本發(fā)明涉及一種用于度量雞性成熟啟動時機的血清miRNA標志物及含有標志物的血清制備方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

性早熟在人類上表現(xiàn)為病理狀態(tài)，而在動物生產(chǎn)上則是一個具有重要經(jīng)濟價值的性狀。性成熟啟動（青春期/初情期，puberty onset）是動物包括人類生命周期中里程碑式的發(fā)育事件，機體由此獲得生殖能力。性成熟啟動時機（timing of puberty onset）調(diào)控研究備受關(guān)注。

在雞性成熟啟動調(diào)控機制研究和性早熟雞新品系（品種）選育中，缺乏一致的、可精準度量性成熟啟動時機的生物標志物。雞冠、肉髯和體重等變化指標與性發(fā)育并不完全同步；生殖激素水平在不同發(fā)育時期和個體間易波動，限制了其在性成熟啟動度量中的應(yīng)用。

我國地方雞品種資源的早熟特性十分明顯，開展雞性成熟啟動調(diào)節(jié)機制研究，對于高產(chǎn)蛋雞和優(yōu)質(zhì)肉雞育種具有重要意義。同時，雞作為重要的模式生物，其早熟性相關(guān)研究也可為人類性早熟臨床診斷、治療提供科學(xué)依據(jù)。開展雞性成熟調(diào)控機制研究中，一個重要的前提條件是能夠準確地度量性成熟啟動時機及其進程。然而，在研究過程中發(fā)現(xiàn)若采用常規(guī)度量方法（ 雞冠肉髯等第二性征表型觀察：與性發(fā)育并不完全同步；LH/FSH等生殖激素濃度測定：激素水平在不同發(fā)育階段及同一發(fā)育階段不同個體間均存在重疊和較大變異）難以精確度量性成熟啟動時機，已成為雞性成熟啟動相關(guān)研究的瓶頸。另外，在生產(chǎn)中培育性早熟雞新品系（品種），針對具有性早熟遺傳特性的個體難以開展早期（上籠前）精準選種，按常規(guī)以開產(chǎn)日齡（母禽性成熟的標志）作為選育指標嚴重滯后，缺乏一種可輔助用于早期精準選種的生物標志物。

研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNA）是機體重要發(fā)育事件時機轉(zhuǎn)變的一類精細調(diào)控者，外泌體所裝載的miRNA在血清中能穩(wěn)定存在（稱之為循環(huán)miRNA），其拷貝數(shù)變化能精確反映機體生理狀態(tài)的改變，在人類及動物疾病早期監(jiān)測、診斷和預(yù)后觀察中具有較好的應(yīng)用前景，是一種潛在新型生物標志物。尋找和發(fā)現(xiàn)有價值的生物標志物用于雞性成熟啟動時機度量，已經(jīng)成為目前研究的一個重要熱點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述缺陷，目的在于提供一種能夠精準度量雞性成熟啟動時機的miRNA標志物及含有標志物的血清制備方法。

為此本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：所述的標志物為gga-miR-29c-3p、gga-miR-217-5p、gga-miR-375、gga-miR-215-5p、gga-miR-19b-3p、gga-miR-133a-3p、gga-let-7a-5p中的一種或者幾種組合。

所述標記物gga-miR-29c-3p用到的引物如下：

逆轉(zhuǎn)錄引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCGA；

上游引物：CCGCCGTAGCACCATTTG；

下游引物：CGCAGGGTCCGAGGTATTC。

所述標記物gga-miR-217-5p用到的引物如下：

逆轉(zhuǎn)錄引物：

GCGTGGTCCACACCACCTGAGCCGCCACGACCACGCTCCAATCA；

上游引物：CCACCATACTGCATCAGGAACT；

下游引物：CCACACCACCTGAGCCG。

所述標記物gga-miR-375用到的引物如下：

逆轉(zhuǎn)錄引物：

CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGCGCGCTGCCGCTGAGAACGCGAG；

上游引物：GCCGGATTTGTTCGTTCG；

下游引物：GGCTGTCGTGGACTGCG。

所述標記物gga-miR-215-5p用到的引物如下：

逆轉(zhuǎn)錄引物：

GCGTGGTCCACACCACCTGAGCCGCCACGACCACGCAGTCTGTC；

上游引物：GCCGCCATGACCTATGAAT；

下游引物：TCCACACCACCTGAGCCG。

所述標記物gga-miR-19b-3p用到的引物如下：

逆轉(zhuǎn)錄引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGTT；

上游引物：GGCGGTGTGCAAATCCAT；

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。

所述標記物gga-miR-133a-3p用到的引物如下：

逆轉(zhuǎn)錄引物：

CTATACCATAAGCGAGCAGTAGCGCGATGGTATAGACAGCTGG；

上游引物：AACCCGTTGGTCCCCTTCA；

下游引物：GCCATAAGCGAGCAGTAGCG。

所述標記物gga-let-7a-5p用到的引物如下：

逆轉(zhuǎn)錄引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT；

上游引物：GGCGGTGAGGTAGTAGGTTGT；

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。

一種含有標志物的血清制備方法，其特征在于，按照以下步驟進行：

1）集新鮮血液后，迅速置于4℃冷凍離心機中，轉(zhuǎn)速為800~900rpm/min，離心時間為4~6min，去除血細胞及其它內(nèi)容物，用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中；

2）取1）獲取的上清液，迅速置于4℃冷凍離心機中，轉(zhuǎn)速為1800~2000rpm/min，離心時間為8~12min，去除殘留的血細胞。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中；

3）取2）獲取的上清液，迅速置于液氮保存。

本發(fā)明的優(yōu)點是：本發(fā)明通過提取雞血清小RNA，利用qRT-PCR技術(shù)檢測miRNA標記在性成熟進程中的表達規(guī)律，鑒定出了7個能精準度量雞性成熟啟動時機的特異性循環(huán)miRNA標志物，為開展雞性成熟啟動機制研究和性早熟雞新品系（品種）培育提供了更精準的度量標準。

附圖說明

圖1 為性成熟啟動前后7個miRNA標志物表達規(guī)律。

圖中每周齡中從左至右的標志物依次均為miR-29c(p<0.001)、miR-217(p<0.001)、miR-375(p<0.001)、miR-215(p<0.001)、miR-19b(p<0.001)、miR-133a(p<0.001)、let-7a(p<0.001)。

圖2為本發(fā)明制備的血清的質(zhì)檢圖。

具體實施方式

本發(fā)明的目的是鑒定一種用于度量雞性成熟啟動時機的血清miRNA標志物。本發(fā)明的技術(shù)方案是：提取不同發(fā)育階段雞血清小RNA，設(shè)計引物，利用qRT-PCR技術(shù)檢測20個候選miRNA標記的表達變化規(guī)律，通過分析miRNA表達水平與雞性腺組織發(fā)育變化及血清LH激素水平的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)7個候選miRNA標記（任意一個或組合）能精準度量雞性成熟啟動時機。所采用的技術(shù)方法以及所獲得的結(jié)果如下所示：

1 技術(shù)方法

1.1血液采集

無酶管收集雞翅靜脈血樣2~2.5ml。

1.2 血清制備

1）集新鮮血液后，迅速置于4℃冷凍離心機中，轉(zhuǎn)速為800~900rpm/min，離心時間為4~6min，去除血細胞及其它內(nèi)容物，用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中；

2）取1）獲取的上清液，迅速置于4℃冷凍離心機中，轉(zhuǎn)速為1800~2000rpm/min，離心時間為8~12min，去除殘留的血細胞。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中；

3）取2）獲取的上清液，迅速置于液氮保存。要求1h內(nèi)完成整個血清制備過程。

1.3 血清小RNA提取

取出液氮保存的血清，按照常規(guī)Small RNA提取試劑盒操作說明，提取血清小RNA。

1.4 小RNA質(zhì)量檢測

采用Bioanalyzer 2100分光光度計系統(tǒng)檢測樣品的RIN值和A260/A280值。

1.5 候選miRNA RT-qPCR檢測

（1）引物設(shè)計。采用Primer 5.0（ABI）進行引物設(shè)計，包括特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴增上、下游引物（見表1）。

表1 miRNA qRT-PCR檢測引物信息

。

（2）反轉(zhuǎn)錄。按照常規(guī)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作。

（3）相對定量

以snRNA U6作為內(nèi)參。ABI PRISM? 7900HT型熒光定量PCR儀。Real- time PCR體系（20 ul）：2 X SYBR Green Mix With ROX 10.0 ul，ddH2O 8.2 ul，Primer mix (10 uM) 0.8 ul，RT product 1.0 ul。反應(yīng)程序為50℃ 2min，95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 30s，40個循環(huán)。每個樣品3次重復(fù)。

（4）數(shù)據(jù)分析

miRNA相對表達水平的標準化△Cq =Cq miRNA-Cq U6RNA，相對表達水平計算采用2^-△△Cq方法。表達水平的差異顯著性p-值和關(guān)聯(lián)分析采用SPSS 20.0 的one-way ANOVA方差分析LSD多重比較。

2 結(jié)果

通過RT-qPCR檢測，獲得了20個miRNA標記在性成熟啟動前后雞血清中的表達變化（見附圖1），關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明7個候選miRNA標志物在性成熟啟動時機的表達水平顯著升高與性腺組織快速發(fā)育啟動及LH脈沖釋放增加相一致，且表達水平在個體間差異不顯著，結(jié)果顯示7個循環(huán)miRNA標記能精準地度量出雞性成熟啟動時機?；谏鲜鼋Y(jié)果，表明應(yīng)用7個循環(huán)miRNA標記（一個或任意組合）能精準地度量出雞性成熟啟動時機，滿足特異性生物標志物要求，為開展雞性成熟啟動機制研究和性早熟雞新品系（品種）培育提供了更精準的度量標準。也為其它動物性成熟啟動度量及人類性早熟診斷提供了借鑒。