結(jié)合位點(diǎn)、NKx2.5結(jié)合位點(diǎn)和NF-AT結(jié)合位點(diǎn)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述控制區(qū)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，其中所述蛋白選自GATA-4、Tbx-5、NKx2.5、Krüppel樣因子和NF-AT轉(zhuǎn)錄因子。
6.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中哺乳動(dòng)物是人。
7.權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO4所示的序列。
8.權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO5所示的序列。
9.權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO6所示的序列。
10.一種權(quán)利要求1的多核苷酸的片段或變體，其中所述片段或變體能轉(zhuǎn)錄與其可操縱地連接的異源性多核苷酸。
11.權(quán)利要求10的片段或變體，其中所述片段或變體具有的序列與SEQ ID NO4具有至少70％的相同性。
12.權(quán)利要求10的片段或變體，其中所述片段或變體具有的序列與SEQ ID NO5具有至少70％的相同性。
13.權(quán)利要求10的片段或變體，其中所述片段或變體具有的序列與SEQ ID NO6具有至少70％的相同性。
14.一種包含權(quán)利要求1的Corin表達(dá)控制區(qū)的載體。
15.一種包含權(quán)利要求14的載體的宿主細(xì)胞。
16.一種生產(chǎn)多肽的方法，其包含自權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞中表達(dá)由可操縱地連接于Corin表達(dá)控制區(qū)的異源性多核苷酸所編碼的多肽。
17.一種生產(chǎn)多核苷酸的方法，其包含自權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞中表達(dá)由可操縱地連接于Corin表達(dá)控制區(qū)的異源性多核苷酸所編碼的反義分子。
18.一種藥物組合物，其包含存在于可藥用載體中的權(quán)利要求14的載體。
19.一種藥物組合物，其包含存在于可藥用載體中的權(quán)利要求15的細(xì)胞。
20.一種鑒定調(diào)控細(xì)胞內(nèi)人Corin基因的表達(dá)的物質(zhì)的方法，其中所述方法包括(a)產(chǎn)生一種重組載體，其中一種包含哺乳動(dòng)物Corin表達(dá)控制區(qū)的分離的多核苷酸可操縱地連接于一種報(bào)告基因；(b)用所述重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(c)用物質(zhì)處理所述細(xì)胞；(d)測(cè)定所處理的細(xì)胞中的報(bào)告基因序列的表達(dá)水平；以及(e)比較在存在所述物質(zhì)情況下所述報(bào)告基因序列的表達(dá)水平與未被處理的轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)水平。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)胞是心臟的肌細(xì)胞。
22.一種用于調(diào)控人類對(duì)象的基因表達(dá)的方法，所述方法包括(a)產(chǎn)生一種重組載體，其中一種包含哺乳動(dòng)物Corin表達(dá)控制區(qū)的分離的多核苷酸可操縱地連接于一種異源性多核苷酸；(b)將治療有效量的所述載體施用于所述對(duì)象。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述異源性多核苷酸編碼一種治療性蛋白質(zhì)，例如Corin、ANP、B型利鈉肽、受磷蛋白、ACE、或這些基因的負(fù)顯性形式。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述異源性多核苷酸編碼Corin。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述異源性多核苷酸編碼一種治療性多核苷酸，例如反義RNA分子或催化性RNA分子。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述控制區(qū)選自SEQ ID NO4、SEQID NO5、和SEQ ID NO6。
27.一種用于治療人類對(duì)象的充血性心衰、高血壓或心肌梗死的方法，所述方法包括給所述對(duì)象施用治療有效量的一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含與選自Corin、ANP、B型利鈉肽、受磷蛋白、ACE、和這些基因的負(fù)顯性形式的一種基因可操縱地連接的哺乳動(dòng)物Corin表達(dá)控制區(qū)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述基因是Corin。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從哺乳動(dòng)物Corin基因分離得到的新的表達(dá)控制區(qū)。該控制區(qū)優(yōu)選地在心臟細(xì)胞內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明也提供了采用該控制區(qū)來(lái)鑒定能夠調(diào)控Corin表達(dá)的物質(zhì)以及治療心臟病的方法及組合物。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1671729SQ03818169
公開(kāi)日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2003年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日
發(fā)明者潘峻亮, 吳慶宇 申請(qǐng)人:舍林股份公司