本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域，提供了一種可以促進植物遠緣雜交結(jié)實的雌蕊處理試劑及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：
遠緣雜交(Distanthybridization)是指種以上分類單位生物類型之間的雜交，包括同屬植物的種間雜交(Interspecifichybridization)、不同屬植物的屬間雜交(Intergenerichybridization)以及更高分類階元物種之間的雜交，如亞族間雜交(Inter-subtribalhybridization)、族間雜交(Intertribalhybridization)等，是實現(xiàn)基因遠緣轉(zhuǎn)移的一條重要途徑。植物遺傳育種技術(shù)，又稱品種改良，是改良農(nóng)作物、園林植物的遺傳特性，以培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種的技術(shù)，是一項投資少而效益高的生物技術(shù)，對發(fā)展種植業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的意義。品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新的前提和基礎(chǔ)是種質(zhì)資源，遠緣雜交則是實現(xiàn)這一目標(biāo)的一條重要和有效途徑。由于各物種間存在不同程度的生殖隔離，使得遠緣雜交在很多情況下都難以成功。成功的遠緣雜交依賴于植物傳粉受精過程中一系列成功的事件，從花粉粒的附著、萌發(fā)、花粉管的生長、雙受精的完成，到合子、胚乳的發(fā)育等，其中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，都會直接導(dǎo)致雜交的失敗。與生物體自身相關(guān)的遠緣雜交障礙主要有:親本的不可交配性(Incrossability)或不親和性(Incompatibility)；雜種胚與胚乳組織發(fā)育的不協(xié)調(diào)性(Incongruity)以及由于雜種胚的降解(Degeneration)或敗育(Abortion)或雜種的不育(Sterilehybrid)而引起的雜種崩潰(Hybridbreakdown)。或者說，依據(jù)能否正常完成受精作用并發(fā)育形成合子，而將生殖障礙劃分為受精前障礙(Pre-fertilizationbarriers)(也稱合子前障礙，Pre-zygoticbarriers)和受精后障礙(Post-fertilizationbarriers)(也稱合子后障礙，Post-zygoticbarriers)。其中，受精前障礙是主要影響因素，如果克服受精前障礙，在保持合子成活率穩(wěn)定的情況下，可以保證一定的遠緣雜交后代的數(shù)量。以小麥為代表的禾本科植物的遠緣雜交研究進展：小麥在糧食產(chǎn)物中種植面積大、產(chǎn)量高、貿(mào)易額多，是人類主食之一。培育出高產(chǎn)穩(wěn)定，適應(yīng)性強，抗逆性強的小麥?zhǔn)乾F(xiàn)在育種工作者所期望的，而遠緣雜交育種是實現(xiàn)這一目的最經(jīng)濟的手段，在小麥屬種的其它屬，小麥種屬內(nèi)其他物種以及與小麥親緣關(guān)系更遠的種屬中蘊藏著各種各樣的、普通小麥中所不具備的性狀基因，而這些基因控制著小麥的優(yōu)良性狀。通過遠緣雜交、染色體工程技術(shù)、基因工程技術(shù)等生物手段，可以將這些基因整合到小麥基因中并使之表達，從而豐富小麥的遺傳基因庫，為小麥育種提供各種優(yōu)良種質(zhì)資源。遠緣雜交將近緣種屬的有益基因?qū)?，?chuàng)造新的種質(zhì)資源，是目前小麥育種的主要研究方向之一。小麥族近緣屬植物中的遺傳因子是豐富多彩的，其中具有大量普通小麥所不具備的優(yōu)良基因，如蛋白質(zhì)含量高、抗倒伏、穩(wěn)產(chǎn)抗病、抗逆等優(yōu)良性狀，如果能夠?qū)氲浆F(xiàn)在的種植小麥中，將會有很大的突破。孫善成等(1987)從事小麥與偃麥草遠緣雜交三十余年，從介紹了親本選配原則、花期調(diào)節(jié)、交配方法等遠緣雜交技術(shù),用回交與重復(fù)授粉、篩選結(jié)實率高的組合與單株、延長生育期等方法克服遠緣雜種F1的不育性等方面做了有益的探索，總結(jié)了小偃麥遠緣雜種的培育和選擇的方法,并創(chuàng)制并應(yīng)用了八倍體小偃麥、異附加系、異代換系和六倍體小偃麥(小麥新品種)等。近幾年，我國在小麥遠緣雜交育種方面方面取得了很多可喜的成就，并成功培育出了一系列小麥新品種。袁漢民、楊欣明(2004)等采用常規(guī)雜交的方法，利用普通小麥與黑小麥、人工合成小麥雙二倍體、柱穗山羊草雜交，培育出了十個穩(wěn)定的優(yōu)良品系。張正茂等(2003)等則通過遠緣雜交獲得旱地小麥新品種小冰麥，在特定品質(zhì)上要優(yōu)于普通小麥。李振聲、陳瀨陽等通過基因工程技術(shù)，遠緣雜交技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合的方法，利用小麥與長穗偃麥草遠緣雜交成功培育成了小偃4號、小偃5號、小偃6號、小偃107、小偃168、小偃503、早優(yōu)504等多個小麥新品種，并廣泛的用于了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。陳惠民、夏光敏等(1999)選用細胞融合技術(shù)培育出小麥與高冰草的雜種，克服了小麥常規(guī)育種中遠緣雜交不親和的障礙，縮短了育種周期，在此基礎(chǔ)上還先后獲得了小麥與谷子、掉毛雀麥、無芒雀麥3種組合的遠緣雜種植株。劉登才、李光蓉(2001)等發(fā)現(xiàn)山羊草作為母本、小麥推廣種作為父本的雜交成功率較高，而且其雜交后代能夠很好的繼承親本抗逆性，抗倒伏的性狀，此雜種小麥的經(jīng)濟價值很高。小麥遠緣雜交與品種間雜交相比，最主要的問題是：遠緣雜交存在不親和的障礙，即雜種不育或者雜交后代不易成活；雜交子代易夭亡，即使有些個體正常的發(fā)育成熟，結(jié)實率也很低，甚至有些子代完全不育。由于遠緣雜交具有上述特點就增加了遠緣雜交育種工作的困難性、重復(fù)性。因此，長期以來限制了遠緣雜交在小麥育種實踐中的廣泛應(yīng)用。以除蟲菊為代表的園林植物的遠緣雜交研究進展：除蟲菊(學(xué)名：Pyrethrumcinerariifolium)是菊科的多年生草本植物。原產(chǎn)歐洲，栽培藥用，主要作農(nóng)業(yè)殺蟲劑。我國本世紀20年代開始引種栽培?，F(xiàn)在，我國各地均適宜栽培，目前在山東、陜西、黑龍江、吉林、遼寧、江蘇、浙江、安徽、江西、湖南、四川、廣東、云南都有分部。除蟲菊的農(nóng)業(yè)價值在于不僅可以除滅蚊蟲，而且可殺滅農(nóng)作物和林木、果樹的害蟲。它和煙草、毒魚藤合稱為“三大植物性農(nóng)藥”。為了提高除蟲菊的產(chǎn)量和含量，在除蟲菊品種方面加大優(yōu)選力度，國內(nèi)外進行了多種優(yōu)良品種的繁育工作。包括：1、通過太空育種培育除蟲菊。利用太空理想的微重力、超潔凈、高真空、強輻射和弱磁場等特殊環(huán)境影響下，促使種子完成地面難以實現(xiàn)的基因變異。然后通過對這些變異種子的篩選獲得具有優(yōu)良性狀的品種在地面培育。2、通過基因工程培育除蟲菊。主要采用基因轉(zhuǎn)化和增強除蟲菊基因表達來提高除蟲菊素的含量。但是最根本的方法還是通過選擇優(yōu)良品種來培育除蟲菊。但是同樣受到種質(zhì)資源狹窄的限制。菊科，是菊亞綱的第一大科，共13族1300余屬，近2.2萬種，除南極外，全球分布。我國約有220屬近3000種，全國各地分布，其中太行菊屬、葶菊屬、紫菊屬、君范菊屬等15屬為中國特有。日本的Ohishi(1966)通過胚挽救措施獲得了親緣關(guān)系相對很遠的一些遠緣雜種,包括我國的單屬種芙蓉菊(Crossostephiumchinense)。Douzono等實現(xiàn)了菊科菊屬種間雜交種(1998)的周年生產(chǎn)(DendranthemumgrandifloriumandD.Shiwogiku)。李辛雷等(2008)開展了不同倍性菊屬物種間遠緣雜交試驗,比較不同雜交組合的雜交親和指數(shù),并對授粉后生殖生物學(xué)過程(柱頭花粉附著、花粉萌發(fā)、花粉管生長、受精及子房發(fā)育)進行熒光顯微觀察。胡梟,趙惠恩(2008)以太行菊屬的太行菊與菊屬、亞菊屬以及F11(磯菊×毛華菊)、F12(磯菊×毛華菊)作為遠緣雜交的親本,計20個雜交組合,共獲得2063粒種子,694株幼苗,經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定,初步篩選出23株雜種苗,分別為太行菊×異色菊、太行菊×野菊、太行菊×甘菊、甘菊×太行菊、太行菊×亞菊、亞菊×太行菊的雜交種.湯訪評等(2011)，對栽培菊花品種進行改良和種質(zhì)創(chuàng)新，以菊花品種‘天墜玉露’為母本，大島野路菊×芙蓉菊、南京野菊×芙蓉菊和菊花腦×菊蒿3個屬間雜種為父本進行人工雜交，對雜種后代進行細胞學(xué)、形態(tài)學(xué)觀察和基因組雙色熒光原位雜交分析。目前,荷蘭和日本的研究人員也在研究如何利用更多近緣屬進行菊花種質(zhì)資源的創(chuàng)新,通過轉(zhuǎn)基因手段將除蟲菊的關(guān)鍵基因?qū)刖栈ǖ茨鼙磉_。因此，通過遠緣雜交培育有益成分含量高，適應(yīng)性廣、抗病性強的除蟲菊新種質(zhì)將有利于該產(chǎn)業(yè)的推廣應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有遠緣雜交存在的諸多問題，本發(fā)明立足于解決受精前的障礙，以提高遠緣雜交結(jié)實率，提供了一種主要由硼酸、CaCl2、牛血清白蛋白、甘露醇溶液等組成的處理試劑，在授粉前10-30分鐘向雌蕊柱頭噴施該試劑，有利于提高結(jié)實率，并對幼苗成活率也有有利的的影響。利用本發(fā)明所提供的方法，可以有效地克服植物種間雜交的不親和性，有效地克服了普通小麥和除蟲菊與其同科不同屬植物的雜交障礙，實驗證明，通過該方法提高雜交種子的結(jié)實率，種子飽滿度好，為植物遠緣雜交獲得優(yōu)良雜種提供了一種新的途徑。本發(fā)明首先提供了一種促進植物遠緣雜交結(jié)實的雌蕊處理試劑，該處理試劑的主要成分按重量百分比計為：0.02-0.06％硼酸、0.4-0.6％CaCl2、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12-12.5g/100ml的甘露醇,0.04-0.20％果膠酶、0.1-0.3％纖維素酶、0.1-0.3％半纖維素酶，0.05-0.08％赤霉酸，余量為無菌水，其pH為6-8。上述各組分中之所以加入各種酶，是由于植物雌蕊外層的主要成分復(fù)雜，主要是由纖維素、半纖維素、果膠，木質(zhì)素等多糖物質(zhì)交聯(lián)在一起組成，上述采用的各種酶可以促進其消化雌蕊外壁，利于花粉管的突入，如果各種酶用量過少，則不能充分破壞外壁，花粉管進入效果達不到；用量如果過大，則可能對雌蕊內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)造成損傷，也不利于受精、發(fā)育結(jié)實，故而選擇上述的具體用量；組分中的BSA是酶的穩(wěn)定劑，加入之后可以防止酶的分解和非特異性吸附，能有效減輕有些酶的變性，防止酶吸附到管壁而損失；硼酸和氯化鈣中的硼元素和鈣元素能夠促進花粉管的萌發(fā)和延伸，同時赤霉素也促進花粉管的萌發(fā)和延伸；甘露醇調(diào)控處理液的滲透壓，上述物質(zhì)綜合作用，在促進花粉管萌發(fā)中都有作用，對于遠緣雜交可能更好的促進試劑穩(wěn)定、花粉管的萌發(fā)和延伸，維持酶的穩(wěn)定性，從而為纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶起到作用打破雌蕊堅硬的外壁，便于花粉管的進入提供更好的條件。更進一步的，發(fā)明人針對小麥優(yōu)化了上述處理試劑的成分，其主要成分按重量百分比計為：0.02-0.04％硼酸、0.4％CaCl2、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12g/100ml的甘露醇,0.04-0.18％果膠酶、0.1-0.15％纖維素酶、0.1-0.15％半纖維素酶，0.05-0.08％赤霉酸，余量為無菌水，其pH為6-8。同理，發(fā)明人針對除蟲菊優(yōu)化了上述處理試劑的成分，其主要成分按重量百分比計為：0.04-0.06％硼酸、0.6％CaCl2、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12.5g/100ml的甘露醇,0.08-0.20％果膠酶、0.2-0.3％纖維素酶、0.2-0.3％半纖維素酶，0.05-0.08％赤霉酸，余量為無菌水，其pH為6-8。由于小麥和除蟲菊之間的物種差異，發(fā)明人經(jīng)過對其雌蕊外層化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)針對除蟲菊時各種酶用量應(yīng)該增大，以加快破除其外壁，利于花粉管的突入，同時需提高硼酸和氯化鈣以利其花粉管的萌發(fā)和延伸，故此兩者的處理試劑有上述的差異存在；除此之外，發(fā)明人還提供了上述處理試劑的具體使用方法，具體步驟如下：對母本植物進行去雄處理，之后對母本的雌蕊進行噴施處理，噴施時用高霧化噴施，噴施時間為10-30秒，處理時間30-60min；霧化程度為80-100:1。綜上所述，采用本發(fā)明的雌蕊處理試劑，在授粉前10-30分鐘向雌蕊柱頭噴施該試劑，有利于提高結(jié)實率，并對幼苗成活率也有有利的的影響。利用本發(fā)明所提供的方法，可以有效地克服植物種間雜交的不親和性，有效地克服了普通小麥和除蟲菊與其同科不同屬植物的雜交障礙，實驗證明，通過該方法提高雜交種子的結(jié)實率，種子飽滿度好，為植物遠緣雜交獲得優(yōu)良雜種提供了一種新的途徑。具體實施方式實施例1、小麥遠緣雜交試驗試驗材料:試驗用普通小麥農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品系15份為母本，包括山農(nóng)18，山農(nóng)22，山農(nóng)23、濟麥22、良星66、良星99、泰農(nóng)18、臨麥4號、山農(nóng)20、魯原502、濟南17號、汶農(nóng)14、煙農(nóng)21號、青麥6號；經(jīng)鑒定的抗病披堿草植株為父本進行遠緣雜交。每個雜交組合3個重復(fù)，每重復(fù)至少3株6穗，對照為不予試劑處理。使用試劑：對酶液中的甘露醇濃度、酶種類和各種酶濃度的效果進行了篩選。酶液的基本成分為0.02-0.04％硼酸、0.4％CaCl2、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12g/100ml的甘露醇,附加0.04％-0.18％果膠酶(Serva)、0.10％-0.15％纖維素酶(OnozukaRS)、0.10％-0.15％半纖維素酶(Sigma公司)，0.05-0.08％赤霉酸，余量為無菌水，pH6-8。試驗方法：材料均于2012～2013年度種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田。雜交采用捻穗法，授粉后次日再重復(fù)一次。(1)整穗：于抽穗時選擇抽出劍葉鞘3-4cm尚未開花的健壯麥穗作雜交母本。在當(dāng)選小麥植株的主莖穗和次生分蘗上,去除穗子基部的2個小穗和上部小穗,1行留5個小穗,共10個小穗。只保留基部第1、2朵花,其余全部去掉,剪掉整個穎殼的三分之一。(2)去雄：用鑷子輕輕去掉每朵小花的3個雄蕊。去雄時從下向上依次進行,完成1行再進行另1行。(3)噴施試劑：用高霧化小噴壺噴施，噴施20秒；使用噴壺霧化顆粒細，1.5mm口徑，150mm，高霧化小噴壺噴施。試劑處理完畢后套上紙袋,下口用曲別針別住,并掛紙牌,用鉛筆在紙牌注明材料名稱、去雄日期等內(nèi)容。(4)授粉：處理30min-12min后。一般采用捻穗法:將選好的父本穗子的小穗頂端剪開,再用手輕擦幾下后剪下插在地里,小花的花藥由穎殼伸出時,立即剪開母本穗子上紙袋上端,把父本穗倒插入袋中捻轉(zhuǎn)幾下,使花粉盡量散落在柱頭上,然后封好上口,在紙牌上注明父本名稱及授粉時間等。收獲后，室內(nèi)考種，計算平均結(jié)實率，并進行LSD檢驗；將雜交種子在室內(nèi)發(fā)芽，健壯幼苗移栽于大田，抽穗后調(diào)查長成植株的數(shù)目，并計算成株率。收獲后室內(nèi)考種，計算雜種植株在開放授粉條件下的每穗結(jié)實率，其公式如下：結(jié)實率＝結(jié)實粒數(shù)/授粉穎花數(shù)×100％試驗結(jié)果結(jié)果分析：試劑處理后遠緣雜交效果處理顯著，在沒有使用雌蕊處理試劑的情況下，15個小麥品種，與披堿草的遠緣雜交結(jié)實率在0.59-4.02％之間，最高的是山農(nóng)22，最低的是濟麥22.使用雌蕊處理試劑之后，結(jié)實率提高顯著，2.79-5.89％，最高為山農(nóng)18，最低為臨麥4號。其中，增長倍數(shù)最多的是濟麥22，增長到4.55倍。實施例2、除蟲菊的遠緣雜交試驗試驗材料試驗于2012年9月至2013年12月在山東省濟南市憶禾園林有限公司苗圃進行。供試母本為常規(guī)栽培除蟲菊品種，父本供試材料為太行菊，甘菊、異色菊、神農(nóng)香菊、四倍體野菊、同源四倍體菊花腦,六倍體毛華菊、六倍體小紅菊及普通栽培菊花。所有材料均來源于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)“中國菊花種質(zhì)資源保存中心”。使用試劑：對酶液中的甘露醇濃度、酶種類和各種酶濃度的效果進行了篩選。酶液的基本成分為0.04-0.06％硼酸、0.6％CaCl2、1.0％牛血清白蛋白(BSA)、12.5g/100ml的甘露醇,附加0.08％-0.20％果膠酶(Serva)、0.20％-0.30％纖維素酶(OnozukaRS)、0.20％-0.30％半纖維素酶(Sigma公司)，0.05-0.08％赤霉酸，余量為無菌水，pH6-8。試驗方法(1)母本處理：選擇生長健壯的除蟲菊植株作為母本,選取20個發(fā)育良好的頭狀花序，套上硫酸紙袋。在舌狀花剛露色時去雄，即將內(nèi)輪兩性管狀小花全部去除，同時剪去舌狀花花瓣直至可見柱頭，不能傷及柱頭，并進行套袋。(2)搜集父本花粉：父本在頭狀花序開放散粉前套袋隔離。待母本柱頭伸出，并開叉呈現(xiàn)一定角度和分泌黏液時(3-5d后)，收集已套袋的父本新鮮花粉，備用。(3)授粉：授粉前，噴施雌蕊處理試劑，每個頭狀花序噴施10秒，30-60min后，用毛筆進行授粉，授粉后繼續(xù)套袋隔離，次日重復(fù)噴施、授粉1次。(4)統(tǒng)計親和指數(shù)：待母本花梗變黃枯萎時采集授粉花序，脫粒、統(tǒng)計親和指數(shù)。結(jié)實率(％)＝所得種子數(shù)/雜交花序數(shù)目×100結(jié)果：結(jié)果分析：試劑處理后遠緣雜交效果處理顯著，在沒有使用雌蕊處理試劑的情況下，除蟲菊與9個菊科植物品系的遠緣雜交親和指數(shù)在16.7-128.6之間，最高的是異色菊，最低的是同源四倍體菊花腦。使用雌蕊處理試劑之后，除了異色菊之外(親和指數(shù)僅為未處理的1.06倍)，親和指數(shù)明顯提高，提高到2.11-3.38倍，提高幅度最大的是四倍體野菊，最低為六倍體毛華菊。