本發(fā)明屬于天然藥物活性成分作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種含飽和氮雜環(huán)的咖啡酸衍生物，及其在解痙藥物中的作用機(jī)制及其用途。

背景技術(shù)：

唐古特山莨菪anisodustanguticus為茄科山莨菪屬的植物，是中國(guó)的特有植物，藏語(yǔ)稱“唐川那?！?。分布在中國(guó)大陸的甘肅、西藏、云南、青海等地，生長(zhǎng)于海拔2,800米至4,200米的地區(qū)，一般生長(zhǎng)在山坡及草坡陽(yáng)處，目前尚未由人工引種栽培。作為傳統(tǒng)的藏藥，藏醫(yī)用唐古特山莨菪及種子入藥，具有麻醉鎮(zhèn)痛的作用[1]。關(guān)于唐古特山莨菪的化學(xué)成分研究鮮有報(bào)道，多是托品烷類生物堿如莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿和樟柳堿[2]，而唐古特山莨菪中一直以來(lái)廣為人知的藥用成分也是托品烷類生物堿，1960年祝壽河等用該藥材中托品烷類生物堿改善微循環(huán)障礙，挽救了大量腦膜炎兒童的生命；山莨菪堿使暴發(fā)型流腦的病死率由過(guò)去的50％以上降至10％左右[3]。

痙攣是臨床上常見(jiàn)的疾病，是指肌肉突然做不隨意攣縮，俗稱抽筋，會(huì)令患者突感劇痛，肌肉動(dòng)作不協(xié)調(diào)，常見(jiàn)小腿、大腿、手、足、膀胱等痙攣。絞痛在醫(yī)學(xué)上指痙攣性的劇烈疼痛并伴有悶塞的感覺(jué)，尤指胸部悶塞性疼痛(心絞痛)，臨床常見(jiàn)內(nèi)臟絞痛(腹絞痛)、心絞痛、腎絞痛、膽絞痛等。痙攣和絞痛多是由肌肉的不正常收縮引起[4]。

毒蕈堿m受體與腺體和平滑肌的收縮和舒張有關(guān)，m受體的拮抗劑有舒張平滑肌的作用，臨床可用于解痙[5]。如臨床用解痙藥阿托品，為托品烷類生物堿，用藥歷史已久，其解痙作用機(jī)制即是m受體拮抗作用。然而阿托品由于對(duì)腺體、平滑肌、神經(jīng)系統(tǒng)均有作用，因此在治療疾病的同時(shí)有多種副作用，相對(duì)于此，不同結(jié)構(gòu)的m受體拮抗劑的發(fā)現(xiàn)，尤其是本身是新化合物的，可能有更小的副作用。本專利即公開(kāi)了一種新化合物，為含飽和氮雜環(huán)的咖啡酸衍生物，研究結(jié)果表明該化合物有很好的m受體拮抗活性，預(yù)示著可能作為一種副作用更小的解痙藥物應(yīng)用于臨床。

我們應(yīng)用高效液相色譜制備色譜系統(tǒng)，選用適合生物堿分離的反相模式[6]和離子交換模式[7,8]，對(duì)于唐古特山莨菪中的生物堿進(jìn)行制備，得到一種新化合物，為含飽和氮雜環(huán)的咖啡酸衍生物。前期研究中我們采用無(wú)標(biāo)記細(xì)胞靶點(diǎn)藥理學(xué)技術(shù)建立了毒蕈堿m受體拮抗劑的篩選模型，并應(yīng)用該模型篩選了唐古特山莨菪中的生物堿一維餾分對(duì)毒蕈堿m受體的拮抗活性。本發(fā)明用已經(jīng)建立的m受體拮抗劑的篩選模型進(jìn)行化合物的篩選，發(fā)現(xiàn)此新化合物對(duì)于m受體有很好的拮抗作用，而此類化合物還沒(méi)有明確報(bào)道的作用靶點(diǎn)，這就為這類化合物的臨床應(yīng)用前景提供了一個(gè)新的開(kāi)發(fā)方向。

參考文獻(xiàn)：

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[2]張曉峰等.山莨菪植物體內(nèi)4種莨菪烷類生物堿含量的變化.西北植物學(xué)報(bào),2002,22(3):630-634

[3]祝壽河等.山莨菪堿在暴發(fā)型流腦綜合治療中的作用及機(jī)理的探討.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合研究會(huì)微循環(huán)專業(yè)委員會(huì)第一次學(xué)術(shù)會(huì),1987.

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一類含飽和氮雜環(huán)的咖啡酸衍生物的新化合物mmpvp，該化合物為如下結(jié)構(gòu)所示的化合物、或其藥學(xué)可接受的鹽

其通式為

其中r1＝h,oh,och3；r2＝h,oh,och3；

本發(fā)明所述化合物藥學(xué)上可接受的鹽，選自但不限于：硫酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、三氟乙酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、樟腦磺酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、己酸鹽、己二酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽等。

本發(fā)明化合物mmpvp的制備方法是應(yīng)用高效液相色譜制備色譜系統(tǒng)，選用適合生物堿分離的反相模式色譜柱xchargec18和離子交換模式色譜柱xchargescx，對(duì)于唐古特山莨菪中的生物堿進(jìn)行制備,得到此化合物。

本發(fā)明的另一目的是提供一類含有所示結(jié)構(gòu)式及其類似化合物mmpvp的權(quán)利要求1-3任一化合物，或其藥學(xué)可接受的鹽的藥物組合物，即以所示結(jié)構(gòu)式的含飽和氮雜環(huán)的咖啡酸衍生物或其藥學(xué)可接受的鹽作為主要有效活性成分，還可加入一種或多種藥物上可接受的輔料，以改善藥物吸收效果或便于服用，如制成注射液、凍干粉針劑、注射微球、脂質(zhì)體、片劑、膠囊劑、水劑、散劑、糊劑、噴霧劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、凝膠劑、貼片、膏劑等，其中優(yōu)選注射液、凍干粉針劑、片劑和膠囊劑、貼片等；本發(fā)明所述的輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的填充劑、稀釋劑、粘合劑、賦形劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、色素和甜味劑。

本發(fā)明化合物使用方法包括給所述患者施用有效量的藥物，可采用任何適當(dāng)?shù)慕o藥方式施用這些治療單體化合物或組合物，可以是但不限于經(jīng)靜脈注射、口服、直腸、舌下、粘膜、鼻、眼、肌肉、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、脊椎、鞘內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、支氣管、淋巴和子宮、皮下、皮膚表面、局部注射等方式給藥。

本發(fā)明化合物為毒蕈堿m受體拮抗劑，可用于鎮(zhèn)痛、解痙、鎮(zhèn)靜、解救有機(jī)磷中毒等疾病藥物中，本發(fā)明的化合物不用于已有報(bào)道的托品烷類生物 堿，且有良好的m受體拮抗活性，可能有更小的副作用，更好的作用效果。毒蕈堿m受體為g蛋白偶聯(lián)受體，與痙攣、鎮(zhèn)靜、帕金森癥、精神分裂癥、抑郁癥等相關(guān)，根據(jù)靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)性，可以拓寬此化合物的臨床應(yīng)用范圍。

附圖說(shuō)明

圖1.化合物的純化制備過(guò)程色譜圖；

圖2.毒蕈堿m受體拮抗劑的dmr信號(hào)及m受體拮抗劑預(yù)處理后乙酰膽堿引起的dmr信號(hào)：

a.不同濃度的莨菪堿處理ht29細(xì)胞后引起的dmr信號(hào)；

b.不同濃度的莨菪堿預(yù)處理ht29細(xì)胞后，再加入乙酰膽堿(16μm)引起的dmr信號(hào)；

c.不同濃度的東莨菪堿處理ht29細(xì)胞后引起的dmr信號(hào)；

d.不同濃度的東莨菪堿預(yù)處理ht29細(xì)胞后，再加入乙酰膽堿(16μm)引起的dmr信號(hào)；

圖3.不同劑量的mmpvp的dmr信號(hào)及mmpvp預(yù)處理后乙酰膽堿引起的dmr信號(hào)；

圖4.化合物mmpvp預(yù)處劑量與16μm乙酰膽堿引起的dmr信號(hào)的量效關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下面以具體實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例中所使用的各種化學(xué)試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均通過(guò)常規(guī)商業(yè)途徑獲得；乙酰膽堿購(gòu)自百靈威公司；唐古特山莨菪藥材由西北高原植物所青海所采，唐古特山莨菪中的生物堿化合物均由實(shí)驗(yàn)室自制；dmso購(gòu)買自biobasic公司；hbss和mccoy’s5a培養(yǎng)液購(gòu)自gibco公司；384孔生物感應(yīng)器微型板購(gòu)自corning公司；ht29人結(jié)腸癌細(xì)胞從中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)獲得(中國(guó)，上海)。

實(shí)施例1唐古特山莨菪中生物堿化合物的純化制備

1.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

唐古特山莨菪藥材由西北高原植物所青海所采，經(jīng)梅麗娟老師鑒定。色譜柱xchargec18(4.6×250mm,7μm，華譜公司)，xchargec18(100×280mm,7μm，華譜公司)，xchargescx(100×316mm,7μm，華譜公司)，xchargec18(20×250mm,7μm，華譜公司)，無(wú)水硫酸鈉，二水合磷酸二氫鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，乙醇胺，磷酸，甲酸購(gòu)自百靈威，制備色譜級(jí)乙腈購(gòu)自安徽時(shí)聯(lián)。

2.化合物的純化制備

提取，分兩批提取,每批25kg，加80l乙醇浸泡后加熱回流2h，分別提取三次，得到350l提取液。提取液濃縮至100l，用強(qiáng)陽(yáng)離子交換的scx spe材料富集生物堿組分，1.5kg填料，每次上樣濃縮液10l，甲醇10l洗滌非生物堿，250mmnh4clo4/90％甲醇20l洗脫生物堿。生物堿洗脫液蒸干，重溶到6l的0.1％tfa/w，進(jìn)行c18hce的一維制備，采用acn-na2so4/w體系，30min內(nèi)acn5％-15％，收集保留時(shí)間20-21min的餾分f12(制備色譜圖為圖1a)，對(duì)其進(jìn)行scx的二維制備，acn-30mmnah2po4-w,30minacn35％-50％，收集保留時(shí)間49-51min的色譜峰f12_15(制備色譜圖為圖1b)，進(jìn)行c18hce的2％acn-0.1％fa/w三維制備，得到f12_15_p2。正離子esi-ms給出的分子離子峰m/z：234.0([m+h]⁺，分子式c14h19no2，分子量233.1)。核磁氫譜信息如下：¹h-nmr(d2o，400mhz)δ:7.00(1h,s),6.88(1h,d),6.76(1h,d),6.67(1h,d),5.90(1h,dd),3.78(1h,m),3.73(3h,s),3.60(1h,m),3.05(1h,m),2.70(3h,s),2.25(2h,m),2.02(2h,m),1.86(1h,m)。鑒定為mmpvp。

實(shí)施例2毒蕈堿m受體拮抗劑的在epic平臺(tái)上的dmr信號(hào)特征

1.方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

ht29人結(jié)腸癌細(xì)胞從中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)獲得(中國(guó)，上海)。ht29細(xì)胞用含有體積濃度10％的胎牛血清、50μg/ml氨芐青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素的mccoy’s5a培養(yǎng)基(gibco,貨號(hào)12800017，含d-glucose4500.0mg/l，添加nahco32.2g/l)，在37℃、體積含量5％co2(空氣)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2毒蕈堿m受體拮抗劑的細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)方法

ht29細(xì)胞以2×10⁴個(gè)/孔的密度接種到384孔生物感應(yīng)器微型板中，置于37℃、體積含量5％co2(空氣)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h，檢測(cè)前用hbss緩沖液洗1次，再在每孔中加入30μlhbss緩沖液，置于系統(tǒng)上平衡孵育1h。平衡后首先在系統(tǒng)上建立一個(gè)2min的基線，然后將莨菪堿、東莨菪堿10μl(每個(gè)化合物均有14個(gè)濃度點(diǎn)，最高工作濃度10μm，2倍逐級(jí)稀釋，5μm，2.5μm，1.25μm等等)分別加入已接種ht29細(xì)胞的384孔生物感應(yīng)器微型板中，在系統(tǒng)上監(jiān)測(cè)60min，得化合物的dmr響應(yīng)曲線。然后加入乙酰膽堿(16μm)繼續(xù)監(jiān)測(cè)60min，得乙酰膽堿dmr響應(yīng)曲線。通過(guò)監(jiān)測(cè)乙酰膽堿引起的dmr響應(yīng)信號(hào)是否被預(yù)處理時(shí)加入的待測(cè)化合物所抑制來(lái)判斷化合物對(duì)毒蕈堿m受體的拮抗活性。

1.3數(shù)據(jù)分析

dmr數(shù)據(jù)由epicimager軟件(康寧公司，美國(guó))記錄，并經(jīng)imagerbeta3.7軟件(康寧公司，美國(guó))處理得到。采用microsoftexcel2010和graphpadprism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的dmr信號(hào)都經(jīng)空白校正得到。所有數(shù)據(jù)來(lái)自2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次3次重復(fù)。

2.結(jié)果

分別以不同濃度的毒蕈堿m受體拮抗劑莨菪堿或東莨菪堿處理ht29細(xì)胞后，兩者都不引起dmr響應(yīng)信號(hào)，見(jiàn)圖2a、2c(不同濃度的拮抗劑對(duì)應(yīng)的dmr 曲線重合)，再次加入16μm乙酰膽堿(ec80)，乙酰膽堿引起的dmr響應(yīng)信號(hào)被抑制，且拮抗劑的濃度越高抑制活性越強(qiáng)，呈劑量依賴性，見(jiàn)圖2b、2d(拮抗劑濃度從10μm逐級(jí)稀釋到1.22nm，所對(duì)應(yīng)的dmr信號(hào)曲線從下到上排列)。由此得出，毒蕈堿m受體拮抗劑特征dmr譜為拮抗劑本身不引起dmr響應(yīng)信號(hào)，拮抗乙酰膽堿引起的dmr響應(yīng)信號(hào)。

實(shí)施例3mmpvp對(duì)毒蕈堿m受體拮抗活性

采用無(wú)標(biāo)記細(xì)胞靶點(diǎn)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)活性篩選中m受體拮抗活性較強(qiáng)的化合物mmpvp進(jìn)行量效關(guān)系考察。首先，將10μl待測(cè)化合物加入已接種ht29細(xì)胞的384孔生物感應(yīng)器微型板中，在系統(tǒng)上監(jiān)測(cè)60min，然后加入10μl乙酰膽堿(16μm)繼續(xù)監(jiān)測(cè)60min。以作用時(shí)間對(duì)化合物引起的dmr信號(hào)作圖，如圖3a(化合物濃度從200μm逐級(jí)稀釋到48.8nm，對(duì)應(yīng)的dmr曲線變化不大)；以作用時(shí)間對(duì)第二步加入乙酰膽堿后引起的dmr響應(yīng)信號(hào)作圖，結(jié)果如圖3b(化合物濃度從200μm逐級(jí)稀釋到48.8nm，所對(duì)應(yīng)的dmr信號(hào)曲線從下到上排列)。從圖中可以看出，mmpvp在ht29細(xì)胞上不引起dmr信號(hào)，而預(yù)處理劑量與再次加入乙酰膽堿引起的dmr響應(yīng)信號(hào)呈劑量依賴性，即mmpvp濃度越高抑制活性越強(qiáng)。這與毒蕈堿m受體拮抗劑的特征相符合，由此推斷，mmpvp為毒蕈堿m受體拮抗劑。

在第二步實(shí)驗(yàn)圖中，選取化合物mmpvp各個(gè)濃度30min時(shí)間點(diǎn)的乙酰膽堿dmr信號(hào)值，以濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，dmr值為縱坐標(biāo)，在prism軟件中擬合拮抗活性曲線，得到化合物mmpvp的ic50值，見(jiàn)圖4。