本發(fā)明屬于分子印跡聚合物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原花青素是由兒茶素、表兒茶素及其沒食子酸酯通過C₄-C₆或C₄-C₈共價相聯(lián)組成的聚合體，它能清除人體內(nèi)過剩自由基，提高人體免疫力，可作為防癌、抗突變、防治心血管疾病藥物的主要有效成分和用作安全無毒的新型抗氧化劑。原花青素B₂是由兩個表兒茶素聚合而成的二聚體(分子結(jié)構(gòu)式見圖1)，有研究表明，它是原花青素中抗氧化活性最強(qiáng)的單體，可作為衡量原花青素質(zhì)量的標(biāo)志性成分。由于原花青素B₂在聚合體中含量較低，而且與其它聚合體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相近，這對其分離造成了極大的困難。因此，目前國內(nèi)外關(guān)于原花青素B₂單體等相關(guān)成熟的制備分離工藝還極少。

分子印跡聚合物是將功能單體在模板分子存在條件下進(jìn)行交聯(lián)聚合，然后洗脫除去模板分子制得的聚合物,它在空間結(jié)構(gòu)和功能基排布上具有與目標(biāo)分子互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的空穴,對模板分子具有“記憶”功能，從而對目標(biāo)分子具有可預(yù)定的選擇性。由于分子印跡聚合物具有選擇性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、對環(huán)境的耐受性好、制備簡單等優(yōu)點(diǎn)，目前已被應(yīng)用于中藥活性成分分離、固相萃取、仿生傳感器、模擬酶催化等領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種能夠快速、高效的分離純化原花青素B₂的金屬配位分子印跡聚合物。

本發(fā)明的目的之二是提供了所述原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物的制備方法。

本發(fā)明的目的之三是提供了所述原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物，包括模板分子、金屬化合物、四氫呋喃/甲醇、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑；按摩爾比計算，模板分子和金屬化合物的摩爾比為1:1～1:3，模板分子與功能單體的摩爾比為1:3～1:8，功能單體與交聯(lián)劑的摩爾比為1:4～1:6，引發(fā)劑與功能單體的摩爾比為1:50～1:20；按摩爾體積比計算，模板分子與四氫呋喃/甲醇的比例為1:10～1:15(mmol/ml)。

較佳地，所述的金屬化合物為氯化銅、醋酸鋅或硝酸鋁。

較佳地，所述的功能單體為α-甲基丙烯酸、對乙烯基苯甲酸或2-乙烯基吡啶。

較佳地，所述的交聯(lián)劑為二乙烯基苯(DVB)、季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)或乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)。

較佳地，所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)、偶氮二異丁酸二甲酯(AIBME)或偶氮二環(huán)己基甲腈(ACCN)。

制備所述原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物的方法，具體為：

(1)、將模板分子原花青素B₂和金屬化合物加入到所述量的四氫呋喃/甲醇溶液中，超聲震蕩1～1.5h，使金屬離子和原花青素B₂充分配位；

(2)、向步驟(1)溶液中加入所述量的功能單體，超聲震蕩1～1.5h，使功能單體、金屬離子和原花青素B₂充分反應(yīng)；

(3)、向步驟(2)溶液中加入所述量的引發(fā)劑和交聯(lián)劑，超聲震蕩15～20min，充氮10min后真空密封，50～60℃恒溫水浴熱引發(fā)聚合24h，得到聚合物；

(4)、聚合物烘干后研磨粉碎過200目篩，于甲醇溶液中反復(fù)清洗去除過細(xì)顆粒。將得到的聚合物在索氏提取器中用乙酸/甲醇的溶液抽提、洗脫模板分子原花青素B₂，直至回流液中用高效液相色譜在280nm處檢測不到為止；然后EDTA溶液洗滌除去殘留在聚合物中的金屬離子，最后用水和甲醇重復(fù)洗滌pH至中性，放入真空干燥箱中干燥，得到原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物。

較佳地，所述四氫呋喃/甲醇的體積比為1:4。

較佳地，所述乙酸/甲醇的體積比為8:2～9:1。

較佳地，所述EDTA溶液濃度為1～4mmol/L。

所述原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物的使用方法：把制得的原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物裝入固相萃取柱，加入甲醇溶液淋濕固相萃取柱后，將原花青素提取液上樣(茶籽殼、葡萄籽等原料中提取)，吸附完畢后采用乙酸/甲醇(體積比為8:2～9:1)的溶液洗脫，經(jīng)濃縮、干燥后得到高純度的原花青素B₂產(chǎn)品。

本發(fā)明的有益效果：

(1)、目前，原花青素B₂的研究主要局限于含量測定和痕量分析，制備工藝主要通過大孔樹脂吸附、凝膠柱層析、制備型高效液相色譜等多種分離和分析手段，存在步驟繁瑣、成本高昂、產(chǎn)品雜質(zhì)多等缺點(diǎn)，采用本發(fā)明能夠單一的選擇性分離原花青素B₂，具有操作簡單、成本低廉、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。

(2)、采用本發(fā)明方法制備的原花青素B₂聚合物具有很高的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，可以重復(fù)使用，產(chǎn)業(yè)化前景廣闊。用掃描電鏡分別觀察原花青素B₂洗脫前后聚合物的表面形態(tài)，發(fā)現(xiàn)洗脫前后印跡聚合物表面的結(jié)構(gòu)有顯著不同：原花青素B₂被洗脫前聚合物表面相對均勻、平滑；原花青素B₂被洗脫后印跡聚合物表面多孔、凹凸不平，表明聚合物具有較多空穴和活性結(jié)合位點(diǎn)(見圖4、圖5)。

(3)、目前，大部分分子印跡聚合物的制備過程是在弱極性溶劑中進(jìn)行。從結(jié)構(gòu)上分析,原花青素B₂含有多個羥基,其極性較大而不易溶于非極性或弱極性溶劑。而引入金屬離子，利用金屬離子的配位作用，可以制備出具有較高選擇識別能力的配位分子印跡聚合物，適合在強(qiáng)極性溶液中分離純化原花青素B₂，從而擴(kuò)大分子印跡技術(shù)的應(yīng)用范圍。

附圖說明

圖1原花青素B₂的分子結(jié)構(gòu)式。

圖2原花青素B₂標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。

圖3原花青素B₂產(chǎn)品的HPLC圖譜。

圖4原花青素B₂洗脫前分子印跡聚合物的掃描電鏡圖片。

圖5原花青素B₂洗脫后分子印跡聚合物的掃描電鏡圖片。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以助于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明。

實(shí)施例1：

一種原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物的制備方法及其應(yīng)用：

(1)、將1mmol模板分子原花青素B₂和1mmol氯化銅加入到10ml的四氫呋喃/甲醇(體積比1:4)溶液中，超聲震蕩1h，使金屬離子和原花青素B₂充分配位。

(2)、向步驟(1)溶液中加入3mmol的α-甲基丙烯酸，超聲震蕩1h，使α-甲基丙烯酸、銅離子和原花青素B₂充分反應(yīng)。

(3)、向步驟(2)溶液中加入12mmol的交聯(lián)劑二乙烯基苯(DVB)和0.1mmol偶氮二異丁腈(AIBN)引發(fā)劑，超聲震蕩15min，充氮10min后真空密封，50℃恒溫水浴熱引發(fā)聚合24h，得到聚合物。

(4)、聚合物烘干后研磨粉碎過200目篩，于甲醇溶液中反復(fù)清洗除去過細(xì)顆粒。將得到的聚合物在索氏提取器中用乙酸/甲醇(體積比為8:2)的溶液抽提、洗脫模板分子原花青素B₂，直至回流液中用高效液相色譜在280nm處檢測不到為止；然后用1mmol/L EDTA溶液洗滌除去殘留在聚合物中的金屬離子，最后用水和甲醇重復(fù)洗滌pH至中性，放入真空干燥箱中干燥，得到原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物。

(5)、將制得的原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物裝入固相萃取柱，加入甲醇溶液淋濕固相萃取柱后，并將原花青素提取液上樣(茶籽殼、葡萄籽等原料中提取)，吸附完畢后采用乙酸/甲醇(體積比為8:2)的溶液洗脫，經(jīng)濃縮、干燥后得到原花青素B₂產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測純度為95.2％。

實(shí)施例2：

一種原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物的制備方法及其應(yīng)用：

(1)、將1mmol模板分子原花青素B₂和2mmol醋酸鋅加入到15ml的四氫呋喃/甲醇(體積比1:4)溶液中，超聲震蕩1.5h，使金屬離子和原花青素B₂充分配位。

(2)、向步驟(1)溶液中加入5mmol的對乙烯基苯甲酸，超聲震蕩1.5h，使對乙烯基苯甲酸、鋅離子和原花青素B₂充分反應(yīng)。

(3)、向步驟(2)溶液中加入25mmol的交聯(lián)劑季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)和0.2mmol偶氮二異丁酸二甲酯(AIBME)引發(fā)劑，超聲震蕩20min后真空密封，55℃恒溫水浴熱引發(fā)聚合24h，得到聚合物。

(4)、聚合物烘干后研磨粉碎過200目篩，于甲醇溶液中反復(fù)清洗去除過細(xì)顆粒。將得到的聚合物在索氏提取器中用乙酸/甲醇(體積比為9:1)的溶液抽提、洗脫模板分子原花青素B₂，直至回流液中用高效液相色譜在280nm處檢測不到為止；然后用2mmol/L EDTA溶液洗滌除去殘留在聚合物中的金屬離子，最后用水和甲醇重復(fù)洗滌pH至中性，放入真空干燥箱中干燥，得到原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物。

(5)、將制得的原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物裝入固相萃取柱，加入甲醇溶液淋濕固相萃取柱后，并將原花青素提取液上樣(茶籽殼、葡萄籽等原料中提取)，吸附完畢后采用乙酸/甲醇(體積比為9:1)的溶液洗脫，經(jīng)濃縮、干燥后得到原花青素B₂產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測純度為96.1％。

實(shí)施例3：

一種原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物的制備方法及其應(yīng)用：

(1)、將1mmol模板分子原花青素B₂和3mmol硝酸鋁加入到15ml的四氫呋喃/甲醇(體積比1:4)溶液中，超聲震蕩2h，使金屬離子和原花青素B₂充分配位。

(2)、向步驟(1)溶液中加入8mmol的2-乙烯基吡啶，超聲震蕩2h，使2-乙烯基吡啶、鋁離子和原花青素B₂充分反應(yīng)。

(3)、向步驟(2)溶液中加入40mmol的交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和0.3mmol偶氮二環(huán)己基甲腈(ACCN)引發(fā)劑，超聲震蕩20min，充氮10min后真空密封，60℃恒溫水浴熱引發(fā)聚合24h，得到聚合物。

(4)、聚合物烘干后研磨粉碎過200目篩，于甲醇溶液中反復(fù)清洗除去過細(xì)顆粒。將得到的聚合物在索氏提取器中用乙酸/甲醇(體積比為9:1)的溶液抽提、洗脫模板分子原花青素B₂，直至回流液中用高效液相色譜在280nm處檢測不到為止；然后用4mmol/L EDTA溶液洗滌除去殘留在聚合物中的金屬離子，最后用水和甲醇重復(fù)洗滌pH至中性，放入真空干燥箱中干燥，得到原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物。

(5)、將制得的原花青素B₂金屬配位分子印跡聚合物裝入固相萃取柱，加入甲醇溶液淋濕固相萃取柱后，并將原花青素提取液上樣(茶籽殼、葡萄籽等原料中提取)，吸附完畢后采用乙酸/甲醇(體積比為9:1)的溶液洗脫，經(jīng)濃縮、干燥后得到原花青素B₂產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測純度為95.8％。

上述實(shí)施例，只是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用來限制本發(fā)明實(shí)施范圍，故凡以本發(fā)明權(quán)利要求所述的特征及原理所做的等效變化或修飾，均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求范圍之內(nèi)。