本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)6種常見(jiàn)食品致病菌的引物組合及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阪崎腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽胞桿菌、創(chuàng)傷弧菌和空腸彎曲桿菌是食品中常見(jiàn)的致病菌，也是重要的食源性致病菌。阪崎腸桿菌是主要通過(guò)嬰幼兒配方奶粉經(jīng)消化道感染兒童,引起新生兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎,致死率高50％～80％。國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)于2002年將阪崎腸桿菌列為對(duì)特定人群產(chǎn)生嚴(yán)重的生命危害或產(chǎn)生慢性后遺癥的微生物。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是人畜共患病原菌，它的宿主主要是動(dòng)物，在肉類(lèi)、蔬菜、乳制品、牡蠣、蛤和蝦等食品中也有檢出，引起腹瀉；志賀氏菌是引起人類(lèi)急性感染性痢疾最為常見(jiàn)的病原菌，俗稱(chēng)痢疾桿菌，人類(lèi)主要通過(guò)食用被志賀氏菌污染的食品而感染發(fā)病，全身中毒癥狀和大腸化膿性炎癥為主要臨床特征，此菌對(duì)嬰幼兒具有致命性，是重要的食源性致病菌；蠟樣芽孢桿菌是一種革蘭陽(yáng)性桿菌，極易污染食物而引起食物中毒，特別是在蛋白質(zhì)和碳水化合物含量豐富的食品中，如肉類(lèi)、米飯、奶制品、腐乳、魚(yú)、燒雞等中，造成嘔吐及腹瀉癥狀；創(chuàng)傷弧菌，也被稱(chēng)為海洋弧菌，是一種棲息于海洋中的細(xì)菌，若食用了遭創(chuàng)傷弧菌污染的海鮮，極易引起腸胃炎；空腸彎曲桿菌是一種食源性人獸共患病原菌。它的主要宿主是家禽，它主要引起人類(lèi)的急性腸炎和食物中毒，在部分國(guó)家已取代沙門(mén)氏菌成為最常見(jiàn)的腹瀉病病原菌之一。因此，控制食品特別是雞肉產(chǎn)品中彎曲桿菌的污染并加強(qiáng)食品中空腸彎曲桿菌的檢測(cè)極為重要。
基于傳統(tǒng)分離方法的國(guó)標(biāo)法gb依然是目前很多檢測(cè)機(jī)構(gòu)在進(jìn)行6種常見(jiàn)食品致病菌檢測(cè)的主要依據(jù)。主要包括增菌培養(yǎng)，平板分離，生化鑒定等步驟。檢測(cè)方法繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低，容易發(fā)生漏檢和錯(cuò)檢，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已無(wú)法滿(mǎn)足目前食品快速檢測(cè)的要求。近幾年發(fā)展起來(lái)的分子檢測(cè)技術(shù),特別是pcr技術(shù),在微生物快速鑒定和檢測(cè)方面的應(yīng)用,為食源性致病菌的快速檢測(cè)開(kāi)辟了新的途徑。但是,pcr存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、易污染、假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn),使其應(yīng)用受到限制。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是近年來(lái)發(fā)展出的一種敏感、特異、簡(jiǎn)便、快捷的核酸擴(kuò)增技術(shù),其原理是在一種具有鏈置換活性的dna聚合酶的作用下，識(shí)別6～8個(gè)區(qū)域的4～6條引物，在等溫條件下快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因，可推廣應(yīng)用于快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)常見(jiàn)的食源性微生物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)6種常見(jiàn)食品致病菌的引物組合及其應(yīng)用。
本發(fā)明提供的引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由引物組ⅰ、引物組ⅱ、引物組ⅲ、引物組ⅳ、引物組ⅴ和引物組ⅵ組成；
(a2)由所述引物組ⅰ、所述引物組ⅱ、所述引物組ⅲ、所述引物組ⅳ、所述引物組ⅴ和所述引物組ⅵ組中的任意兩個(gè)、任意三個(gè)、任意四個(gè)或任意五個(gè)組成；
(a3)所述引物組ⅰ、所述引物組ⅱ、所述引物組ⅲ、所述引物組ⅳ、所述引物組ⅴ或所述引物組ⅵ；
所述引物組ⅰ由引物ⅰ-f3、引物ⅰ-b3、引物ⅰ-fip、引物ⅰ-bip、引物ⅰ-lf和引物ⅰ-lb組成；
所述引物ⅰ-f3為如下(b1)或(b2)；
(b1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；
(b2)將序列1經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-b3為如下(b3)或(b4)；
(b3)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；
(b4)將序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-fip為如下(b5)或(b6)；
(b5)序列表的序列3所示的單鏈dna分子；
(b6)將序列3經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-bip為如下(b7)或(b8)；
(b7)序列表的序列4所示的單鏈dna分子；
(b8)將序列4經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-lf為如下(b9)或(b10)；
(b9)序列表的序列5所示的單鏈dna分子；
(b10)將序列5經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅰ-lb為如下(b11)或(b12)；
(b11)序列表的序列6所示的單鏈dna分子；
(b12)將序列6經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的dna分子；
所述引物組ⅱ由引物ⅱ-f3、引物ⅱ-b3、引物ⅱ-fip、引物ⅱ-bip、引物ⅱ-lf和引物ⅱ-lb組成；
所述引物ⅱ-f3為如下(c1)或(c2)；
(c1)序列表的序列7所示的單鏈dna分子；
(c2)將序列7經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-b3為如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列8所示的單鏈dna分子；
(c4)將序列8經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-fip為如下(c5)或(c6)；
(c5)序列表的序列9所示的單鏈dna分子；
(c6)將序列9經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-bip為如下(c7)或(c8)；
(c7)序列表的序列10所示的單鏈dna分子；
(c8)將序列10經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相 同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-lf為如下(c9)或(c10)；
(c9)序列表的序列11所示的單鏈dna分子；
(c10)將序列11經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅱ-lb為如下(c11)或(c12)；
(c11)序列表的序列12所示的單鏈dna分子；
(c12)將序列12經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的dna分子；
所述引物組ⅲ由引物ⅲ-f3、引物ⅲ-b3、引物ⅲ-fip、引物ⅲ-bip、引物ⅲ-lf和引物ⅲ-lb組成；
所述引物ⅲ-f3為如下(d1)或(d2)；
(d1)序列表的序列13所示的單鏈dna分子；
(d2)將序列13經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-b3為如下(d3)或(d4)；
(d3)序列表的序列14所示的單鏈dna分子；
(d4)將序列14經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-fip為如下(d5)或(d6)；
(d5)序列表的序列15所示的單鏈dna分子；
(d6)將序列15經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-bip為如下(d7)或(d8)；
(d7)序列表的序列16所示的單鏈dna分子；
(d8)將序列16經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-lf為如下(d9)或(d10)；
(d9)序列表的序列17所示的單鏈dna分子；
(d10)將序列17經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅲ-lb為如下(d11)或(d12)；
(d11)序列表的序列18所示的單鏈dna分子；
(d12)將序列18經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相同功能的dna分子；
所述引物組ⅳ由引物ⅳ-f3、引物ⅳ-b3、引物ⅳ-fip、引物ⅳ-bip、引物ⅳ-lf和引物ⅳ-lb組成；
所述引物ⅳ-f3為如下(e1)或(e2)；
(e1)序列表的序列19所示的單鏈dna分子；
(e2)將序列19經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列19具有相 同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-b3為如下(e3)或(e4)；
(e3)序列表的序列20所示的單鏈dna分子；
(e4)將序列20經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-fip為如下(e5)或(e6)；
(e5)序列表的序列21所示的單鏈dna分子；
(e6)將序列21經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列21具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-bip為如下(e7)或(e8)；
(e7)序列表的序列22所示的單鏈dna分子；
(e8)將序列22經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列22具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-lf為如下(e9)或(e10)；
(e9)序列表的序列23所示的單鏈dna分子；
(e10)將序列23經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列23具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅳ-lb為如下(e11)或(e12)；
(e11)序列表的序列24所示的單鏈dna分子；
(e12)將序列24經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列24具有相同功能的dna分子；
所述引物組ⅴ由引物ⅴ-f3、引物ⅴ-b3、引物ⅴ-fip、引物ⅴ-bip、引物ⅴ-lf和引物ⅴ-lb組成；
所述引物ⅴ-f3為如下(f1)或(f2)；
(f1)序列表的序列25所示的單鏈dna分子；
(f2)將序列25經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列25具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-b3為如下(f3)或(f4)；
(f3)序列表的序列26所示的單鏈dna分子；
(f4)將序列26經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列26具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-fip為如下(f5)或(f6)；
(f5)序列表的序列27所示的單鏈dna分子；
(f6)將序列27經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列27具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-bip為如下(f7)或(f8)；
(f7)序列表的序列28所示的單鏈dna分子；
(f8)將序列28經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列28具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-lf為如下(f9)或(f10)；
(f9)序列表的序列29所示的單鏈dna分子；
(f10)將序列29經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列29具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅴ-lb為如下(f11)或(f12)；
(f11)序列表的序列30所示的單鏈dna分子；
(f12)將序列30經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列30具有相同功能的dna分子；
所述引物組ⅵ由引物ⅵ-f3、引物ⅵ-b3、引物ⅵ-fip、引物ⅵ-bip、引物ⅵ-lf和引物ⅵ-lb組成；
所述引物ⅵ-f3為如下(g1)或(g2)；
(g1)序列表的序列31所示的單鏈dna分子；
(g2)將序列31經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列31具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅵ-b3為如下(g3)或(g4)；
(g3)序列表的序列32所示的單鏈dna分子；
(g4)將序列32經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列32具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅵ-fip為如下(g5)或(g6)；
(g5)序列表的序列33所示的單鏈dna分子；
(g6)將序列33經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列33具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅵ-bip為如下(g7)或(g8)；
(g7)序列表的序列34所示的單鏈dna分子；
(g8)將序列34經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列34具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅵ-lf為如下(g9)或(g10)；
(g9)序列表的序列35所示的單鏈dna分子；
(g10)將序列35經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列35具有相同功能的dna分子；
所述引物ⅵ-lb為如下(g11)或(g12)；
(g11)序列表的序列36所示的單鏈dna分子；
(g12)將序列36經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列36具有相同功能的dna分子。
所述引物組ⅰ中，引物ⅰ-f3、引物ⅰ-b3、引物ⅰ-fip、引物ⅰ-bip、引物ⅰ-lf和引物ⅰ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物組ⅱ中，引物ⅱ-f3、引物ⅱ-b3、引物ⅱ-fip、引物ⅱ-bip、引物ⅱ-lf和引物ⅱ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物組ⅲ中，引物ⅲ-f3、引物ⅲ-b3、引物ⅲ-fip、引物ⅲ-bip、引物ⅲ-lf和引物ⅲ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物組ⅳ中，引物ⅳ-f3、引物ⅳ-b3、引物ⅳ-fip、引物ⅳ-bip、引物ⅳ-lf和引物 ⅳ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物組ⅴ中，引物ⅴ-f3、引物ⅴ-b3、引物ⅴ-fip、引物ⅴ-bip、引物ⅴ-lf和引物ⅴ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物組ⅵ中，引物ⅵ-f3、引物ⅵ-b3、引物ⅵ-fip、引物ⅵ-bip、引物ⅵ-lf和引物ⅵ-lb的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。
本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下(h1)或(h2)：
(h1)鑒定阪崎腸桿菌和/或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和/或志賀氏菌和/或蠟樣芽孢桿菌和/或創(chuàng)傷弧菌和/或空腸彎曲桿菌；
(h2)用于檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有阪崎腸桿菌和/或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和/或志賀氏菌和/或蠟樣芽孢桿菌和/或創(chuàng)傷弧菌和/或空腸彎曲桿菌。
本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(h1)或(h2)：
(h1)鑒定阪崎腸桿菌和/或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和/或志賀氏菌和/或蠟樣芽孢桿菌和/或創(chuàng)傷弧菌和/或空腸彎曲桿菌；
(h2)用于檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有阪崎腸桿菌和/或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和/或志賀氏菌和/或蠟樣芽孢桿菌和/或創(chuàng)傷弧菌和/或空腸彎曲桿菌。
本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨(dú)包裝的步驟。
本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)菌是否為阪崎腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、創(chuàng)傷弧菌或空腸彎曲桿菌的方法，包括如下步驟：
(1)提取待測(cè)菌的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，分別采用所述引物組合中的每個(gè)引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，然后進(jìn)行如下判斷：
如果采用所述引物組ⅰ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌為或候選為阪崎腸桿菌；
如果采用所述引物組ⅱ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌為或候選為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌；
如果采用所述引物組?？梢詫?shí)現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌為或候選為志賀氏菌；
如果采用所述引物組ⅳ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌為或候選為蠟樣芽孢桿菌；
如果采用所述引物組ⅴ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌為或候選為創(chuàng)傷弧菌；
如果采用所述引物組ⅵ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌為或候選為空腸彎曲桿菌。
本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有阪崎腸桿菌和/或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和/或志賀氏菌和/或蠟樣芽孢桿菌和/或創(chuàng)傷弧菌和/或空腸彎曲桿菌的方法，包括如下步驟：
(1)提取待測(cè)樣本的總dna；
(2)以步驟(1)提取的總dna為模板，分別采用所述引物組合中的每個(gè)引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，然后進(jìn)行如下判斷：
如果采用所述引物組ⅰ可以實(shí)現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或 疑似含有阪崎腸桿菌；
如果采用所述引物組ⅱ可以實(shí)現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌；
如果采用所述引物組?？梢詫?shí)現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有志賀氏菌；
如果采用所述引物組ⅳ可以實(shí)現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有蠟樣芽孢桿菌；
如果采用所述引物組ⅴ可以實(shí)現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有創(chuàng)傷弧菌；
如果采用所述引物組ⅵ可以實(shí)現(xiàn)以所述總dna為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有空腸彎曲桿菌。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅰ時(shí)，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中引物ⅰ-f3、引物ⅰ-b3、引物ⅰ-fip、引物ⅰ-bip、引物ⅰ-lf和引物ⅰ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅱ時(shí)，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中引物ⅱ-f3、引物ⅱ-b3、引物ⅱ-fip、引物ⅱ-bip、引物ⅱ-lf和引物ⅱ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅲ時(shí)，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中引物ⅲ-f3、引物ⅲ-b3、引物ⅲ-fip、引物ⅲ-bip、引物ⅲ-lf和引物ⅲ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅳ時(shí)，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中引物ⅳ-f3、引物ⅳ-b3、引物ⅳ-fip、引物ⅳ-bip、引物ⅳ-lf和引物ⅳ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅴ時(shí)，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中引物ⅴ-f3、引物ⅴ-b3、引物ⅴ-fip、引物ⅴ-bip、引物ⅴ-lf和引物ⅴ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
以上任一所述方法中，采用所述引物組ⅵ時(shí)，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中引物ⅵ-f3、引物ⅵ-b3、引物ⅵ-fip、引物ⅵ-bip、引物ⅵ-lf和引物ⅵ-lb的摩爾濃度依次為0.5μm、0.5μm、2μm、2μm、1μm、1μm。
本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在檢測(cè)待測(cè)菌是否為阪崎腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、創(chuàng)傷弧菌或空腸彎曲桿菌中的應(yīng)用。
本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有阪崎腸桿菌和/或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和/或志賀氏菌和/或蠟樣芽孢桿菌和/或創(chuàng)傷弧菌和/或空腸彎曲桿菌中的應(yīng)用。
以上任一所述阪崎腸桿菌具體可為cicc編號(hào)為21560的菌株。以上任一所述小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌具體可為atcc編號(hào)為23715的菌株。以上任一所述志賀氏菌具體可為atcc編號(hào)為12022的菌株。以上任一所述蠟樣芽孢桿菌具體可為atcc編號(hào)為11778的菌株。以上任一所述創(chuàng)傷弧菌具體可為atcc編號(hào)為27562的菌株。以上任一所述空腸彎曲桿菌具體可為atcc編號(hào)為33291的菌株。
采用本發(fā)明提供的引物組合鑒定6種常見(jiàn)食品致病菌，具有高特異性和高靈敏度，可以簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)阪崎腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽胞桿菌、 創(chuàng)傷弧菌和空腸彎曲桿菌。本發(fā)明具有重大的推廣價(jià)值。
附圖說(shuō)明
圖1為實(shí)施例2中采用引物組ⅰ的結(jié)果。
圖2為實(shí)施例2中采用引物組ⅱ的結(jié)果。
圖3為實(shí)施例2中采用引物組ⅲ的結(jié)果。
圖4為實(shí)施例2中采用引物組ⅳ的結(jié)果。
圖5為實(shí)施例2中采用引物組ⅴ的結(jié)果。
圖6為實(shí)施例2中采用引物組ⅵ的結(jié)果。
圖7為實(shí)施例4中樣本一的結(jié)果。
圖8為實(shí)施例4中樣本二的結(jié)果。
圖9為實(shí)施例4中樣本三的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。atcc網(wǎng)址：http://www.atcc.org/。cicc網(wǎng)址：http://www.china-cicc.org/。
實(shí)施例1、試劑盒的制備
試劑盒由六個(gè)lamp引物組組成，每個(gè)引物組用于檢測(cè)一種食品致病菌。
用于檢測(cè)阪崎腸桿菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列1)：tcggtggttaccaggtta；
外引物b3(序列表的序列2)：agtcagcacgccatacc；
內(nèi)引物fip(序列表的序列3)：agtgtcgcctttatacggcatgcgtacgttggtttcgaaatgg；
內(nèi)引物bip(序列表的序列4)：gcgctttcaaagctcagggcacgggtgtatacgtccag；
環(huán)引物lf(序列表的序列5)：gcccagccagtcgtag；
環(huán)引物lb(序列表的序列6)：gtacagctgaccgctaaac。
用于檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列7)：tatgcgcaaagccatgt；
外引物b3(序列表的序列8)：gttgatgcggaaagatgg；
內(nèi)引物fip(序列表的序列9)：cagttatcatcgagttcataacggtaaagaaaatggggatacattggat；
內(nèi)引物bip(序列表的序列10)：tcgtttgcttataactcatcagggaatcaacatcaccatgaccaa；
環(huán)引物lf(序列表的序列11)：cttcaggttaaaacctttaggg；
環(huán)引物lb(序列表的序列12)：gatttcttctatggcagtaataagt。
用于檢測(cè)志賀氏菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列13)：atgttccgcctcgaaat；
外引物b3(序列表的序列14)：ggaggtcatttgctgtca；
內(nèi)引物fip(序列表的序列15)：aggtagacttctatctcatccacaatctggaggacattgcccg；
內(nèi)引物bip(序列表的序列16)：ccttccagaccatgctcgcctcccgacacgccatag；
環(huán)引物lf(序列表的序列17)：tggagagttctgactttatcc；
環(huán)引物lb(序列表的序列18)：tgccgtgaaggaaatgc。
用于檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列19)：gaaagaatatccaaatcaaacag；
外引物b3(序列表的序列20)：cccaatcacgtgaacgaaa；
內(nèi)引物fip(序列表的序列21)：gctgcaatgacctcgttattattgtcagtattaggtcgtagtagtgg；
內(nèi)引物bip(序列表的序列22)：cgatcatttttcttaattttcgtgtcctcccgacacgccatag；
環(huán)引物lf(序列表的序列23)：aatttatcgaataaaggatttgtat；
環(huán)引物lb(序列表的序列24)：ctcctgaagatggtggcgtt。
用于檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列25)：gacgccaaaattgtccg；
外引物b3(序列表的序列26)：ctcattctgcggtaggtc；
內(nèi)引物fip(序列表的序列27)：tctggaaccagctgtgatcttgcaagcctggcacgggta；
內(nèi)引物bip(序列表的序列28)：gcaaaccgccgcacttacatttcggtgtgtaaccagaaac；
環(huán)引物lf(序列表的序列29)：ctgtagctcgttaaccaaatga；
環(huán)引物lb(序列表的序列30)：tccattcgccagcagt。
用于檢測(cè)空腸彎曲桿菌的引物組如下(5’→3’)：
外引物f3(序列表的序列31)：ttcagcgattaatatcttgctta；
外引物b3(序列表的序列32)：cttttgaaaactctaggagtcat；
內(nèi)引物fip(序列表的序列33)：gcccttcaagtgttgagaacatatagagtcagcttcgcgagag；
內(nèi)引物bip(序列表的序列34)：tagcacactttacagattggattccagtcataaatcctacccaaccta；
環(huán)引物lf(序列表的序列35)：gaaagttgatgccaaaatcataa；
環(huán)引物lb(序列表的序列36)：aggacatgttcatgatgga。
用于檢測(cè)阪崎腸桿菌的引物組命名為引物組ⅰ。用于檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的引物組命名為引物組ⅱ。用于檢測(cè)志賀氏菌的引物組命名為引物組ⅲ。用于檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的引物組命名為引物組ⅳ。用于檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的引物組命名為引物組ⅴ。用于檢測(cè)空腸彎曲桿菌的引物組命名為引物組ⅵ。
實(shí)施例2、特異性
待測(cè)菌分別為：
阪崎腸桿菌(enterobactersakazakii)，cicc編號(hào)為21560；
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica)，atcc編號(hào)為23715；
志賀氏菌(shigellaflexneri)，atcc編號(hào)為12022；
蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)，atcc編號(hào)為11778；
創(chuàng)傷弧菌(vibriovulnificus)，atcc編號(hào)為27562；
空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)，atcc編號(hào)為33291。
1、提取待測(cè)菌的基因組dna。
2、以步驟1提取的基因組dna為模板，分別采用實(shí)施例1制備的各個(gè)引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。
反應(yīng)體系(10μl)：7.0μl反應(yīng)液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為cp.440020)、1μl引物混合物和50pg-50ng模板dna，補(bǔ)水至10μl。引物混合物即引物組中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物f3和外引物b3的終濃度均為0.5μm，內(nèi) 引物fip和內(nèi)引物bip的終濃度均為2μm，環(huán)引物lf和環(huán)引物lb的終濃度均為1μm。
反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。
反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光pcr儀檢測(cè)熒光信號(hào)。
采用引物組ⅰ的結(jié)果見(jiàn)圖1。只有當(dāng)待測(cè)菌為阪崎腸桿菌的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)待測(cè)菌為阪崎腸桿菌以外的其它五種菌的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。
采用引物組ⅱ的結(jié)果見(jiàn)圖2。只有當(dāng)待測(cè)菌為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)待測(cè)菌為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌以外的其它五種菌的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。
采用引物組ⅲ的結(jié)果見(jiàn)圖3。只有當(dāng)待測(cè)菌為志賀氏菌的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)待測(cè)菌為志賀氏菌以外的其它五種菌的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。
采用引物組ⅳ的結(jié)果見(jiàn)圖4。只有當(dāng)待測(cè)菌為蠟樣芽孢桿菌的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)待測(cè)菌為蠟樣芽孢桿菌以外的其它五種菌的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。
采用引物組ⅴ的結(jié)果見(jiàn)圖5。只有當(dāng)待測(cè)菌為創(chuàng)傷弧菌的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)待測(cè)菌為創(chuàng)傷弧菌以外的其它五種菌的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。
采用引物組ⅵ的結(jié)果見(jiàn)圖6。只有當(dāng)待測(cè)菌為空腸彎曲桿菌的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)待測(cè)菌為空腸彎曲桿菌以外的其它五種菌的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。
以上結(jié)果表明，本發(fā)明提供的六個(gè)引物組分別對(duì)其靶標(biāo)菌具有很高的特異性。
實(shí)施例3、靈敏度結(jié)果
待測(cè)菌分別為：
阪崎腸桿菌(enterobactersakazakii)，cicc編號(hào)為21560；
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica)，atcc編號(hào)為23715；
志賀氏菌(shigellaflexneri)，atcc編號(hào)為12022；
蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)，atcc編號(hào)為11778；
創(chuàng)傷弧菌(vibriovulnificus)，atcc編號(hào)為27562；
空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)，atcc編號(hào)為33291。
一、引物組ⅰ檢測(cè)阪崎腸桿菌的靈敏度
1、提取阪崎腸桿菌的基因組dna。
2、以步驟1提取的基因組dna為模板，采用實(shí)施例1制備的引物組ⅰ進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。
反應(yīng)體系(10μl)：7.0μl反應(yīng)液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為cp.440020)、1μl引物混合物和模板dna，補(bǔ)水至10μl。引物混合物即引物組中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物f3和外引物b3的濃度均為0.5μm，內(nèi)引物fip和內(nèi)引物bip的濃度均為2μm，環(huán)引物lf和環(huán)引物lb的濃度均為1μm。反應(yīng)體系中，模板dna的含量為10、102、103、104或105個(gè)拷貝數(shù)。
反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。
反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光pcr儀檢測(cè)熒光信號(hào)。
結(jié)果表明，引物組ⅰ檢測(cè)阪崎腸桿菌的靈敏度為103個(gè)拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
二、引物組ⅱ檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的靈敏度
用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌代替阪崎腸桿菌，用引物組ⅱ代替引物組ⅰ，其他同步驟一。
結(jié)果表明，引物組ⅱ檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的靈敏度為103個(gè)拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
三、引物組ⅲ檢測(cè)志賀氏菌的靈敏度
用志賀氏菌代替阪崎腸桿菌，用引物組ⅲ代替引物組ⅰ，其他同步驟一。
結(jié)果表明，引物組ⅲ檢測(cè)志賀氏菌的靈敏度為103個(gè)拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
四、引物組ⅳ檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的靈敏度
用蠟樣芽孢桿菌代替阪崎腸桿菌，用引物組ⅳ代替引物組ⅰ，其他同步驟一。
結(jié)果表明，引物組ⅳ檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的靈敏度為103個(gè)拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
五、引物組ⅴ檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的靈敏度
用創(chuàng)傷弧菌代替阪崎腸桿菌，用引物組ⅴ代替引物組ⅰ，其他同步驟一。
結(jié)果表明，引物組ⅴ檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的靈敏度為103個(gè)拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
六、引物組ⅵ檢測(cè)空腸彎曲桿菌的靈敏度
用空腸彎曲桿菌代替阪崎腸桿菌，用引物組ⅵ代替引物組ⅰ，其他同步驟一。
結(jié)果表明，引物組ⅵ檢測(cè)空腸彎曲桿菌的靈敏度為103個(gè)拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。
實(shí)施例4、應(yīng)用
待測(cè)樣本為如下樣本一、樣本二或樣本三：
樣本一：已通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定確認(rèn)含有阪崎腸桿菌的牛奶；
樣本二：已通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定確認(rèn)含有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的生鮮豬肉；
樣本三：已通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定確認(rèn)含有志賀氏菌的熟食醬牛肉。
1、提取待測(cè)樣本的總dna。
2、以步驟1提取的總dna為模板，分別采用實(shí)施例1制備的各個(gè)引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。
反應(yīng)體系(10μl)：7.0μl反應(yīng)液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為cp.440020)、1μl引物混合物和50ng模板dna，補(bǔ)水至10μl。引物混合物即引物組中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物f3和外引物b3的終濃度均為0.5μm，內(nèi)引物fip和內(nèi)引物bip的終濃度均為2μm，環(huán)引物lf和環(huán)引物lb的終濃度均為1μm。
反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。
反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光pcr儀檢測(cè)熒光信號(hào)。
樣本一的結(jié)果見(jiàn)圖7。只有采用引物組ⅰ的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)采用引物組ⅰ以外的其它五個(gè)引物組的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。
樣本二的結(jié)果見(jiàn)圖8。只有采用引物組ⅱ的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)采用引物組ⅱ以外的其它五個(gè)引物組的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。
樣本三的結(jié)果見(jiàn)圖9。只有采用引物組ⅲ的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。當(dāng)采用引物組ⅲ以外的其它五個(gè)引物組的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)。
以上結(jié)果表明，利用本發(fā)明提供的引物組合進(jìn)行6種常見(jiàn)食品致病菌的檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。