本發(fā)明涉及生物技術領域中油體相關蛋白在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用。

背景技術：

水稻不僅是重要的模式植物，也是當今世界種植面積最廣的糧食作物之一。極端的外部環(huán)境已成為限制水稻種植和產(chǎn)量的一個重要因素。其中，高溫、干旱等嚴重影響水稻適應性和生產(chǎn)。植物蠟質(zhì)作為覆蓋在植物地上部分表面的一層疏水屏障，與外部環(huán)境關系密切，具有保水、抗輻射、抗病蟲害等功能。因此，深入研究調(diào)控水稻葉片蠟質(zhì)含量，對水稻生產(chǎn)具有重要意義。

蠟質(zhì)的主要成分是長鏈脂肪酸及其衍生物。長鏈脂肪酸起源于質(zhì)體上合成的c16和c18脂肪酸，這些脂肪酸酯化為?；o酶a后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上通過脂肪酸延伸酶復合體延長，然后通過初級醇途徑和烷烴途徑形成蠟質(zhì)混合物。因此,蠟質(zhì)代謝與脂肪酸是密不可分的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是如何調(diào)控植物葉片中的蠟質(zhì)含量。

為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了油體相關蛋白在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用。

本發(fā)明所提供的油體相關蛋白在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用中，所述油體相關蛋白名稱是oshsd1，為下述a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列為序列1所示的蛋白質(zhì)；

a2)在序列1的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有相同功能的由a1)衍生的蛋白質(zhì)；

a3)在a1)或a2)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)。

其中，序列1由354個氨基酸組成。

為了使a1)、a2)和a3)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在a1)、a2)或a3)的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。

表1、標簽的序列

上述a2)中的oshsd1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述a2)中的oshsd1的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了與oshsd1相關的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用。

本發(fā)明所提供的與oshsd1相關的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用中，所述生物材料，為下述b1)至b20)中的任一種：

b1)編碼oshsd1的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表達盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重組載體；

b4)含有b2)所述表達盒的重組載體；

b5)含有b1)所述核酸分子的重組微生物；

b6)含有b2)所述表達盒的重組微生物；

b7)含有b3)所述重組載體的重組微生物；

b8)含有b4)所述重組載體的重組微生物；

b9)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

b10)含有b2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

b11)含有b3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

b12)含有b4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

b13)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；

b14)含有b2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；

b15)含有b3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；

b16)含有b4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；

b17)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；

b18)含有b2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；

b19)含有b3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；

b20)含有b4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。

上述與oshsd1相關的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用中，b1)所述核酸分子為如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)所示的基因：

a1)核苷酸序列是序列表中序列2的cdna分子或dna分子；

a2)核苷酸序列是序列表中序列3的基因組dna；

a3)核苷酸序列是序列表中序列3的第3442-10284位的基因組dna；

a4)與a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼oshsd1的cdna分子或基因組dna分子；

a5)在嚴格條件下與a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼oshsd1的cdna分子或基因組dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

序列2由1065個核苷酸組成，編碼序列1所示的蛋白質(zhì)。序列3由11417個核苷酸組成，序列3中，序列3的第3442-3639位、第6939-7131位、第8110-8195位、第8720-8851位、第9527-9691位和第9994-10284位分別為oshsd1基因的六個外顯子的序列，序列3中oshsd1基因的六個外顯子的序列依次連接得到序列2；序列3的第1-3204位為啟動子的序列。

本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼oshsd1的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的oshsd1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼oshsd1且具有oshsd1功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼oshsd1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。

上述與oshsd1相關的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用中，所述嚴格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述與oshsd1相關的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用中，b2)所述的含有編碼oshsd1的核酸分子的表達盒(oshsd1基因表達盒)，是指能夠在宿主細胞中表達oshsd1的dna，該dna不但可包括啟動oshsd1基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止oshsd1 基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。可用于本發(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動子，和誘導型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35s：來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導型啟動子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120：979-992)；來自煙草的化學誘導型啟動子，發(fā)病機理相關1(pr1)(由水楊酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羥酸s-甲酯)誘導)；西紅柿蛋白酶抑制劑ii啟動子(pin2)或lap啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導)；熱休克啟動子(美國專利5，187，267)；四環(huán)素誘導型啟動子(美國專利5，057,422)；種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pf128(cn101063139b(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動子(beachy等人(1985)emboj.4：3047-3053))。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(nos終止子)、花椰菜花葉病毒camv35s終止子、tml終止子、豌豆rbcse9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：odell等人(i⁹⁸⁵)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。

可用現(xiàn)有的表達載體構建含有所述oshsd1基因表達盒的重組載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標記基因(如 賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptii基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化學試劑標記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

上述與oshsd1相關的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。

上述與oshsd1相關的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。所述農(nóng)桿菌可為農(nóng)桿菌eha105。

上述與oshsd1相關的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應用中，所述轉(zhuǎn)基因植物細胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。

在本發(fā)明的一個實施方式中，oshsd1的編碼基因通過含有oshsd1的編碼基因的表達盒的重組載體導入根癌農(nóng)桿菌eha105中。所述重組載體為將pcambia2300的bamhi和xhoi識別序列間的dna替換為序列3所示的dna分子得到的重組載體pcambia2300-oshsd1。pcambia2300-oshsd1表達序列1所示的油體相關蛋白(即oshsd1)。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了oshsd1或所述生物材料在培育蠟質(zhì)含量降低植物或制備降低植物蠟質(zhì)含量產(chǎn)品中的應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了培育蠟質(zhì)含量降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括向受體植物中導入下述1)或2)得到轉(zhuǎn)基因植物；

1)oshsd1的編碼基因；

2)含有oshsd1的編碼基因的表達盒；

所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比蠟質(zhì)含量降低。

上述方法中，所述oshsd1的編碼基因可為b1)所述核酸分子；

所述表達盒可為b2)所述表達盒。

在本發(fā)明的實施例中，所述oshsd1的編碼基因通過含有所述oshsd1的編碼基因表達盒的oshsd1基因重組表達載體導入受體植物中。

上述方法中，其中所述oshsd1的編碼基因可先進行如下修飾，再導入受體植物中，以達到更好的表達效果：

1)根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述oshsd1的編碼基因的氨基酸序列的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的gc含量，以最好地實現(xiàn)植物中導入基因的高水平表達，其中gc含量可為35％、 多于45％、多于50％或多于約60％；

2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進行修飾；

3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括組成型、誘導型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；

4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于camv的tml，來源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進行連接；

5)引入增強子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于adhl和bronzel)和病毒前導序列(例如來源于tmv,mcmv和amv)。

所述oshsd1基因重組表達載體可通過使用ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接dna轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞(weissbach,1998，methodforplantmolecularbiologyviii,academypress,newyork,pp.411-463；geisersonandcorey,1998,plantmolecularbiology(2ndedition).)。

上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述oshsd1的編碼基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了降低植物蠟質(zhì)含量的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含有oshsd1或所述生物材料。

上述產(chǎn)品可以以oshsd1或所述生物材料作為活性成分，還可以將oshsd1或所述生物材料與其它可以降低植物蠟質(zhì)含量的物質(zhì)進行組合得到的組合物作為活性成分。

本發(fā)明中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為禾本科植物，如水稻(oryzasatival.)。

本發(fā)明中，所述蠟質(zhì)含量可為長鏈脂肪酸及其衍生物的含量，如脂肪酸、鏈烷烴和/或酯類的含量。所述蠟質(zhì)含量可為葉片蠟質(zhì)含量。

實驗證明，本發(fā)明的oshsd1及其編碼基因可以降低植物葉片中蠟質(zhì)的含量：將oshsd1基因?qū)胧荏w植物中得到的轉(zhuǎn)基因植物蠟質(zhì)組分總含量為受體植物的0.67 倍，差異達到顯著水平，表明，oshsd1基因可以降低水稻葉片中的蠟質(zhì)含量；將oshsd1基因?qū)胧荏w植物中得到的轉(zhuǎn)基因植物的c16、c18、c26、c28與c30脂肪酸含量分別為受體植物的0.41、0.44、0.34、0.25和0.41倍，與受體植物相比，轉(zhuǎn)基因植物中的c16、c18、c26、c28與c30脂肪酸均有極顯著的降低，表明，oshsd1基因可以降低水稻葉片蠟質(zhì)中的脂肪酸含量。

附圖說明

圖1為水稻突變體oshsd1中oshsd1基因的基因組dna與日本晴的差異。其中，wt表示日本晴。

圖2為t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1的鑒定結果。其中，marker為分子量標準，oshsd1表示轉(zhuǎn)基因受體植物，oshsd1-c1、oshsd1-c5和oshsd1-c6分別表示三個t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1株系。

圖3為oshsd1基因的亞細胞定位結果。比例尺為4μm

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的水稻突變體oshsd1為將日本晴中的oshsd1基因敲除得到的突變體，oshsd1來源于國家作物種質(zhì)庫，統(tǒng)一編號為gd-00127。其中，oshsd1基因的基因組dna定位在第11號染色體上分子標記m8和m9間，分子標記m8為利用引物tgcgatgatcacctgcatac和ggtgttaccaaccgggatta對日本晴基因組進行擴增得到的pcr產(chǎn)物，分子標記m9為利用引物gcgtgcgccttacaaatta和gttttgcaattgtcgtcgtg對日本晴基因組進行擴增得到的pcr產(chǎn)物，分子標記m8和m9位于同一bac克隆osjnbb0019e05上，物理距離約為16.9kb。oshsd1基因的基因組dna包含六個外顯子與五個內(nèi)含子，與日本晴相比，水稻突變體oshsd1中oshsd1基因的基因組dna的第五個外顯子上存在一個單堿基的突變和三個堿基的缺失(圖1)。

實施例1、oshsd1可以調(diào)控水稻葉片中蠟質(zhì)的含量

本實施例提供了來源于日本晴(中國農(nóng)業(yè)科學院國家種質(zhì)庫)的油體相關蛋白及其編碼基因(即oshsd1基因)，油體相關蛋白的名稱為oshsd1，油體相關蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，oshsd1基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，oshsd1基因的基因組序列如序列3所示。序列3中，序列3的第3442-3639位、第6939-7131位、第8110-8195位、第8720-8851位、第9527-9691位和第9994-10284 位分別為oshsd1基因的六個外顯子的序列；序列3的第1-3204位為啟動子的序列。

1、轉(zhuǎn)基因植物的構建

1.1重組載體和重組農(nóng)桿菌的構建

將載體pcambia2300的ecori與psti識別序列間的片段替換為序列3所示的dna分子，得到重組載體，將該重組載體命名為pcambia2300-oshsd1。pcambia2300-oshsd1與pcambia2300的差別僅在于：pcambia2300-oshsd1為將pcambia2300的bamhi和xhoi識別序列間的dna替換為序列3所示的dna分子得到的重組載體。pcambia2300-oshsd1表達序列1所示的油體相關蛋白(即oshsd1)。

將pcambia2300-oshsd1導入農(nóng)桿菌eha105菌株中，得到含有pcambia2300-oshsd1重組農(nóng)桿菌，將其命名為eha105-pcambia2300-oshsd1；將載體pcambia2300導入農(nóng)桿菌eha105菌株中，得到含有載體pcambia2300的重組農(nóng)桿菌，將其命名為重組農(nóng)桿菌eha105-pcambia2300。

1.2轉(zhuǎn)基因植物的構建

將步驟1.1的eha105-pcambia2300-oshsd1菌株轉(zhuǎn)化水稻突變體oshsd1，具體方法為：

(1)28℃培養(yǎng)eha105-pcambia2300-oshsd116小時，收集菌體，并稀釋到n6液體培養(yǎng)基(sigma公司，c1416)中至濃度為od600≈0.5，獲得菌液；

(2)將培養(yǎng)至一個月的水稻突變體oshsd1成熟胚胚性愈傷組織與步驟(1)的菌液混合侵染30min，濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(n6固體培養(yǎng)基，sigma公司)中，24℃共培養(yǎng)3天；

(3)將步驟(2)共培養(yǎng)后的愈傷組織接種在n6固體篩選培養(yǎng)基1(n6固體篩選培養(yǎng)基1為向n6固體培養(yǎng)基中加入卡那霉素得到的卡那霉素濃度為100mg/l的培養(yǎng)基)上24℃培養(yǎng)16天進行第一次篩選；

(4)挑取步驟(3)第一次篩選后的健康的愈傷組織轉(zhuǎn)入上述n6固體篩選培養(yǎng)基1上24℃下培養(yǎng)進行第二次篩選，每15天繼代一次；

(5)挑取步驟(4)第二次篩選后的健康的愈傷組織轉(zhuǎn)入n6固體篩選培養(yǎng)基2(n6固體篩選培養(yǎng)基2為向n6固體培養(yǎng)基中加入卡那霉素得到的卡那霉素濃度為50mg/l的培養(yǎng)基)上24℃下培養(yǎng)進行第三次篩選，每15天繼代一次；

(6)挑取步驟(5)得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入水稻分化培養(yǎng)基上24℃下進行分化，得到分化成苗的t0代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1，培養(yǎng)t0代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1并收獲其種子，得到t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1種子，培養(yǎng)t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1種子，得到t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1。

按照上述步驟(1)-(6)的方法，將eha105-pcambia2300-oshsd1替換為 eha105-pcambia2300，其他步驟均不變，得到t1代轉(zhuǎn)空載體oshsd1。

利用引物5′-aaaattttggaacgaatttttca-3′和5′-tatcatgcgatcataggcgtctc-3′對t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1進行鑒定，用oshsd1作為陰性對照，結果如圖2所示。結果顯示，t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1中能擴增出大小約1600bp的目的條帶。

2、轉(zhuǎn)基因植物與突變體的表型鑒定

分別將水稻突變體oshsd1、t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1和t1代轉(zhuǎn)空載體oshsd1在正常條件下進行培養(yǎng)，利用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀分別測定各水稻葉片的蠟質(zhì)組分(脂肪酸(fattyacids)、伯醇(primaryalcohols)、鏈烷烴(alkanes)和酯類(esters))，結果如表2所示。

利用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀測定水稻葉片蠟質(zhì)組分，具體采用島津的氣質(zhì)聯(lián)用工作站進行。檢測條件如下：氣相-質(zhì)譜檢測器(shimadzu,gcms-qp2010,japan)，毛細管柱為hp-1ms(agilent,america)低流失柱，型號為30m×0.32mm×0.25μm，以1.2mlmin^-1的氦氣為載氣，柱箱溫度50℃，進樣口溫度250℃，上樣1μl。升溫程序為：50℃保持2min，然后以20℃min^-1升溫至200℃，在200℃保持2min，隨后以2℃min^-1升溫至320℃，在320℃保持14min。程序運行結束得到各個樣品的scan峰圖，對照內(nèi)標c24出峰位置，推斷先后出峰的脂肪酸組分，參照標樣的峰面積，確定各個組分的物質(zhì)的量。

表2、水稻葉片中的蠟質(zhì)組分含量(單位:μm/cm²)

結果顯示，水稻突變體oshsd1和t1代轉(zhuǎn)空載體oshsd1的各蠟質(zhì)組分含量基本無差異，t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1蠟質(zhì)組分總含量為水稻突變體oshsd1的0.67倍，差異達到顯著水平。表明，oshsd1基因可以降低水稻葉片中的蠟質(zhì)含量。

結果顯示，水稻突變體oshsd1和t1代轉(zhuǎn)空載體oshsd1中的各脂肪酸無顯著差異。t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1中的c16、c18、c26、c28與c30脂肪酸含量分別為水稻突變體oshsd1轉(zhuǎn)oshsd1基因植株的0.41、0.44、0.34、0.25和0.41倍，與oshsd1相比，t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1中的c16、c18、c26、c28與c30脂肪酸含量均有極顯著的降低。表明，oshsd1基因可以降低水稻葉片蠟質(zhì)中的脂肪酸含量。

實施例2、oshsd1基因的亞細胞定位

將載體pan580(pan580的序列為序列表中序列4)的spe1與xbal識別序列間的片段替換為序列2所示的dna分子，得到重組載體，將該重組載體命名為pan580-oshsd1-gfp。pan580-oshsd1-gfp表達序列1所示的油體相關蛋白與gfp融合得到的融合蛋白質(zhì)，即oshsd1-gfp。

分別將日本晴與擬南芥的葉肉細胞去細胞壁，分別得到日本晴原生質(zhì)體與擬南芥原生質(zhì)體。日本晴原生質(zhì)體按照如下方法制備：

(1)選取80粒粳稻日本晴種子，經(jīng)催芽后在密閉的透明塑料盒中，30℃光照培養(yǎng)大約10天左右；

(2)將幼苗莖稈切成1mm大小的節(jié)段，放入三角瓶，加10ml用k3溶液配置的酶解液(含有1.5％的cellulase和0.3％的macerozyme)；然后置于恒溫搖床進行酶解(40rpm，28℃)4h；此段時間內(nèi)需要鏡檢，以觀察酶解狀況；

(3)將酶解液用200目的尼龍膜過濾，固體沉淀轉(zhuǎn)移新的三角瓶中，加入10ml w5溶液，繼續(xù)恒溫輕搖1h；

(4)搖晃結束后，轉(zhuǎn)移5ml上述w5溶液至體積為10ml的塑料試管中，1200rpm、離心4min收集原生質(zhì)體用于下一步的轉(zhuǎn)化。

將pan580-oshsd1-gfp用peg介導方法分別轉(zhuǎn)化日本晴原生質(zhì)體與擬南芥原生質(zhì)體中后進行培養(yǎng)。觀察之前，用1mg/ml尼羅紅(油體marker)對轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體染色10min，然后用w5溶液洗3次。觀察融合蛋白質(zhì)的定位情況如圖3所示。結果顯示，融合蛋白質(zhì)定位在油體上。轉(zhuǎn)化程序如下：

(1)先加10μg質(zhì)粒dna(pan580-oshsd1-gfp)，再輕柔加入200μl的重懸的原生質(zhì)體，接著緩慢加入220μl的40％濃度peg4000溶液，輕柔混勻，室溫靜置10-20min；

(2)加入1mlw5溶液，混勻，150g離心3min，并收集原生質(zhì)體；

(3)用1mlk3溶液重懸原生質(zhì)體，28℃、黑暗條件下過夜培養(yǎng)；

(4)使用zeisslsm700激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。