本發(fā)明屬于生物技術的醫(yī)藥新產(chǎn)品，特別涉及一種具有高效免疫激活功能的人白細胞介素ii突變體融合蛋白及其用途。

背景技術：

白細胞介素ii(interleukin-2，il-2，白介素ii)是t淋巴細胞分泌的一種淋巴因子(人白介素ii由133個氨基酸組成的蛋白質(zhì)多肽鏈，分子量為15kd)，是維持免疫系統(tǒng)中t細胞和nk細胞正常功能的最重要的激活因子。白介素ii能促進t細胞成熟、維持t細胞活性，還能促進細胞毒性t淋巴細胞的活性，并使其轉(zhuǎn)化為腫瘤浸潤淋巴細胞(til)；促進自然殺傷(nk)細胞的活性，并誘導殺傷腫瘤的淋巴因子細胞和殺傷細胞(ctl)的增長。白介素ii具有增強人體免疫功能，激活自然殺傷細胞，擴增t淋巴細胞的作用，能誘導和激活淋巴因子激活的殺細胞(lak)及腫瘤浸潤淋巴細胞，這些細胞都有殺傷外源微生物感染細胞以及癌變細胞的作用。由于白介素ii具有顯著的增強免疫作用，故它有很好的抗病毒、抗癌作用和廣泛的臨床應用潛力。白介素ii對腎細胞癌、黑素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌有較明顯療效，對肝癌、軟巢癌、頭頸部鱗癌、膀胱癌、肺癌等有不同程度的療效。在我國白介素ii已廣泛應用于臨床癌癥治療和病素感染(中國重組人白介素ii行業(yè)格局研究與投資前景報告)。

通過促進t細胞和nk細胞成熟和增殖，白介素ii具有誘導抗腫瘤免疫的功效，并于1992年通過fda批準高劑量用于黑色素瘤和腎細胞癌的臨床治療。由于白介素ii有三種不同的結(jié)合受體(α，β和y受體)，其中α受體(cd25)主要表達在t抑制細胞和肺上皮細胞表面，其結(jié)合位點在人白介素ii的37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72氨基酸位點(α受體的口袋)(science 308：1477)，結(jié)合以后通過信號的轉(zhuǎn)導促進抑制t細胞增殖。因此，在這些位點的氨基酸突變可能會降低α受體(cd4cd25)和白介素ii的親和力，從而進一步影響促進調(diào)節(jié)性t細胞的能力，所以減弱α受體結(jié)合的白介素ii基因突變將有減少促進抑制t細胞增殖活性的功能。同時，突變體減少對肺上皮細胞α受體的結(jié)合，從而降低和消除高劑量引起肺水腫的毒副作用。最后，白介素ii在體內(nèi)通過腎臟代謝較快，半衰期較短(jimmunol130：2203-2208；cancerres50：2009-2017)。在低劑量下，白細胞介素ii促進免疫功能的作用微小。因此，由于注射的白介素ii體內(nèi)半衰期短，其在臨床上應用和療效受到限制，其臨床應用也有非常大的局限性。所以有必要制造一種可以即能減少副作用，又能延長白介素ii體內(nèi)半衰期，增加其體內(nèi)的滯留時間的新蛋白體。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有白細胞介素ii存在的缺陷，本發(fā)明提供提供了一種低毒高效副作用小的突變體，保持激活自然殺傷細胞及腫瘤浸潤淋巴細胞功能，同時通過融合蛋白的形式來增加其在體內(nèi)的半衰期，來增強其對免疫系統(tǒng)激活的功能，從而擴大其在臨床上的療效及應用。

本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的：

本高效人白細胞介素ii突變體融合蛋白的特征在于：由組成多肽的氨基酸序列在白介素iiα和β受體結(jié)合點突變，突變的位點在人白介素ii的65，80，81，85，86，92和125氨基酸位點；同時在突變體的c端加入igg4fc蛋白序列，最后形成397個氨基酸序列的融合蛋白。

所述突變體包括一個完整長度的人白介素ii的分子或融合蛋白。

通過基因合成反應合成人白介素ii突變體融合蛋白基因，經(jīng)過純化擴增酶 切，將合成的基因連接重組至多重宿主表達載體，該重組質(zhì)粒的表達突變的白介素ii融合蛋白。一個或多個氨基酸突變的白介素ii表達載體轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞(cho)進行蛋白的生產(chǎn)和純化。測試顯示，白細胞介素ii突變體融合蛋白大大降低或失去促進調(diào)節(jié)性t細胞的能力，減少或消除其毒副作用，同時增加激活自然殺傷細胞和t殺傷性細胞的增值能力，增加治療后nk細胞和t細胞對抑制性t細胞的比例。由于t細胞和nk細胞是免疫系統(tǒng)控制腫瘤的主要效應細胞，可以預見本人白細胞介素ii突變體融合蛋白將會在臨床增加治療癌癥的效用。

本發(fā)明通過對氨基酸定點替代和增加融合蛋白片斷，白細胞介素ii突變體融合蛋白降低了誘導調(diào)節(jié)性t細胞的功能，減少或消除其毒副作用，同時增強了白介素ii對nk和t殺傷細胞免疫活性的屬性。白細胞介素ii突變體融合蛋白可用于刺激免疫系統(tǒng)，增強抑制腫瘤生長功能，增加其抑制體內(nèi)固體腫瘤生長的效用，從而提高其臨床療效和應用范圍。同時，與其他治療組合，或作用一種疫苗成分，治療腫瘤和病毒感染，達到協(xié)同作用的效果。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。

圖1為人原生體白介素ii的氨基酸分子序列；

圖2為白細胞介素ii突變體融合蛋白的氨基酸序列；

圖3為白細胞介素ii突變體融合蛋白純化后的膠染色圖；

圖4為小黑鼠分別連續(xù)注射人白介素ii原生體和白介素ii突變體融合蛋白4天后的脾cd8和nk流式細胞圖：1，對照組，2，人白介素ii原生體，3，人白介素ii突變體融合蛋白；

圖5為小黑鼠分別連續(xù)注射人白介素ii原生體和白介素ii突變體融合蛋白 4天后的脾cd4和cd25流式細胞圖：1，對照組，2，人白介素ii原生體，3，人白介素ii突變體融合蛋白；

圖6為小黑鼠分別連續(xù)注射人白介素ii原生體和白介素ii突變體融合蛋白4天后的脾cd8+t細胞與cd4+cd25+細胞數(shù)量比例圖：1，對照組，2，人白介素ii原生體，3，人白介素ii突變體融合蛋白；

圖7為小黑鼠分別連續(xù)注射人白介素ii原生體和白介素ii突變體融合蛋白4天后的脾nk細胞與cd4+cd25+細胞數(shù)量比例圖：1，對照組，2，人白介素ii原生體，3，人白介素ii突變體融合蛋白。

具體實施方式

實施例1：

人白介素ii突變體庫的建設

根據(jù)人白介素ii的氨基酸序列(基因庫nm-000586)(圖1)對基因序列進行突變。采用重疊延伸法合成人白細胞介素ii突變體融合蛋白基因(圖2)，進一步克隆到多功能表達載體。這些載體轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢細胞中，細胞置于37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)，72小時后取上清液，進一步通過固定化金屬離子親和層析純化為白細胞介素ii突變體融合蛋白(圖3)。純化的蛋白經(jīng)過電泳檢測確認分子量，并進一步用在體內(nèi)的免疫細胞增殖研究。

實施例2：

突變體白介素ii對促進抑制(cd4cd25+)t細胞，nk細胞和cd8+t細胞活性測定

小黑鼠分別通過腹腔注射白介素ii原生體或白介素ii突變體融合蛋白，原生體每日劑量為20微克共計4天，白介素ii突變體融合蛋白為4微克共計4天，第5天收集脾臟，并使用cd25，cd8，nk1.1和cd4抗體染色法對脾細胞進行染 色。最后用流式細胞儀測定和數(shù)據(jù)分析。圖4和5中顯示，與原生體相比，白介素ii突變體融合蛋白增強了對nk(從14.7％到26.8％)和cd8(從14.9％到23.7％)細胞擴增的功能，同時減弱了對cd4+cd25+調(diào)節(jié)性細胞的擴增(從4.11％到0.97％)。

實施例3：

突變體白介素ii融合蛋白與原生體白介素ii蛋白對效應細胞與抑制性細胞比例的影響

如附圖6，7所示，小白鼠分別通過腹腔注射白介素ii原生體或白介素ii突變體融合蛋白，與原生體相比，白介素ii突變體融合蛋白增加了nk細胞與調(diào)節(jié)性抑制細胞的比例(從3.8到24.1)(圖7)，增加了cd8與調(diào)節(jié)性抑制細胞的比例(從4.0到23.8)(圖6)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視本發(fā)明的保護范圍。